Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Glucoseopname-meting en respons op insuline stimulatie in doi: 10.3791/55743 Published: June 25, 2017

Summary

Bij deze werkwijze worden humane primaire spiercellen in vitro gekweekt om gedifferentieerde myotubes te verkrijgen en de opname van glucose wordt gemeten. Wij bieden een gedetailleerd protocol om de tarieven in basale en insuline gestimuleerde staten te kwantificeren met radioactief gemerkte [3H] 2-deoxy-D-glucose.

Abstract

Skeletspier is de grootste glucosebepaling bij zoogdieren en draagt ​​bij tot de glucose homeostase. De beoordeling van de insuline gevoeligheid van spiercellen is van groot belang voor alle studies die zijn gericht op het onderzoeken van spierglucose metabolisme en karakteriserende metabolische veranderingen. In spiercellen translateert glucose transporter type 4 (GLUT4) eiwitten naar het plasmamembraan in reactie op insuline, waardoor massale glucose in de cel wordt toegediend. Het vermogen van spiercellen om te reageren op insuline door het verhogen van de snelheid van glucose opname is een van de standaard uitlezingen om de spiercel gevoeligheid voor insuline te kwantificeren. Menselijke primaire myotubes zijn een geschikt in vitro model, omdat de cellen veel eigenschappen van het donorfenotype handhaven, inclusief insuline gevoeligheid. Dit in vitro model is ook geschikt voor de test van verbindingen die de insuline-responsiviteit kunnen beïnvloeden. Metingen van de glucose opname snelheid in gedifferentieerde myotubes weerspiegelenInsuline gevoeligheid.

Bij deze methode worden humane primaire spiercellen in vitro gekweekt om gedifferentieerde myotubes te verkrijgen en de opname van glucose met en zonder insulinerstimulatie worden gemeten. Wij bieden een gedetailleerd protocol om passieve en actieve glucosetransportcijfers te kwantificeren met radioactief gemerkte [3H] 2-deoxy-D-glucose ([ 3 H] 2dG). Berekeningsmethoden worden verstrekt om de actieve basale en insuline gestimuleerde percentages te kwantificeren, evenals stimulatievouw.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Skeletspier is de grootste glucosebepaling bij zoogdieren en draagt ​​bij tot de glucose homeostase. Dit insuline responsieve weefsel is de primaire plaats van de glucose opname die wordt geactiveerd door insuline stimulatie 1 .

Bij type 2 diabetes wordt insuline resistentie waargenomen in verschillende weefsels, inclusief skeletspier, en leidt tot een hogere normale bloedglucoseconcentratie. Zo is het van groot belang om het niveau van de insuline gevoeligheid van dit weefsel en zijn cellen te bepalen, of het doel is om een ​​defect in een vak te karakteriseren of om de efficiëntie van een behandeling te evalueren die van plan is om deze te verbeteren. Bij menselijke of dierlijke onderwerpen is de gouden standaard techniek om insuline gevoeligheid te beoordelen, de hyperinsulinemische-euglycemische klem. In 1979 door DeFronzo geïntroduceerd en gewijzigd sinds 3 , 4 , laat de methode toe om het hele lichaam a te kwantificerenNd weefsels insuline responsiviteit gemeten als de snelheid van glucose te worden geperfuseerd onder insuline stimulatie om de normale bloedglucoseconcentratie te behouden.

Insuline gevoeligheid verkenning kan ook op het celniveau worden uitgevoerd met in vitro spiermodellen, en de meting van glucose opname tarieven blijft een efficiënt en betrouwbaar hulpmiddel om de biologische respons van de cel te kwantificeren naar insuline stimulatie 5 , 6 , 7 . In feite kwantificeert glucose opname meting de celbiologische respons op insuline stimulatie, van de binding van insuline aan de receptor tot translocatie van GLUT4 verrijkte blaasjes, en omvat intracellulaire signalering en fosforylatie cascades 8 .

Dit is van groot belang bij menselijke monsters, aangezien gedifferentieerde myotubes veel eigenschappen van het donorfenotype handhaven, met inbegrip van metabolische eigenschappenZiekten en aandoeningen waargenomen in de patiënt 9 , 10 , 11 , 12 . De myotubes tonen structurele, metabolische en fenotypische overeenkomsten met de skeletspier 13 , 14 , met inbegrip van de expressie van glucosetransporteurs 15 en de cellulaire insulinsignaalmachines 16 . Zo is de meting van de glucoseopname in primaire myotubes van belang voor het karakteriseren van het spierfenotype van een donor of het onderzoek van het effect van een interventie (medicijn, voeding of lichamelijke activiteit) op de insuline gevoeligheid in de spiercel.

De meting van glucoseopname op gekweekte myotubes is ook een betrouwbaar hulpmiddel bij het uitvoeren van experimenten die de gevoeligheid van insuline 17 , 18 wijzigen . De in vitro 19 , 20 , 21 , 22 , 23 kunnen voorkomen of terugkeren.

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor cultuur en differentiëren van menselijke myotubes en het meten van celglucose opname. De methode is van toepassing op elke bron van menselijke spiervoorlopercellen, of ze afkomstig zijn uit in-lab preparaten, samenwerking of commercieel leveranciers. Immortalized spiercellijnen, respectievelijk C2C12 en L6, respectievelijk van oorsprong uit muis en rat, kunnen ook gebruikt worden voor het meten van glucoseopname met dit protocol 7 .

Wij bieden een gedetailleerd protocol om tarieven te berekenen in basale en insuline gestimuleerde staten met radioactief gemerkte [ 3 H] 2dG. THij gebruikt van een gelabelde glucose analoog zorgt voor een nauwkeurige bepaling van de glucose ingang met gereduceerd uitgangsmateriaal, een algemene voorwaarde bij het werken met primaire cellen. Het gemodificeerde glucosemolecuul is niet in staat metabolische wegen in te voeren en verzamelt zich dus binnen de cel, waardoor betrouwbare kwantificering via totale celradioactiviteit mogelijk is. Experimentele condities omvatten het gebruik van een glucosetransportremmer (cytochalasin B), en metingen worden uitgevoerd met en zonder insuline. Deze combinatie maakt het mogelijk de glucose actieve toetredingswaarden vast te stellen, evenals de berekening van de vouwverandering voor de insuline-responsindex. De methode wordt gepresenteerd met één dosis insuline gedurende een enkele incubatietijd, maar het protocol kan gemakkelijk worden aangepast voor dosis respons of tijdschool experimenten 12 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Bereiding van celcultuurmedia en -oplossingen

  1. Bereiding van cultuurmedia
    1. Bereid proliferatiemedium (PM) door Ham's F-10-medium aan te vullen met glutamine (2 mM), penicilline / streptomycine (5 μg / ml finale), 2% foetale kalf serum (FCS) en 2% serum substitutie.
    2. Bereid het differentiatiemedium (DM) door Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met glutamine (2 mM), penicilline / streptomycine (5 μg / mL finale) en 2% FCS aan te vullen.
  2. Bereiding van glucose opname oplossingen
    Let op: Het hanteren van radioactief materiaal is alleen toegestaan ​​in een beperkt en gecontroleerd gebied door geautoriseerd personeel. Materiaal en afval moeten worden behandeld volgens de juiste procedures, richtlijnen en lokale wetgeving.
    1. Om X-Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (X-DPBS) op te maken, maak een oplossing van DPBS die 0,2% (w / v) (eindconcentratie) boviene serum alb bevatUmin (BSA). Filter de oplossing door een 0,2 μm filter. Bewaren bij 4 ° C.
    2. Voor het bereiden van koude 2-deoxy-D-glucose (2dG) oplossing weeg 16,4 mg 2dG en solubiliseer in 10 ml gedestilleerd water om een ​​10 mM oplossing te verkrijgen. Bewaren bij 4 ° C.
    3. Voeg 600 μL koude 2dG en 6 μL radioactief gemerkte [ 3 H] 2dG toe aan 5400 μL X-DPBS om de radioactief gelabelde 2dG (2dG *) oplossing te verkrijgen.
      OPMERKING: De uiteindelijke concentratie is 1 mM 2dG en de etikettering is 1 μCi / mL.
      1. Plaats een 20 μL-aliquot (TC20) van radioactief gelabelde 2dG * oplossing.
  3. Bereiding van incubatiemengsels
    1. Voor het cytochalasin B-mengsel voeg 2 μL 20 mM cytochalasin B toe aan 2 ml radioactief gemerkte 2dG * oplossing.
      OPMERKING: De voorraadoplossing van cytochalasine B is bij 10 mg / ml in dimethylsulfoxide (DMSO).
    2. Voeg voor het DMSO-mengsel 4 μL DMSO toe aan de overige 4 ml radioactief gemerkte 2dG * oplossing.

    2. Cultuur van humane primaire spiercellen

    1. Zaaien van 6-putjesplaten met menselijke spier-satellietcellen
      OPMERKING: Gebruik intern (zie referentie 24 voor details) of commercieel beschikbare menselijke spier satellietcellen uit een bevroren flesje (met 250.000 cellen). De volgende procedure wordt gegeven voor 250.000 cellen teneinde een 6-putjesplaat te verkrijgen die nodig is voor het meten van glucoseopname in één enkele toestand.
      1. Ontdooi diepgevroren flesjes in huis 24 of commerciële preparaten van menselijke spier-satellietcellen in voorverwarmd water (37 ° C) tot er maar een klein ijsblok in de flesje blijft.
      2. Giet direct in een 50 ml plastic buis met 10 ml voorverwarmd (37 ° C) PM.
      3. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 500 xg en gooi de supernatant weg.
      4. Resulteer de celpellet voorzichtig met 18 ml voorverwarmde PM (om 42.000 cellen per te verkrijgen3 ml medium). Verdeel 3 ml in elke putje van een 6-putjesplaat (9,6 cm 2 ).
        OPMERKING: De zes afzonderlijke putjes van een plaat zijn verplicht een duplicaat meting van de opname van glucose voor de volgende omstandigheden te verrichten: passieve transportinhibitie (putten 1 en 2), basale snelheid (putjes 3 en 4) en insuline gestimuleerde snelheid (putten 5 en 6). Herhaal zoveel platen met zes putjes, aangezien verschillende behandelingen nodig zijn.
      5. Incubeer in standaardkweekomstandigheden (37 ° C, 5% CO 2 ) tot cellen 90% samenvloeiing bereiken.
        OPMERKING: Deze stap duurt tussen 48 en 72 uur, afhankelijk van de celbatch. Verander geen medium tijdens deze stap.
    2. Differentiatie van spiercellen
      1. Verwijder de PM (na 48-72 uur) en vervang met voorverwarmd DM (3 ml per putje). Incubeer bij 37 ° C, 5% CO2.
        OPMERKING: Differentiatie duurt vijf dagen om een ​​stabiele toestand te bereiken waarbij cellen op elkaar afgestemd en gepolynucleiseerd zijn. Typisch, de primaireMyotubes worden gekweekt in een 1 g / L glucose medium. Om te voorkomen dat glucose uitputting tijdens de kweek wordt gevuld, vul dan de plaat met 3 ml medium om ervoor te zorgen dat voldoende glucosesubstraat altijd beschikbaar is voor de cellen.
      2. Vervang DM medium om de twee dagen.
        OPMERKING: vanaf dit punt zijn myotubes stabiel gedurende maximaal 7 dagen zonder enige significante verandering en glucose opname meting kan te allen tijde worden uitgevoerd.
    3. Spiercellen behandeling (optioneel)
      OPMERKING: Primaire myotubes kunnen enkele dagen behandeld worden om modificatie teweeg te brengen (geneesmiddeltest, remmers / activators van signaalweg, enz. ) Voor insuline stimulatie en glucose opname metingen. Spiercellen kunnen worden ingediend op elke behandeling die de gevoeligheid van insuline kan beïnvloeden, en de meting van de glucose opname zal deze impact kwantificeren. Bijvoorbeeld, incubatie van spiercellen met het verzadigde vetzuurpalmitaat bevordert de insulineresistentie, en cellen laten verminderd i zienNsulin gestimuleerde glucose opname.
      1. Bereid 12 ml DM aangevuld met 10% BSA (vetzuurvrij) en 0,5 ml palmitaat (PALM). Bereid 12 ml DM aangevuld met 10% BSA (vetzuurvrij) alleen.
      2. Bereid twee 6-putjesplaten met menselijke primaire myotubes op en kweek ze zoals beschreven in secties 2.1 en 2.2 (met 5 dagen differentiatie).
      3. Op dag 5, was elke put met 2 ml PBS. Voeg een 2 ml DM met PALM toe aan één plaat. Aan de andere plaat voegt u 2 ml BSA die alleen DM bevat.
      4. Incubeer gedurende 48 uur bij 37 ° C, 5% CO2.

    3. Insuline Stimulatie

    1. Was gedifferentieerde spiercellen tweemaal met 2 ml PBS.
    2. Verwijder PBS zorgvuldig en incubeer met 3 ml DM zonder FCS gedurende 3 uur (37 ° C, 5% CO2) voor serumuitputting.
    3. Vervang media in alle putten met 3 ml DM zonder FCS. Voeg 100 nM insuline toe aan putten 5 en 6.
    4. Incubeer menselijke myotubes cultuur voor1 uur (37 ° C, 5% CO2).

    4. Glucoseopname

    1. Na 1 uur insuline stimulatie, wassen twee keer met X-DPBS (1 ml per was).
    2. Voeg 1 ml cytochalasin B mengsel toe aan putjes 1 en 2 en 1 ml DMSO mengsel aan putjes 3 - 6. Incubeer gedurende 15 minuten (37 ° C, 5% CO 2 ). Aan het einde van de incubatie plaatst u de bord onmiddellijk op ijs.

    5. Cell Lysis

    1. Was de cellen tweemaal met 1 ml ijskoude PBS.
    2. Licht de cellen in elke put met 600 μl van 50 mM NaOH. Incubeer op ijs gedurende 5 minuten en meng zachtjes met langzame omwenteling.
      OPMERKING: Als het lysaat te viskeus is, verdun met tot 1,5 ml NaOH.
    3. Gebruik een pipet, resuspendeer en verzamel de cellysaat.

    6. Bepaling van radioactief gemerkte glucose

    1. Zet 400 μl van elk cellysaat in een vloeibare scintillatie tellen flesje. Bereid een fles met een minimale controle op met 400ΜL van 50 mM NaOH en een positieve controle fles met 20 μl TC20 (uit stap 1.2.3.1).
    2. Voeg 4 ml vloeibare scintillatieoplossing toe aan elke injectieflacon. Sluit de kap en meng elke injectieflacon grondig (1-2 s).
    3. Plaats elke injectieflacon in een vloeistofscintillatieteller en meet de radioactiviteit volgens de instructies van de fabrikant. Record tellingen per minuut (CPM) voor elke scintillatie flesje gedurende 10 minuten.
      OPMERKING: CPM = "disintegraties per minuut" x "tellen efficiëntie".

    7. Glucosestroomopname

    1. Gebruik het overige lysaat (200 μL, van stap 5.2) om de eiwitconcentratie te meten. Bepaal de eiwitconcentratie van elk cellysaat met behulp van Bradford 25 of een equivalente methode. Bereken de totale eiwithoeveelheid (Q) in mg voor elke put.
    2. Om TC1 te verkrijgen (de waarde voor 1 μL radioactief gemerkte 2dG *), verdeel de CPM waarde van TC20 met 20.
    3. Bereken voor elke injectieflacon tHij neemt de glucose opname op als volgt:
      Vergelijking
      OPMERKING: R wordt gemeten in pmol / mg / min. Middel van R voor putten 1 - 2 geeft passieve transportsnelheid, R p . Middel van R voor putten 3-4 geeft de basale totale transportsnelheid, R bt . Middel van R voor putten 5-6 geeft insuline gestimuleerde totale transportsnelheid, R het .
      1. Bereken de basale actieve transportsnelheid ( Rba ) als volgt:
        Vergelijking
      2. Bereken de insuline gestimuleerde actieve transportsnelheid (R ia ) als volgt:
        Vergelijking
        OPMERKING: Bij insuline-responsieve cellen zoals myotubes worden glucose opnameprijzen meestal voorgesteld door drie waarden: R ba , R ia en de vouw insuline stimulatie als R ia / R ba .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Op dag 3 bereiken myoblasten samenloop ( figuur 1A ). De myoblasten in dit stadium zijn meestal mononucleated. Medium is veranderd en op dag 8 is de differentiatie voltooid ( Figuur 1B ) (protocol sectie 2). Na 5 dagen van differentiatie zijn myotubes uitgelijnd en typisch polynucleated. Menselijke primaire myotubes werden onderworpen aan een palmitaat of een BSA-enige behandeling voor het meten van glucose opname. Cellen werden gedurende 48 uur geïncubeerd met palmitaat 0,5 mM in BSA (PALM) of BSA alleen (BSA). Insuline stimulatie werd uitgevoerd (protocol sectie 3) en glucose opname werd gemeten (protocol sectie 4). Figuur 2 toont de glucose opname snelheid in een controle conditie (BSA) en een behandeling conditie (PALM). Nonspecifieke opname is gekwantificeerd in myotubes geïncubeerd met cytochalasine B. Basale en insuline gestimuleerde glucose opname tarieven kunnen worden vergeleken in BSA en PAL M voorwaarden. Insuline verhoogt het glucosetransport aanzienlijk in de BSA-toestand (p <0,01). De insuline gestimuleerde glucose opname snelheid is significant lager in myotubes behandeld met PALM (p <0,05). Bovendien kan de menselijke myotube cel respons op insuline ook uitgedrukt worden als vouwverandering. Figuur 3 toont aan dat de respons op insuline verlaagd is in myotubes die met PALM worden behandeld, vergeleken met de controle (p <0,05).

Ondanks beperkte expressie van GLUT4-eiwit in gekweekte myotubes kunnen primaire spiercellen reageren op insuline met een toename van de opname van glucose ( Figuur 2 ). De gemiddelde vouwverandering waargenomen is ~ 1,3, vergelijkbaar met wat beschreven werd door andere groepen met menselijke spiercellen 6 , 7 , 10 , 26 ,> 27. Inductie van insulineresistentie in spiercellen met verzadigd vetzuur wordt algemeen beschreven in muis-, rat- en menselijke spiercellen en is aangetoond om de opname van glucose van behandelde spiercellen 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 te verminderen . We verrichten 48 uur incubatie van palmitaat (0,5 mM) en waargenomen een afname van de snelheid van basale en insuline gestimuleerde glucose opname en een afname van de insuline-vouwverandering, die de insuline resistente toestand weerspiegelt. De incubatietijd die in dit manuscript wordt gebruikt, is gekozen om het remmende effect op de opname van glucose volledig te demonstreren. Kortere incubatietijden kunnen ook insulineresistentie produceren en verminderde glucose opname 31 , 32 , 33 , 34 . Lagere en dus meer fysiologische concentraties kunnen in vitro worden gebruikt, evenals dosis respons en / of tijdcursus experimenten, en vergelijking met het effect van onverzadigde vetzuren zoals oleaat 29 , 35 .

Figuur 1
Figuur 1: In Vitro Primaire Menselijke Myotubes. Beelden van menselijke myotubes bij 2 fasen van de cultuur verkregen met behulp van een optische microscoop worden getoond. ( A ) Dag 3 van de myoblastcultuur bij confluentie. ( B ) Op dag 8 (5 dagen van differentiatie) zijn myotubes uitgelijnd. Schaalbalk = 200 μm. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.


Figuur 2: Effect van Insuline Stimulatie op Glucose Opname Tarief in Menselijke Myotubes onder BSA en PALM Voorwaarden. Myotubes werden behandeld met alleen BSA of 0,5 mM PALM gedurende 48 uur. Na gemiddelde verandering en 3 uur serumuitputting werd de specifieke glucose opname (in pmol / mg / min) gemeten bij afwezigheid (-) of in de aanwezigheid (+) van insuline (1 uur, 100 nM). Gegevens zijn gemiddeld ± som van vier onafhankelijke experimenten met behulp van myotubes van vier verschillende donoren. #P <0,05 vergeleken met de basale waarde; * P <0,05 vergeleken met BSA insuline stimulatie waarde. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3: Vouw INsulin Response in BSA en PALM Cultuur Voorwaarden. Verhouding van insuline gestimuleerd op basale glucosetransportsnelheid in BSA en PALM condities. Deze verhouding geeft de opvouwsnelheid van de vouwglucose bij insuline stimulatie (100 nM). * P <0,05 vergeleken met BSA conditie (n = 4). Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Glucoseopname is een belangrijke biologische meting voor het testen van activatoren of remmers op celcultuur en hoe ze het gebruik van glucose beïnvloeden, en het vermogen van de cel om te reageren op insuline. De hier beschreven werkwijze is snel en betrouwbaar gebleken en is veel gebruikt in veel studies met primaire myotubes van gezonde proefpersonen en / of metabolisch getroffen patiënten 6 , 7 , 10 , 12 , 21 , 26 , 27 , 36 , 37 . Met slechts een 6-put plaat kunnen tarieven worden verkregen in duplicaten voor totaal basaal transport, basaal actief transport en insuline gestimuleerde actieve transport. Deze drie waarden beschrijven volledig de insuline gevoeligheid van de in vitro gekweekte spiercellen.

2dG mengsel kan toegevoegd worden aan alle geteste putten. Voor cellysis kan het volume NaOH volgens de celkenmerken gemodificeerd worden. Bij het werken met cellen die hoge vetzuren bevatten, dwz voor zeer viskeuze lysaten, kan het volume NaOH verhoogd worden tot 1,5 ml.

De methode maakt gebruik van radiomerkend materiaal dat de gevoeligheid van de meting verbetert, maar vereist dat het protocol in gecontroleerde gebieden wordt uitgevoerd. Materialen en afval moeten worden behandeld volgens de lokale veiligheidsvoorschriften. Voor niet-uitgeruste laboratoria zijn andere kleurmetrische en fluorescentie kwantificatie 38 methoden beschikbaar. Bij niet-radioactieve analyses kan fluorescentie-intensiteit worden gemeten na incubatie van de cellen met een fluorescerend D-glucose analoog 2- [ N- (7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl) amino] 2-deoxy-D-glucose (2-NBDG). Met dit analoog rapporteren sommige groepen dat insuline zijn fysiologische effecten in L6-cellen heeft verlorenAss = "xref"> 39, terwijl andere groepen toonden dat insuline nog steeds glucoseopname neemt (bij menselijke primaire spiercellen) 38 . Vanwege de lage GLUT4-expressie is kwantificering van insuline gestimuleerde glucose opname in gekweekte spiercellen verlaagd in vergelijking met in vivo condities 6 , 16 . Het is dus belangrijk om de insuline-responsiviteit van de gekweekte spiercellen verder te karakteriseren via andere benaderingen. Metingen van de fosforyleringsstatus van belangrijke eiwitten van de insuline-signaleringsweg (zoals Akt / PKB en / of GSK3) met behulp van immuno-detectie kunnen gebruikt worden 14 , 21 , 31 . Op het enzymatische niveau kan glycogensynthese, glucose en / of lipidoxidatie ook worden beoordeeld in omstandigheden met en zonder insuline 14 , 26 , 31 . Elke andere cel L type (of het reageert op insuline of niet) kan theoretisch worden geanalyseerd, aangezien alle cellen actief of passief glucose kunnen opnemen. De insuline gestimuleerde putjes kunnen aldus worden vervangen door elke andere geschikte behandeling.

Het gebruik van menselijke primaire myotube impliceert dat spiercellen een differentieringsstaat hebben bereikt die consistent zijn met voldoende expressie van GLUT4-eiwit. Als het preparaat niet-spiercellen of in hoofdzaak myoblasten bevat, zullen de glucoseopnamewaarden in de insuline stimulatie conditie niet verschillen van de basale toestand (R ia versus R ba ), voornamelijk door de overheersing van GLUT1 transporteur.

Insuline kan worden toegevoegd aan het primaire spiercelcultuurmedium om proliferatie en differentiatie van spiercellen te bevorderen en te verbeteren. Desalniettemin is ook insuline aangetoond dat de insulineresistentie bij chronische stimulatie 40 , 41 ,Class = "xref"> 42. In onze experimenten onderscheiden de menselijke primaire spiercellen alleen bij middelmatige verandering met gereduceerd serum. We prefereren daarom geen externe insuline tijdens de cultuur toe te voegen om de cellen te beschermen tegen chronische stimulatie alvorens de insuline responsiviteit te beoordelen. Tenslotte vereist de werkwijze verschillende wasstappen. Daarom moet er rekening worden gehouden met het niet losmaken van cellen van de plaat, aangezien het met primaire cellen kan gebeuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs erkennen Anne Charrié bij de Radiobiology-dienst (Lyon-Sud-ziekenhuis) en de Fonds National Suisse (FNS) voor hun financiële steun.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human primary muscle cell In house preparation from human skeletal muscle biopsies In house preparation from human skeletal muscle biopsies If not available, use commercial source
Human primary muscle cell Promocell C-12530 Should be cultured with associated media C23060 and C23061
6-well plate Corning 356400 BioCoat Collagen I Multiwell Plates
Ham's F10 Dutscher L0145-500 1 g/L glucose
Glutamine Dutscher X0551-100
penicilin/streptomycin 100x Thermo fisher scientific 15140122
Serum substitute UltroserG Pall France 15950.017 serum substitute in text
DMEM low glucose Dutscher L0064-500 1 g/L glucose
Fetal Calf Serum Eurobio CVFSVF00-01
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Dutscher L0625-500 Contains Mg2+ (0.5 mM) and Ca2+ (0.9 mM)
Insulin solution human Sigma-Aldrich I9278
2-deoxy-D-glucose  Sigma-Aldrich D6134
Albumin bovine euromedex 04-100-812-E
fatty acid-free BSA Roche 10,775,835,001
palmitate Sigma-Aldrich P0500
Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)] PerkinElmer NET328A001MC Specific Activity: 5 - 10 Ci (185-370GBq)/mmol, 1 mCi (37MBq
Cytochalasin B Sigma-Aldrich c2743
PICO PRIAS VIAL 6 mL PerkinElmer 6000192
ultima gold MW CA  PerkinElmer 6013159 scintillation liquid
bêta counter  PerkinElmer 2900TR

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stump, C. S., Henriksen, E. J., Wei, Y., Sowers, J. R. The metabolic syndrome: role of skeletal muscle metabolism. Ann Med. 38, (6), 389-402 (2006).
  2. DeFronzo, R. A., Tobin, J. D., Andres, R. Glucose clamp technique: a method for quantifying insulin secretion and resistance. Am J Physiol. 237, (3), E214-E223 (1979).
  3. Fossum, E., Hoieggen, A., Moan, A., Nordby, G., Kjeldsen, S. E. Insulin sensitivity relates to other cardiovascular risk factors in young men: validation of some modifications of the hyperinsulinaemic, isoglycaemic glucose clamp technique. Blood Press Suppl. 2, 113-119 (1997).
  4. Heise, T., et al. Euglycaemic glucose clamp: what it can and cannot do, and how to do it. Diabetes Obes Metab. 18, (10), 962-972 (2016).
  5. Sell, H., Jensen, J., Eckel, J. Measurement of insulin sensitivity in skeletal muscle in vitro. Methods Mol Biol. 933, 255-263 (2012).
  6. Sarabia, V., Lam, L., Burdett, E., Leiter, L. A., Klip, A. Glucose transport in human skeletal muscle cells in culture. Stimulation by insulin and metformin. J Clin Invest. 90, (4), 1386-1395 (1992).
  7. Sarabia, V., Ramlal, T., Klip, A. Glucose uptake in human and animal muscle cells in culture. Biochem Cell Biol. 68, (2), 536-542 (1990).
  8. Richter, E. A., Hargreaves, M. Exercise, GLUT4, and skeletal muscle glucose uptake. Physiol Rev. 93, (3), 993-1017 (2013).
  9. Gaster, M., Kristensen, S. R., Beck-Nielsen, H., Schroder, H. D. A cellular model system of differentiated human myotubes. Apmis. 109, (11), 735-744 (2001).
  10. Bouzakri, K., et al. Reduced activation of phosphatidylinositol-3 kinase and increased serine 636 phosphorylation of insulin receptor substrate-1 in primary culture of skeletal muscle cells from patients with type 2 diabetes. Diabetes. 52, (6), 1319-1325 (2003).
  11. Scheele, C., et al. Satellite cells derived from obese humans with type 2 diabetes and differentiated into myocytes in vitro exhibit abnormal response to IL-6. PLoS One. 7, (6), e39657 (2012).
  12. Jackson, S., et al. Decreased insulin responsiveness of glucose uptake in cultured human skeletal muscle cells from insulin-resistant nondiabetic relatives of type 2 diabetic families. Diabetes. 49, (7), 1169-1177 (2000).
  13. Aas, V., et al. Are cultured human myotubes far from home? Cell Tissue Res. 354, (3), 671-682 (2013).
  14. Bakke, S. S., et al. Myotubes from severely obese type 2 diabetic subjects accumulate less lipids and show higher lipolytic rate than myotubes from severely obese non-diabetic subjects. PLoS One. 10, (3), e0119556 (2015).
  15. Stuart, C. A., et al. Hexose transporter mRNAs for GLUT4, GLUT5, and GLUT12 predominate in human muscle. Am J Physiol Endocrinol Metab. 291, (5), E1067-E1073 (2006).
  16. Al-Khalili, L., et al. Insulin action in cultured human skeletal muscle cells during differentiation: assessment of cell surface GLUT4 and GLUT1 content. Cell Mol Life Sci. 60, (5), 991-998 (2003).
  17. Tsuka, S., et al. Promotion of insulin-induced glucose uptake in C2C12 myotubes by osteocalcin. Biochem Biophys Res Commun. 459, (3), 437-442 (2015).
  18. Gorbunov, E. A., Nicoll, J., Myslivets, A. A., Kachaeva, E. V., Tarasov, S. A. Subetta Enhances Sensitivity of Human Muscle Cells to Insulin. Bull Exp Biol Med. 159, (4), 463-465 (2015).
  19. Breen, D. M., Sanli, T., Giacca, A., Tsiani, E. Stimulation of muscle cell glucose uptake by resveratrol through sirtuins and AMPK. Biochem Biophys Res Commun. 374, (1), 117-122 (2008).
  20. Pinnamaneni, S. K., Southgate, R. J., Febbraio, M. A., Watt, M. J. Stearoyl CoA desaturase 1 is elevated in obesity but protects against fatty acid-induced skeletal muscle insulin resistance in vitro. Diabetologia. 49, (12), 3027-3037 (2006).
  21. Gastebois, C., et al. Transition from physical activity to inactivity increases skeletal muscle miR-148b content and triggers insulin resistance. Physiol Rep. 4, (17), (2016).
  22. Naimi, M., Tsakiridis, T., Stamatatos, T. C., Alexandropoulos, D. I., Tsiani, E. Increased skeletal muscle glucose uptake by rosemary extract through AMPK activation. Appl Physiol Nutr Metab. 40, (4), 407-413 (2015).
  23. Feng, Y. Z., et al. PPARdelta activation in human myotubes increases mitochondrial fatty acid oxidative capacity and reduces glucose utilization by a switch in substrate preference. Arch Physiol Biochem. 120, (1), 12-21 (2014).
  24. Perrin, L., et al. Human skeletal myotubes display a cell-autonomous circadian clock implicated in basal myokine secretion. Mol Metab. 4, (11), 834-845 (2015).
  25. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  26. Bouzakri, K., et al. Malonyl CoenzymeA decarboxylase regulates lipid and glucose metabolism in human skeletal muscle. Diabetes. 57, (6), 1508-1516 (2008).
  27. Shemyakin, A., et al. Endothelin-1 reduces glucose uptake in human skeletal muscle in vivo and in vitro. Diabetes. 60, (8), 2061-2067 (2011).
  28. Alkhateeb, H., Chabowski, A., Glatz, J. F., Luiken, J. F., Bonen, A. Two phases of palmitate-induced insulin resistance in skeletal muscle: impaired GLUT4 translocation is followed by a reduced GLUT4 intrinsic activity. Am J Physiol Endocrinol Metab. 293, (3), E783-E793 (2007).
  29. Coll, T., et al. Oleate reverses palmitate-induced insulin resistance and inflammation in skeletal muscle cells. J Biol Chem. 283, (17), 11107-11116 (2008).
  30. Gaster, M., Rustan, A. C., Beck-Nielsen, H. Differential utilization of saturated palmitate and unsaturated oleate: evidence from cultured myotubes. Diabetes. 54, (3), 648-656 (2005).
  31. Hage Hassan, R., et al. Endoplasmic reticulum stress does not mediate palmitate-induced insulin resistance in mouse and human muscle cells. Diabetologia. 55, (1), 204-214 (2012).
  32. Haghani, K., Pashaei, S., Vakili, S., Taheripak, G., Bakhtiyari, S. TNF-alpha knockdown alleviates palmitate-induced insulin resistance in C2C12 skeletal muscle cells. Biochem Biophys Res Commun. 460, (4), 977-982 (2015).
  33. Hommelberg, P. P., et al. Palmitate-induced skeletal muscle insulin resistance does not require NF-kappaB activation. Cell Mol Life Sci. 68, (7), 1215-1225 (2011).
  34. Yang, M., et al. Saturated fatty acid palmitate-induced insulin resistance is accompanied with myotube loss and the impaired expression of health benefit myokine genes in C2C12 myotubes. Lipids Health Dis. 12, 104 (2013).
  35. Peng, G., et al. Oleate blocks palmitate-induced abnormal lipid distribution, endoplasmic reticulum expansion and stress, and insulin resistance in skeletal muscle. Endocrinology. 152, (6), 2206-2218 (2011).
  36. Lambernd, S., et al. Contractile activity of human skeletal muscle cells prevents insulin resistance by inhibiting pro-inflammatory signalling pathways. Diabetologia. 55, (4), 1128-1139 (2012).
  37. Nikolic, N., et al. Electrical pulse stimulation of cultured human skeletal muscle cells as an in vitro model of exercise. PLoS One. 7, (3), e33203 (2012).
  38. Hsu, F. L., et al. Antidiabetic effects of pterosin A, a small-molecular-weight natural product, on diabetic mouse models. Diabetes. 62, (2), 628-638 (2013).
  39. Zou, C., Wang, Y., Shen, Z. 2-NBDG as a fluorescent indicator for direct glucose uptake measurement. J Biochem Biophys Methods. 64, (3), 207-215 (2005).
  40. Catalano, K. J., et al. Insulin resistance induced by hyperinsulinemia coincides with a persistent alteration at the insulin receptor tyrosine kinase domain. PLoS One. 9, (9), e108693 (2014).
  41. Liu, H. Y., et al. Insulin is a stronger inducer of insulin resistance than hyperglycemia in mice with type 1 diabetes mellitus (T1DM). J Biol Chem. 284, (40), 27090-27100 (2009).
  42. Renstrom, F., Buren, J., Svensson, M., Eriksson, J. W. Insulin resistance induced by high glucose and high insulin precedes insulin receptor substrate 1 protein depletion in human adipocytes. Metabolism. 56, (2), 190-198 (2007).
Glucoseopname-meting en respons op insuline stimulatie in<em&gt; In Vitro</em&gt; Cultured Human Primary Myotubes
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chanon, S., Durand, C., Vieille-Marchiset, A., Robert, M., Dibner, C., Simon, C., Lefai, E. Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes. J. Vis. Exp. (124), e55743, doi:10.3791/55743 (2017).More

Chanon, S., Durand, C., Vieille-Marchiset, A., Robert, M., Dibner, C., Simon, C., Lefai, E. Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes. J. Vis. Exp. (124), e55743, doi:10.3791/55743 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter