Ved denne metode dyrkes humane primære muskelceller in vitro for at opnå differentierede myotuber, og glukoseoptagelseshastigheder måles. Vi giver en detaljeret protokol til kvantificering af satser i basale og insulinstimulerede tilstande ved brug af radioaktivt mærket [3H] 2-deoxy-D-glucose.
Skeletmuskulatur er den største glukosepapir hos pattedyr og bidrager i vid udstrækning til glucosehomeostase. Vurdering af insulinfølsomhed i muskelceller er af stor betydning for alle undersøgelser dedikeret til at udforske muskel glucose metabolisme og karakteriserende metaboliske ændringer. I muskelceller translaterer glucosetransportør type 4 (GLUT4) proteiner til plasmamembranen som reaktion på insulin, hvilket tillader massiv indtræden af glucose i cellen. Muskelcellernes evne til at reagere på insulin ved at øge graden af glukoseoptagelse er en af standardudlæsningerne for at kvantificere muskelcellefølsomhed overfor insulin. Humane primære myotuber er en egnet in vitro- model, da cellerne opretholder mange funktioner i donorfænotypen, herunder insulinfølsomhed. Denne in vitro- model er også velegnet til test af forbindelser, der kan påvirke insulinresponsiviteten. Målinger af glukoseoptagelseshastigheden i differentierede myotubes afspejlerInsulinfølsomhed.
Ved denne metode dyrkes humane primære muskelceller in vitro for at opnå differentierede myotuber, og glukoseoptagelseshastigheder med og uden insulinstimulering måles. Vi giver en detaljeret protokol til kvantificering af passive og aktive glucosetransporthastigheder ved brug af radioaktivt mærket [3H] 2-deoxy-D-glucose ([ 3 H] 2dG). Beregningsmetoder tilvejebringes for at kvantificere aktive basale og insulinstimulerede satser, såvel som stimuleringsfold.
Skeletmuskulatur er den største glukosepapir hos pattedyr og bidrager i vid udstrækning til glucosehomeostase. Dette insulinresponsive væv er det primære sted for glukoseoptagelsen, der udløses af insulinstimulering 1 .
I type 2 diabetes observeres insulinresistens i flere væv, herunder skeletmuskel, og fører til over normal blodglukosekoncentration. Det er således af stor betydning at bestemme niveauet af insulinfølsomhed i dette væv og dets celler, hvad enten målet er at karakterisere en defekt i et individ eller at vurdere effektiviteten af en behandling, der har til formål at forbedre den. Hos mennesker eller dyr er guldstandardteknikken til at vurdere insulinfølsomhed den hyperinsulinemiske-euglykæmiske klemme. Indført af DeFronzo i 1979 2 og modificeret siden 3 , 4, så tillader metoden at kvantificere hele kroppen aNd væv insulinresponsivitet målt som den mængde glucose, der skal perfuseres under insulinstimulering for at opretholde normal blodglukosekoncentration.
Insulinsensitivitetsudforskning kan også udføres på celleplan ved hjælp af in vitro muskelmodeller, og måling af glucoseoptagelseshastigheder forbliver et effektivt og pålideligt værktøj til kvantificering af cellens biologiske respons til insulinstimulering 5 , 6 , 7 . Faktisk kvantificerer glukoseoptagsmåling det cellebiologiske respons på insulinstimulering fra bindingen af insulin til dets receptor til translokation af GLUT4 berigede vesikler og inklusiv intracellulære signal- og fosforyleringskaskader 8 .
Dette er af stor interesse med humane prøver, da differentierede myotubes opretholder mange træk af donorfænotypen, herunder metabolisk egenskabIer og lidelser observeret i patienten 9 , 10 , 11 , 12 . Myotuberne viser strukturelle, metaboliske og fænotypiske ligheder med skelettmuskel 13 , 14 , herunder ekspressionen af glucosetransportere 15 og det cellulære insulin-signaleringsmaskineri 16 . Måling af glukoseoptagelsen i primære myotuber er således relevant for at karakterisere en donors muskelfænotype eller undersøge effekten af en intervention (medicin, ernæring eller fysisk aktivitet) på insulinfølsomheden i muskelcellen.
Måling af glukoseoptagelse på dyrkede myotubes er også et pålideligt værktøj ved udførelse af forsøg, der ændrer insulinfølsomheden 17 , 18 . In vitro </Em> -modellen er egnet til test af forbindelser, som kan forbedre insulinresponsen eller kunne forhindre eller reversere erhvervet eller induceret insulinresistens 19 , 20 , 21 , 22 , 23 .
Her beskriver vi en detaljeret protokol til kultur og differentierer humane myotubes og måler celle glukose optagelseshastigheder. Metoden er anvendelig for enhver kilde til menneskelige muskelprecursorceller, uanset om de kommer fra in-lab-præparater, samarbejde eller kommercielt tilgængelige leverandører. Immortaliserede muskelcellelinjer, som henholdsvis C2C12 og L6, fra henholdsvis mus og rotte, kan også anvendes til glukosoptagsmåling med denne protokol 7 .
Vi giver en detaljeret protokol til kvantificering af satser i basale og insulinstimulerede tilstande ved brug af radiomærkede [ 3 H] 2dG. THan bruger en mærket glucoseanalog giver mulighed for nøjagtig bestemmelse af glucoseindgang med reduceret udgangsmateriale, en fælles tilstand, når man arbejder med primære celler. Det modificerede glucosemolekyle er ude af stand til at komme ind i metaboliske veje og akkumuleres således i cellen, hvilket tillader pålidelig kvantificering via total celleradioaktivitet. Eksperimentelle tilstande omfatter anvendelse af en glukose transportinhibitor (cytochalasin B), og målinger udføres med og uden insulin. Denne kombination gør det muligt at bestemme glukose aktive indtastningsfrekvenser samt beregning af foldeskift for insulinresponsindekset. Metoden præsenteres med en dosis insulin under en enkelt inkubationstid, men protokollen kan let modificeres til dosisrespons eller tidskursforsøg 12 .
Glukoseoptagelse er en vigtig biologisk måling til testning af aktivatorer eller inhibitorer på cellekultur og hvordan de påvirker glukoseanvendelsen og cellens evne til at reagere på insulin. Den her beskrevne metode har vist sig at være hurtig og pålidelig og har været udbredt i mange undersøgelser ved anvendelse af primære myotuber fra raske forsøgspersoner og / eller metabolisk ramte patienter 6 , 7 , 10 ,</s…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne anerkender Anne Charrié på Radiobiology-tjenesten (Lyon-Sud hospitalet) og Fond National Suisse (FNS) for deres økonomiske støtte.
Human primary muscle cell | In house preparation from human skeletal muscle biopsies | In house preparation from human skeletal muscle biopsies | If not available, use commercial source |
Human primary muscle cell | Promocell | C-12530 | Should be cultured with associated media C23060 and C23061 |
6-well plate | Corning | 356400 | BioCoat Collagen I Multiwell Plates |
Ham's F10 | Dutscher | L0145-500 | 1 g/l glucose |
Glutamine | Dutscher | X0551-100 | |
penicilin/streptomycin 100x | Thermo fisher scientific | 15140122 | |
Serum substitute UltroserG | Pall France | 15950.017 | serum substitute in text |
DMEM low glucose | Dutscher | L0064-500 | 1 g/l glucose |
Fetal Calf Serum | Eurobio | CVFSVF00-01 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Dutscher | L0625-500 | Contains Mg2+ (0.5 mM) and Ca2+ (0.9 mM) |
Insulin solution human | Sigma-Aldrich | I9278 | |
2-deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich | D6134 | |
Albumin bovine | euromedex | 04-100-812-E | |
fatty acid-free BSA | Roche | 10,775,835,001 | |
palmitate | Sigma-Aldrich | P0500 | |
Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)] | PerkinElmer | NET328A001MC | Specific Activity: 5-10Ci (185-370GBq)/mmol, 1mCi (37MBq |
Cytochalasin B | Sigma-Aldrich | c2743 | |
PICO PRIAS VIAL 6ml | PerkinElmer | 6000192 | |
ultima gold MW CA | PerkinElmer | 6013159 | scintillation liquid |
bêta counter | PerkinElmer | 2900TR |