Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

قياس امتصاص الجلوكوز والاستجابة لتحفيز الأنسولين في doi: 10.3791/55743 Published: June 25, 2017

Summary

في هذه الطريقة، يتم استزراع خلايا العضلات الأولية الإنسان في المختبر للحصول على ميوتوبيس متباينة ويتم قياس معدلات امتصاص الجلوكوز. نحن نقدم بروتوكول مفصل لتحديد معدلات في الدول القاعدية وحفز الأنسولين باستخدام راديولبلد [ 3 H] 2-ديوكسي- D- الجلوكوز.

Abstract

العضلات الهيكلية هي أكبر إيداع الجلوكوز في الثدييات ويسهم إلى حد كبير في التوازن الجلوكوز. تقييم حساسية الأنسولين من خلايا العضلات ذات أهمية كبيرة لجميع الدراسات المخصصة لاستكشاف التمثيل الغذائي الجلوكوز في العضلات وتوصيف التعديلات الأيضية. في خلايا العضلات، نقل الجلوكوز نوع 4 (GLUT4) البروتينات ترانزلاتيون إلى غشاء البلازما ردا على الأنسولين، مما يسمح دخول كميات كبيرة من الجلوكوز في الخلية. قدرة خلايا العضلات على الاستجابة للأنسولين عن طريق زيادة معدل امتصاص الجلوكوز هي واحدة من قراءات القياسية لقياس حساسية الخلايا العضلية للأنسولين. ميوتوبيس الإنسان الأولية هي مناسبة في نموذج المختبر ، كما تحافظ الخلايا على العديد من الميزات من النمط الظاهري المانحة، بما في ذلك حساسية الأنسولين. هذا النموذج في المختبر هو أيضا مناسبة لاختبار أي المركبات التي يمكن أن تؤثر على استجابة الأنسولين. قياسات معدل امتصاص الجلوكوز في ميوتوبيس متباينة تعكسحساسية الأنسولين.

في هذه الطريقة، يتم استزراع خلايا العضلات الأولية في المختبر للحصول على ميوتوبيس متباينة، ويتم قياس معدلات امتصاص الجلوكوز مع وبدون التحفيز الأنسولين. نحن نقدم بروتوكول مفصل لتحديد معدلات انتقال الجلوكوز السلبي والنشط باستخدام راديولبلد [ 3 H] 2-ديوكسي- D- الجلوكوز ([ 3 H] 2dG). يتم توفير طرق الحساب لتحديد معدل نشط القاعدية والأنسولين المحفزة، وكذلك تحفيز أضعاف.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

العضلات الهيكلية هي أكبر إيداع الجلوكوز في الثدييات ويسهم إلى حد كبير في التوازن الجلوكوز. هذا الانسولين استجابة النسيج هو الموقع الرئيسي للامتصاص الجلوكوز التي يتم تشغيلها من قبل التحفيز الأنسولين 1 .

في مرض السكري من النوع 2، لوحظ مقاومة الأنسولين في عدة أنسجة، بما في ذلك العضلات والهيكل العظمي، ويؤدي إلى تركيز السكر في الدم الطبيعي. وبالتالي، فمن الأهمية بمكان لتحديد مستوى حساسية الانسولين من هذا النسيج وخلاياه، سواء كان الهدف هو وصف عيب في الموضوع، أو لتقييم كفاءة العلاج الذي يهدف إلى تحسينه. في المواضيع البشرية أو الحيوانية، تقنية الذهب القياسية لتقييم حساسية الأنسولين هو المشبك فرط الإنسولين-سكر الدم. مقدمة من قبل ديفرونزو في عام 1979 2 وتعديلها منذ 3 ، 4 ثم، طريقة تسمح لتحديد الجسم كله أأنسجة الاستجابة الانسولين قياسها كما معدل الجلوكوز ليكون بيرفوسد تحت التحفيز الأنسولين للحفاظ على تركيز السكر في الدم الطبيعي.

ويمكن أيضا أن تنجز حساسية حساسية الأنسولين على مستوى الخلية باستخدام نماذج العضلات في المختبر ، وقياس معدلات امتصاص الجلوكوز يبقى أداة فعالة وموثوق بها لقياس الاستجابة البيولوجية للخلية لتحفيز الأنسولين 5 ، 6 ، 7 . في الواقع، قياس امتصاص الجلوكوز يحد من الاستجابة البيولوجية الخلية لتحفيز الأنسولين، من ربط الأنسولين لمستقبله إلى نقل الحويصلات المخصبة GLUT4، بما في ذلك إشارات الخلايا والتسلسل الفسفرة 8 .

هذا هو ذات أهمية كبيرة مع العينات البشرية، كما ميوتوبيس متباينة الحفاظ على العديد من الميزات من النمط الظاهري المانحة، بما في ذلك فتحة التمثيل الغذائيوالاضطرابات التي لوحظت في المريض 9 ، 10 ، 11 ، 12 . ميوتوبيس يعرض التشابه الهيكلي والتمثيل الغذائي والمظاهر الظاهرية للعضلات الهيكل العظمي 13 ، 14 ، بما في ذلك التعبير عن ناقلات الجلوكوز 15 وآلات الإشارات الأنسولين الخلوية 16 . وبالتالي، قياس امتصاص الجلوكوز في ميوتوبيس الابتدائي هو ذات الصلة لوصف النمط الظاهري العضلات من المانحين، أو التحقيق في تأثير التدخل (المخدرات، والتغذية، أو النشاط البدني) على حساسية الأنسولين في خلايا العضلات.

قياس امتصاص الجلوكوز على ميوتوبيس مثقف أيضا هو أداة موثوق بها عند إجراء التجارب التي تعدل حساسية الأنسولين 17 ، 18 . في المختبر 19 ، 20 ، 21 ، 22 ، 23 .

نحن هنا وصف بروتوكول مفصل للثقافة والتمييز ميوتوبيس الإنسان وقياس معدلات امتصاص الجلوكوز الخلية. وتنطبق هذه الطريقة على أي مصدر من خلايا السلائف العضلية البشرية، سواء أكانت من مستحضرات التحضير للمختبر أو التعاون أو الموردين المتاحين تجاريا. خلد خلايا الخلايا العضلية، مثل C2C12 و L6، على التوالي من الماوس وأصل الفئران، ويمكن أيضا أن تستخدم لقياس امتصاص الجلوكوز مع هذا البروتوكول 7 .

نحن نقدم بروتوكول مفصل لتحديد معدلات في الدول القاعدية وحفز الأنسولين باستخدام راديولبلد [ 3 H] 2dG. تيانه استخدام التناظرية الجلوكوز وصفت يسمح تحديد دقيق من دخول الجلوكوز مع انخفاض المواد بدءا، وهو شرط شائع عند العمل مع الخلايا الأولية. جزيء الجلوكوز المعدل غير قادر على دخول مسارات التمثيل الغذائي، وبالتالي، يتراكم داخل الخلية، مما يسمح الكمي موثوق بها عن طريق النشاط الإشعاعي الكلي الخلية. وتشمل الظروف التجريبية استخدام مثبط نقل الجلوكوز (السيتوكالاسين B)، ويتم إجراء القياسات مع وبدون الأنسولين. هذا الجمع يسمح لتحديد معدلات دخول نشطة الجلوكوز، فضلا عن حساب تغيير أضعاف لمؤشر استجابة الأنسولين. يتم تقديم طريقة مع جرعة واحدة من الأنسولين خلال فترة حضانة واحدة، ولكن يمكن بسهولة تعديل البروتوكول لاستجابة الجرعة أو الوقت التجارب بالطبع 12 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. إعداد ثقافة الخلية وسائل الإعلام والحلول

  1. إعداد وسائل الإعلام الثقافية
    1. إعداد وسط التكاثر (بيإم) عن طريق تكملة المتوسط ​​F-10 هام مع الجلوتامين (2 ملم) والبنسلين / الستربتومايسين (5 ميكروغرام / مل النهائي)، 2٪ مصل عجل الجنين (فس) و 2٪ مصل بديل.
    2. إعداد وسط التمايز (دم) من خلال استكمال دولبيكو تعديل النسر المتوسطة (دمم) مع الجلوتامين (2 ملم) والبنسلين / الستربتومايسين (5 ميكروغرام / مل النهائي)، و 2٪ فس.
  2. إعداد حلول امتصاص الجلوكوز
    تنبیھ: یسمح بالتعامل مع المواد المشعة فقط في منطقة مقیدة ومراقب ة من قبل موظفین معتمدین. ويجب التعامل مع المواد والنفايات وفقا للإجراءات والمبادئ التوجيهية والتشريعات المحلية المناسبة.
    1. لإعداد X- دولبيكو الفوسفات مخزنة المالحة (X-دبس)، وجعل حل دبس تحتوي على 0.2٪ (ث / ت) (التركيز النهائي) البقري مصل المصلأومين (بسا). تصفية الحل من خلال مرشح 0.2 ميكرون. تخزين في 4 درجات مئوية.
    2. لإعداد الباردة 2-ديوكسي- D- الجلوكوز (2dG) حل، تزن 16.4 ملغ من 2dG وذوبان في 10 مل من الماء المقطر للحصول على حل 10 ملم. تخزين في 4 درجات مئوية.
    3. إضافة 600 ميكرولتر من 2DG الباردة و 6 ميكرولتر من راديولبلد [ 3 H] 2dG إلى 5400 ميكرولتر من X-دبس للحصول على 2dG 2dG * راديولبلد حل.
      ملاحظة: التركيز النهائي هو 1 ملم 2dG ووضع العلامات هو 1 μCi / مل.
      1. جانبا قسامة 20 ميكرولتر (TC20) من راديولبلد 2dG * الحل.
  3. إعداد مخاليط الحضانة
    1. لخليط السيتوكالاسين ب، إضافة 2 ميكرولتر من 20 ملي سيتوكالاسين B إلى 2 مل من راديولبلد 2dG * الحل.
      ملاحظة: حل المخزون من سيتوشالاسين B هو في 10 ملغ / مل في سلفوكسيد ثنائي ميثيل (دمسو).
    2. لخليط دمسو، إضافة 4 ميكرولتر من دمسو إلى 4 مل المتبقية من الحل 2dG * راديولبلد.

    2. ثقافة خلايا العضلات الأولية الإنسان

    1. بذر 6 لوحات جيدا مع خلايا الأقمار الصناعية العضلات البشرية
      ملاحظة: استخدام في المنزل (انظر المرجع 24 لمزيد من التفاصيل) أو الخلايا المتاحة من الخلايا البشرية العضلات المتاحة تجاريا من قارورة مجمدة (تحتوي على 250،000 خلية). يتم إعطاء الإجراء التالي ل 250،000 الخلايا من أجل الحصول على لوحة واحدة 6 جيدا اللازمة لقياس امتصاص الجلوكوز في حالة واحدة.
      1. تذوب بسرعة قوارير الجليد المجمدة في المنزل 24 أو الاستعدادات التجارية من خلايا الأقمار الصناعية العضلات البشرية في الماء قبل تحسنت (37 درجة مئوية) حتى يبقى سوى كتلة الجليد الصغيرة في القارورة.
      2. صب مباشرة في أنبوب بلاستيكي 50 مل تحتوي على 10 مل من قبل تحسنت (37 درجة مئوية) بيإم.
      3. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 500 x ج وتجاهل طاف.
      4. ريسوسبيند بلطف بيليه الخلية مع 18 مل من قبل تحسنت بيإم (للحصول على 42،000 خلية لكل3 مل من المتوسط). توزيع 3 مل في كل بئر من لوحة 6 جيدا (9.6 سم 2 ).
        ملاحظة: يجب على الآبار الفردية الستة من لوحة لإجراء قياس مكررة من امتصاص الجلوكوز للظروف التالية: تثبيط النقل السلبي (الآبار 1 و 2)، ومعدل القاعدي (الآبار 3 و 4) ومعدل تنشيط الأنسولين (الآبار 5 و 6). كرر ما يصل الى ستة لوحات جيدا كما علاجات متميزة هناك حاجة.
      5. احتضان في ظروف الثقافة القياسية (37 درجة مئوية، 5٪ كو 2 ) حتى تصل الخلايا 90٪ التقاء.
        ملاحظة: تستغرق هذه الخطوة بين 48 - 72 ساعة اعتمادا على دفعة الخلية. لا تغير الوسيط أثناء هذه الخطوة.
    2. تمايز الخلايا العضلية
      1. إزالة بيإم (بعد 48-72 ساعة) واستبدالها مع ما قبل تحسنت دم (3 مل لكل بئر). احتضان عند 37 درجة مئوية، 5٪ كو 2 .
        ملاحظة: يأخذ التمايز خمسة أيام للوصول إلى حالة مستقرة حيث يتم محاذاة الخلايا و بولينوكليتد. عادة، الأساسيميوتوبيس مثقف في 1 غ / L الجلوكوز المتوسطة. لذلك، لتجنب استنزاف الجلوكوز خلال الثقافة، وملء لوحة مع 3 مل المتوسطة لضمان أن الركيزة كافية الجلوكوز متاح للخلايا في كل العصور.
      2. استبدال دم المتوسطة كل يومين.
        ملاحظة: من هذه النقطة، ميوتوبيس مستقرة لمدة تصل إلى 7 أيام دون أي تغيير كبير وقياس امتصاص الجلوكوز يمكن أن يؤديها في أي وقت.
    3. خلايا العضلات العلاج (اختياري)
      ملاحظة: ميوتوبيس الابتدائية يمكن علاجها لعدة أيام للحث على تعديل (اختبار المخدرات، مثبطات / تفعيل مسار الإشارات، وما إلى ذلك ) قبل التحفيز الأنسولين والقياسات امتصاص الجلوكوز. يمكن تقديم خلايا العضلات إلى أي علاج قد يكون له تأثير على حساسية الأنسولين، وقياس امتصاص الجلوكوز سوف يحدد هذا التأثير. على سبيل المثال، حضانة الخلايا العضلية مع بالميتات الأحماض الدهنية المشبعة يعزز مقاومة الانسولين، وعرض الخلايا انخفاض طنسولين حفز امتصاص الجلوكوز.
      1. إعداد 12 مل من دم تستكمل مع 10٪ بسا (الأحماض الدهنية الحرة) و 0.5 مل بالميتات (بالم). إعداد 12 مل من دم تستكمل مع 10٪ بسا (الأحماض الدهنية الحرة) فقط.
      2. إعداد اثنين من 6 لوحات جيدا مع ميوتوبيس الإنسان الأساسية، وثقافتهم كما هو موضح في الأقسام 2.1 و 2.2 (مع 5 أيام من التمايز).
      3. في يوم 5، وغسل كل بئر مع 2 مل من برنامج تلفزيوني. إلى لوحة واحدة، إضافة 2 مل من دم تحتوي على بالم. إلى لوحة أخرى إضافة 2 مل من جيش صرب البوسنة فقط التي تحتوي على دم.
      4. احتضان لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية، 5٪ كو 2 .

    3. تحفيز الأنسولين

    1. غسل متباينة خلايا العضلات مرتين مع 2 مل بس.
    2. إزالة بس بعناية واحتضان مع 3 مل من دم دون فس لمدة 3 ساعات (37 درجة مئوية، 5٪ كو 2 ) لاستنزاف المصل.
    3. استبدال وسائل الإعلام في جميع الآبار مع 3 مل من دم دون فس. إضافة 100 إنسولين الأنسولين إلى الآبار 5 و 6.
    4. احتضان ثقافة ميوتوبيس الإنسان ل1 ساعة (37 درجة مئوية، 5٪ كو 2 ).

    4. امتصاص الجلوكوز

    1. بعد 1 ساعة من التحفيز الأنسولين، وغسل الآبار مرتين مع X-دبس (1 مل لكل غسل).
    2. إضافة 1 مل من سيتوشالاسين ب خليط إلى الآبار 1 و 2، و 1 مل من خليط دمسو إلى الآبار 3 - 6. احتضان لمدة 15 دقيقة (37 درجة مئوية، 5٪ كو 2 ). في نهاية الحضانة، وضع على الفور لوحة على الجليد.

    5. خلية تحلل

    1. غسل الخلايا مرتين مع 1 مل من الجليد الباردة بس.
    2. ليس الخلايا في كل بئر مع 600 ميكرولتر من 50 ملي هيدروكسيد الصوديوم. احتضان على الجليد لمدة 5 دقائق وتخلط بلطف مع دوران المداري بطيئة.
      ملاحظة: إذا المحللة هو لزج جدا، تمييع مع ما يصل إلى 1.5 مل هيدروكسيد الصوديوم.
    3. باستخدام ماصة، ريسوسبيند وجمع المحللة الخلية.

    6. تحديد الجلوكوز راديولبلد

    1. وضع 400 ميكرولتر من كل خلية المحللة في زجاجة التلألؤ العد سطوع. إعداد قنينة التحكم السلبية مع 400ميكرولتر من 50 ملم هيدروكسيد الصوديوم، وقارورة مراقبة إيجابية مع 20 ميكرولتر من TC20 (من الخطوة 1.2.3.1).
    2. إضافة 4 مل من محلول التلألؤ السائل لكل قارورة. إغلاق الغطاء وتخلط كل قنينة بدقة (1-2 ثانية).
    3. إدراج كل قارورة في عداد التلألؤ السائل وقياس النشاط الإشعاعي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. سجل التهم في الدقيقة (كيم) لكل قارورة التلألؤ لمدة 10 دقيقة.
      ملاحظة: كيم = "ديسينغراتيونس بير مينوت" x "كونتينغ إفيسيانسي".

    7. معدل امتصاص الجلوكوز

    1. استخدام المحللة المتبقية (200 ميكرولتر، من الخطوة 5.2) لقياس تركيز البروتين. تحديد تركيز البروتين من كل خلية المحللة باستخدام برادفورد 25 أو ما يعادلها الأسلوب. حساب كمية البروتين الكلي (س) في ملغ لكل بئر.
    2. للحصول على TC1 (قيمة 1 ميكرولتر من راديولبلد 2dG *)، قسمة قيمة التكلفة لكل ألف ظهور ل TC20 بحلول 20.
    3. لكل قارورة، وحساب رانه معدل امتصاص الجلوكوز على النحو التالي:
      معادلة
      ملاحظة: يتم قياس R في بمول / مغ / دقيقة. ويعني متوسط ​​R للآبار 1 - 2 معدل النقل السلبي، R p . متوسط ​​R للآبار 3-4 يعطي معدل النقل الكلي القاعدي، R بت . متوسط ​​R للآبار 5-6 يعطي الأنسولين حفز معدل النقل الكلي، R ذلك .
      1. احسب معدل النقل النشط القاعدي (R با ) كما يلي:
        معادلة
      2. حساب الأنسولين حفز معدل النقل النشط (R يا ) على النحو التالي:
        معادلة
        ملاحظة: في الخلايا التي تستجيب الانسولين مثل ميوتوبيس، وعادة ما تمثل معدلات امتصاص الجلوكوز بثلاث قيم: R با ، R يا ، وتحفيز الانسولين أضعاف كما R يا / R با .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

في يوم 3، ميوبلاستس تصل التقاء ( الشكل 1A ). وعادة ما تكون ميوبلاستس في هذه المرحلة أحادي النواة. تم تغيير المتوسطة وفي يوم 8، تم الانتهاء من التمايز ( الشكل 1B ) (بروتوكول القسم 2). بعد 5 أيام من التمايز، يتم محاذاة ميوتوبيس وعادة بولينوكليتد. تعرضت ميوتوبيس الابتدائي البشري إلى بالميتات أو العلاج بسا فقط قبل قياس معدل امتصاص الجلوكوز. تم تحضين الخلايا لمدة 48 ساعة مع بالميتات 0.5 ملي في بسا (بالم) أو بسا وحدها (بسا). تم إجراء التحفيز الأنسولين (القسم بروتوكول 3) وقياس امتصاص الجلوكوز (قسم البروتوكول 4). ويبين الشكل 2 معدل امتصاص الجلوكوز في حالة السيطرة (بسا) وحالة العلاج (بالم). يتم قياس امتصاص غير محدد في ميوتوبيس المحتضنة مع السيتوشالاسين B. القاعدية والأنسولين تحفيز معدلات امتصاص الجلوكوز يمكن مقارنتها في بسا و بال M. الأنسولين يزيد بشكل ملحوظ من انتقال الجلوكوز في حالة بسا (p <0.01). الأنسولين حفز معدل امتصاص الجلوكوز هو أقل بكثير في ميوتوبيس تعامل مع بالم (p <0.05). وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا التعبير عن استجابة الخلية ميوتوب الإنسان للأنسولين كما تغير أضعاف. ويبين الشكل 3 أن الاستجابة للأنسولين انخفض في ميوتوبيس تعامل مع بالم بالمقارنة مع السيطرة (ع <0.05).

على الرغم من محدودية التعبير عن البروتين GLUT4 في ميوتوبيس مثقف، خلايا العضلات الأولية هي قادرة على الاستجابة للأنسولين مع زيادة امتصاص الجلوكوز ( الشكل 2 ). متوسط ​​تغير الطية لوحظ هو ~ 1.3، على غرار ما وصفته مجموعات أخرى مع خلايا العضلات البشرية 6 ، 7 ، 10 ، 26 ،> 27. وعادة ما يوصف تحريض مقاومة الانسولين في خلايا العضلات مع الأحماض الدهنية المشبعة في الفئران، الفئران وخلايا العضلات البشرية، وقد ثبت للحد من امتصاص الجلوكوز من خلايا العضلات المعالجة 28 ، 29 ، 30 ، 31 ، 32 ، 33 ، 34 . أجرينا بالميتات (0.5 ملم) الحضانة لمدة 48 ساعة، ولاحظ انخفاض في معدل القاعدية والأنسولين تنشيط امتصاص الجلوكوز وانخفاض في تغيير أضعاف الأنسولين، مما يعكس حالة مقاومة الأنسولين. تم اختيار الوقت الحضانة المستخدمة في هذه المخطوطة لإظهار تماما تأثير مثبط على امتصاص الجلوكوز. كما يمكن أن تؤدي فترات الحضانة الأقصر أيضا إلى مقاومة الإنسولين وتخفيض امتصاص الجلوكوز 31 ، 32 ، 33 سوب> ، 34 . ويمكن استخدام تركيزات أقل وبالتالي أكثر الفسيولوجية في المختبر ، فضلا عن الاستجابة للجرعة و / أو التجارب بالطبع الوقت، والمقارنة مع تأثير الأحماض الدهنية غير المشبعة مثل أوليات 29 ، 35 .

شكل 1
الشكل 1: في المختبر ميوتوبيس الإنسان الأولية. صور، بسبب، الإنسان، ميوتوبيس، إلى، 2، مراحل، بسبب، استنبات، تم الحصول، الاستعمال، أداة تعريف إنجليزية غير معروفة، بصري، المجهر، نوكأ، شون. ( A ) يوم 3 من ثقافة ميوبلاست عند التقاء. ( B ) في يوم 8 (5 أيام من التمايز)، يتم محاذاة ميوتوبيس. شريط مقياس = 200 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ضمن الصفحات = "1"> الشكل 2
الشكل 2: تأثير تحفيز الأنسولين على معدل امتصاص الجلوكوز في ميوتوبيس الإنسان تحت ظروف بسا و بالم. تم علاج ميوتوبيس مع بسا وحدها أو 0.5 ملي بالم لمدة 48 ساعة. بعد التغير المتوسط ​​و 3 ساعات من استنزاف المصل، تم قياس معدل امتصاص الجلوكوز المحدد (بمول / مغ / مين) في غياب (+) أو في وجود (+) من الأنسولين (1 ساعة، 100 نانومتر). البيانات تعني ± نصف أربعة تجارب مستقلة باستخدام ميوتوبيس من أربعة مانحين مختلفين. #P <0.05 مقارنة مع القيمة القاعدية. * P <0.05 مقارنة مع بسا الأنسولين قيمة التحفيز. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3
الشكل 3: طية طاستجابة نسولين في بسا و بالم الظروف الثقافية. نسبة الأنسولين حفز على معدل نقل الجلوكوز القاعدية في ظروف بسا و بالم. هذه النسبة تعطي معدل امتصاص الجلوكوز طية على التحفيز الأنسولين (100 نانومتر). * P <0.05 بالمقارنة مع حالة بسا (n = 4). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

امتصاص الجلوكوز هو القياس البيولوجي الرئيسي لاختبار المنشطات أو مثبطات على ثقافة الخلية وكيف أنها تؤثر على استخدام الجلوكوز، وقدرة الخلية على الاستجابة للأنسولين. وقد تبين أن الطريقة الموصوفة هنا لتكون سريعة وموثوق بها، وقد استخدمت على نطاق واسع في العديد من الدراسات باستخدام ميوتوبيس الابتدائي من الأشخاص الأصحاء و / أو المرضى الذين يتأثرون الأيض 6 ، 7 ، 10 ، 12 ، 21 ، 26 ، 27 ، 36 ، 37 . مع لوحة واحدة فقط 6 جيدا، ويمكن الحصول على معدلات في المكررة لمجموع النقل القاعدية، النقل النشط القاعدية، وحفز نشط الأنسولين النقل. هذه القيم الثلاثة تصف تماما حساسية الأنسولين من خلايا العضلات المزروعة في المختبر .

سس = "jove_content"> يتم استزراع الخلايا العضلية الأولية بشكل روتيني على لوحات مغلفة بالكولاجين. عند استخدام خطوط الخلايا مثل C2C12 أو L6، لوحات غير المغلفة يمكن استخدامها. لتحقيق أقصى قدر من استجابة الأنسولين، فمن المهم لاستنزاف الأنسولين من خلايا العضلات قبل التحفيز من أجل الحصول على أدنى حالة القاعدية الممكنة. وقت الحضانة 3 ساعة المشار إليها في هذا البروتوكول يمكن تعديلها وفقا لاستقرار الخلية على الانسولين و / أو المجاعة المصل. وتتبع الحضانة 3 ساعات مع الأنسولين حضانة 15 دقيقة مع الجلوكوز راديولبلد. والغرض من الحضانة لمدة ساعة مع الأنسولين هو السماح لنقل أي GLUT4 المتاحة الحويصلات إلى الغشاء من أجل تحقيق أقصى معدل امتصاص الجلوكوز. وأظهرت الاختبارات السابقة أن فترات حضانة أقصر (15 و 30 دقيقة) لم يحقق معدلات القصوى. استمرار التحفيز الأنسولين خلال 15 دقيقة مع راديولبلد 2dG ليست إلزامية لأنها لم تؤثر على القياس (البيانات الشخصية). وعلاوة على ذلك، نفس راديولبلد يمكن إضافة خليط 2dG إلى جميع الآبار التي تم اختبارها. لتحلل الخلية، وحجم هيدروكسيد الصوديوم يمكن تعديلها وفقا لخصائص الخلية. عند العمل مع الخلايا التي تحتوي على مستويات عالية من الأحماض الدهنية أي لزجة جدا لزجة، يمكن زيادة حجم هيدروكسيد الصوديوم تصل إلى 1.5 مل.

وتستخدم هذه الطريقة المواد المشعة الراديوية التي تعزز حساسية القياس، ولكنها تتطلب إجراء البروتوكول في المناطق الخاضعة للرقابة. يجب معالجة المواد والنفايات وفقا لإرشادات السلامة المحلية. للمختبرات غير مجهزة، اللونية الأخرى ومضان الكمي 38 طرق المتاحة. في المقايسات غير المشعة، يمكن قياس شدة مضان بعد حضانة الخلايا مع التناظرية D- الجلوكوز التناظرية 2- [ N - (7-نيتروبنز-2-أوكسا-1،3-ديازول -4-يل) الأمينية] - 2-ديوكسي- D- الجلوكوز (2-نبدج). مع هذا التناظرية، ذكرت بعض المجموعات أن الأنسولين فقدت آثاره الفسيولوجية في الخلايا L6أس = "كريف"> 39، في حين أظهرت مجموعات أخرى أن الأنسولين لا يزال يزيد من امتصاص الجلوكوز (في خلايا العضلات الأولية للبشر) 38 . بسبب انخفاض التعبير GLUT4، يتم تخفيض الكمي للأنسولين حفز امتصاص الجلوكوز في خلايا العضلات المستزرعة بالمقارنة مع في ظروف الجسم الحي 6 ، 16 . وبالتالي من المهم زيادة وصف الاستجابة الأنسولين من خلايا العضلات المستزرعة من خلال نهج أخرى. ويمكن استخدام قياسات حالة الفسفرة للبروتينات الرئيسية لمسار الإشارة الأنسولين (مثل أكت / يب و / أو GSK3) باستخدام الكشف المناعي 14 ، 21 ، 31 . على المستوى الأنزيمي، يمكن أيضا تقييم توليف الجليكوجين، الجلوكوز و / أو أكسدة الدهون في ظروف مع وبدون الانسولين 14 ، 26 ، 31 . أي سيل أخرى ل (سواء كان يستجيب للأنسولين أم لا) يمكن تحليلها نظريا كما يمكن لجميع الخلايا بنشاط أو سلبي امتصاص الجلوكوز. وبالتالي يمكن استبدال الآبار المحفزة بالأنسولين بأي علاج مناسب آخر.

استخدام ميوتوب الابتدائي البشري يعني أن الخلايا العضلية وصلت إلى حالة التمايز بما يتفق مع ما يكفي من التعبير عن البروتين GLUT4. إذا كان إعداد يحتوي على خلايا غير عضلية أو ميوبلاستس أساسا، وقيم امتصاص الجلوكوز في حالة التحفيز الأنسولين لا تختلف عن الحالة القاعدية (R يا مقابل R با )، ويرجع ذلك أساسا إلى غلبة الناقل GLUT1.

الأنسولين يمكن أن تضاف إلى العضلات الأساسية خلية ثقافة المتوسطة لتعزيز وتعزيز تكاثر الخلايا العضلية والتمايز. ومع ذلك، وقد ثبت أيضا أن الأنسولين للحث على مقاومة الانسولين في التحفيز المزمن 40 ، 41 ،كلاس = "كريف"> 42. في تجاربنا، خلايا العضلات الأولية الإنسان تفرق بشكل صحيح فقط على التغيير المتوسط ​​مع انخفاض المصل. ولذلك فإننا نفضل عدم إضافة الأنسولين الخارجي أثناء الثقافة للحفاظ على الخلايا من التحفيز المزمن قبل تقييم الاستجابة الانسولين. وأخيرا، يتطلب الأسلوب عدة خطوات الغسيل. لذلك، يجب الحرص على عدم فصل الخلايا من لوحة كما يمكن أن يحدث مع الخلايا الأولية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

يقر المؤلفون آن شاراي في خدمة علم الأحياء الإشعاعية (مستشفى ليون سود) و فوند ناتيونال سويس (فنس) على دعمهم المالي.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human primary muscle cell In house preparation from human skeletal muscle biopsies In house preparation from human skeletal muscle biopsies If not available, use commercial source
Human primary muscle cell Promocell C-12530 Should be cultured with associated media C23060 and C23061
6-well plate Corning 356400 BioCoat Collagen I Multiwell Plates
Ham's F10 Dutscher L0145-500 1 g/L glucose
Glutamine Dutscher X0551-100
penicilin/streptomycin 100x Thermo fisher scientific 15140122
Serum substitute UltroserG Pall France 15950.017 serum substitute in text
DMEM low glucose Dutscher L0064-500 1 g/L glucose
Fetal Calf Serum Eurobio CVFSVF00-01
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Dutscher L0625-500 Contains Mg2+ (0.5 mM) and Ca2+ (0.9 mM)
Insulin solution human Sigma-Aldrich I9278
2-deoxy-D-glucose  Sigma-Aldrich D6134
Albumin bovine euromedex 04-100-812-E
fatty acid-free BSA Roche 10,775,835,001
palmitate Sigma-Aldrich P0500
Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)] PerkinElmer NET328A001MC Specific Activity: 5 - 10 Ci (185-370GBq)/mmol, 1 mCi (37MBq
Cytochalasin B Sigma-Aldrich c2743
PICO PRIAS VIAL 6 mL PerkinElmer 6000192
ultima gold MW CA  PerkinElmer 6013159 scintillation liquid
bêta counter  PerkinElmer 2900TR

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stump, C. S., Henriksen, E. J., Wei, Y., Sowers, J. R. The metabolic syndrome: role of skeletal muscle metabolism. Ann Med. 38, (6), 389-402 (2006).
  2. DeFronzo, R. A., Tobin, J. D., Andres, R. Glucose clamp technique: a method for quantifying insulin secretion and resistance. Am J Physiol. 237, (3), E214-E223 (1979).
  3. Fossum, E., Hoieggen, A., Moan, A., Nordby, G., Kjeldsen, S. E. Insulin sensitivity relates to other cardiovascular risk factors in young men: validation of some modifications of the hyperinsulinaemic, isoglycaemic glucose clamp technique. Blood Press Suppl. 2, 113-119 (1997).
  4. Heise, T., et al. Euglycaemic glucose clamp: what it can and cannot do, and how to do it. Diabetes Obes Metab. 18, (10), 962-972 (2016).
  5. Sell, H., Jensen, J., Eckel, J. Measurement of insulin sensitivity in skeletal muscle in vitro. Methods Mol Biol. 933, 255-263 (2012).
  6. Sarabia, V., Lam, L., Burdett, E., Leiter, L. A., Klip, A. Glucose transport in human skeletal muscle cells in culture. Stimulation by insulin and metformin. J Clin Invest. 90, (4), 1386-1395 (1992).
  7. Sarabia, V., Ramlal, T., Klip, A. Glucose uptake in human and animal muscle cells in culture. Biochem Cell Biol. 68, (2), 536-542 (1990).
  8. Richter, E. A., Hargreaves, M. Exercise, GLUT4, and skeletal muscle glucose uptake. Physiol Rev. 93, (3), 993-1017 (2013).
  9. Gaster, M., Kristensen, S. R., Beck-Nielsen, H., Schroder, H. D. A cellular model system of differentiated human myotubes. Apmis. 109, (11), 735-744 (2001).
  10. Bouzakri, K., et al. Reduced activation of phosphatidylinositol-3 kinase and increased serine 636 phosphorylation of insulin receptor substrate-1 in primary culture of skeletal muscle cells from patients with type 2 diabetes. Diabetes. 52, (6), 1319-1325 (2003).
  11. Scheele, C., et al. Satellite cells derived from obese humans with type 2 diabetes and differentiated into myocytes in vitro exhibit abnormal response to IL-6. PLoS One. 7, (6), e39657 (2012).
  12. Jackson, S., et al. Decreased insulin responsiveness of glucose uptake in cultured human skeletal muscle cells from insulin-resistant nondiabetic relatives of type 2 diabetic families. Diabetes. 49, (7), 1169-1177 (2000).
  13. Aas, V., et al. Are cultured human myotubes far from home? Cell Tissue Res. 354, (3), 671-682 (2013).
  14. Bakke, S. S., et al. Myotubes from severely obese type 2 diabetic subjects accumulate less lipids and show higher lipolytic rate than myotubes from severely obese non-diabetic subjects. PLoS One. 10, (3), e0119556 (2015).
  15. Stuart, C. A., et al. Hexose transporter mRNAs for GLUT4, GLUT5, and GLUT12 predominate in human muscle. Am J Physiol Endocrinol Metab. 291, (5), E1067-E1073 (2006).
  16. Al-Khalili, L., et al. Insulin action in cultured human skeletal muscle cells during differentiation: assessment of cell surface GLUT4 and GLUT1 content. Cell Mol Life Sci. 60, (5), 991-998 (2003).
  17. Tsuka, S., et al. Promotion of insulin-induced glucose uptake in C2C12 myotubes by osteocalcin. Biochem Biophys Res Commun. 459, (3), 437-442 (2015).
  18. Gorbunov, E. A., Nicoll, J., Myslivets, A. A., Kachaeva, E. V., Tarasov, S. A. Subetta Enhances Sensitivity of Human Muscle Cells to Insulin. Bull Exp Biol Med. 159, (4), 463-465 (2015).
  19. Breen, D. M., Sanli, T., Giacca, A., Tsiani, E. Stimulation of muscle cell glucose uptake by resveratrol through sirtuins and AMPK. Biochem Biophys Res Commun. 374, (1), 117-122 (2008).
  20. Pinnamaneni, S. K., Southgate, R. J., Febbraio, M. A., Watt, M. J. Stearoyl CoA desaturase 1 is elevated in obesity but protects against fatty acid-induced skeletal muscle insulin resistance in vitro. Diabetologia. 49, (12), 3027-3037 (2006).
  21. Gastebois, C., et al. Transition from physical activity to inactivity increases skeletal muscle miR-148b content and triggers insulin resistance. Physiol Rep. 4, (17), (2016).
  22. Naimi, M., Tsakiridis, T., Stamatatos, T. C., Alexandropoulos, D. I., Tsiani, E. Increased skeletal muscle glucose uptake by rosemary extract through AMPK activation. Appl Physiol Nutr Metab. 40, (4), 407-413 (2015).
  23. Feng, Y. Z., et al. PPARdelta activation in human myotubes increases mitochondrial fatty acid oxidative capacity and reduces glucose utilization by a switch in substrate preference. Arch Physiol Biochem. 120, (1), 12-21 (2014).
  24. Perrin, L., et al. Human skeletal myotubes display a cell-autonomous circadian clock implicated in basal myokine secretion. Mol Metab. 4, (11), 834-845 (2015).
  25. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  26. Bouzakri, K., et al. Malonyl CoenzymeA decarboxylase regulates lipid and glucose metabolism in human skeletal muscle. Diabetes. 57, (6), 1508-1516 (2008).
  27. Shemyakin, A., et al. Endothelin-1 reduces glucose uptake in human skeletal muscle in vivo and in vitro. Diabetes. 60, (8), 2061-2067 (2011).
  28. Alkhateeb, H., Chabowski, A., Glatz, J. F., Luiken, J. F., Bonen, A. Two phases of palmitate-induced insulin resistance in skeletal muscle: impaired GLUT4 translocation is followed by a reduced GLUT4 intrinsic activity. Am J Physiol Endocrinol Metab. 293, (3), E783-E793 (2007).
  29. Coll, T., et al. Oleate reverses palmitate-induced insulin resistance and inflammation in skeletal muscle cells. J Biol Chem. 283, (17), 11107-11116 (2008).
  30. Gaster, M., Rustan, A. C., Beck-Nielsen, H. Differential utilization of saturated palmitate and unsaturated oleate: evidence from cultured myotubes. Diabetes. 54, (3), 648-656 (2005).
  31. Hage Hassan, R., et al. Endoplasmic reticulum stress does not mediate palmitate-induced insulin resistance in mouse and human muscle cells. Diabetologia. 55, (1), 204-214 (2012).
  32. Haghani, K., Pashaei, S., Vakili, S., Taheripak, G., Bakhtiyari, S. TNF-alpha knockdown alleviates palmitate-induced insulin resistance in C2C12 skeletal muscle cells. Biochem Biophys Res Commun. 460, (4), 977-982 (2015).
  33. Hommelberg, P. P., et al. Palmitate-induced skeletal muscle insulin resistance does not require NF-kappaB activation. Cell Mol Life Sci. 68, (7), 1215-1225 (2011).
  34. Yang, M., et al. Saturated fatty acid palmitate-induced insulin resistance is accompanied with myotube loss and the impaired expression of health benefit myokine genes in C2C12 myotubes. Lipids Health Dis. 12, 104 (2013).
  35. Peng, G., et al. Oleate blocks palmitate-induced abnormal lipid distribution, endoplasmic reticulum expansion and stress, and insulin resistance in skeletal muscle. Endocrinology. 152, (6), 2206-2218 (2011).
  36. Lambernd, S., et al. Contractile activity of human skeletal muscle cells prevents insulin resistance by inhibiting pro-inflammatory signalling pathways. Diabetologia. 55, (4), 1128-1139 (2012).
  37. Nikolic, N., et al. Electrical pulse stimulation of cultured human skeletal muscle cells as an in vitro model of exercise. PLoS One. 7, (3), e33203 (2012).
  38. Hsu, F. L., et al. Antidiabetic effects of pterosin A, a small-molecular-weight natural product, on diabetic mouse models. Diabetes. 62, (2), 628-638 (2013).
  39. Zou, C., Wang, Y., Shen, Z. 2-NBDG as a fluorescent indicator for direct glucose uptake measurement. J Biochem Biophys Methods. 64, (3), 207-215 (2005).
  40. Catalano, K. J., et al. Insulin resistance induced by hyperinsulinemia coincides with a persistent alteration at the insulin receptor tyrosine kinase domain. PLoS One. 9, (9), e108693 (2014).
  41. Liu, H. Y., et al. Insulin is a stronger inducer of insulin resistance than hyperglycemia in mice with type 1 diabetes mellitus (T1DM). J Biol Chem. 284, (40), 27090-27100 (2009).
  42. Renstrom, F., Buren, J., Svensson, M., Eriksson, J. W. Insulin resistance induced by high glucose and high insulin precedes insulin receptor substrate 1 protein depletion in human adipocytes. Metabolism. 56, (2), 190-198 (2007).
قياس امتصاص الجلوكوز والاستجابة لتحفيز الأنسولين في<em&gt; في المختبر</em&gt; مثقف الإنسان ميوتوبيس الابتدائية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chanon, S., Durand, C., Vieille-Marchiset, A., Robert, M., Dibner, C., Simon, C., Lefai, E. Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes. J. Vis. Exp. (124), e55743, doi:10.3791/55743 (2017).More

Chanon, S., Durand, C., Vieille-Marchiset, A., Robert, M., Dibner, C., Simon, C., Lefai, E. Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes. J. Vis. Exp. (124), e55743, doi:10.3791/55743 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter