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Biology

ग्लूकोज अपटेक मापन और इनसुलिन उत्तेजना के प्रति प्रतिक्रिया doi: 10.3791/55743 Published: June 25, 2017

Summary

इस पद्धति में, मानव प्राथमिक मांसपेशी कोशिकाओं को विभेदित मैयोट्यूब प्राप्त करने के लिए इन विट्रो में सुसंस्कृत किया जाता है और ग्लूकोज तेज गति मापा जाता है। हम रेडियोलैलेड [ 3 एच] 2-डीओसी-डी-ग्लूकोज का उपयोग करते हुए बेसल और इंसुलिन-उत्तेजित राज्यों में दरों का अनुमान लगाने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं।

Abstract

स्केलेटल मांसपेशी स्तनधारियों में सबसे बड़ा ग्लूकोज जमा है और मोटे तौर पर ग्लूकोज होमोस्टैसिस में योगदान देता है। मांसपेशी के ग्लूकोज चयापचय की खोज के लिए समर्पित सभी अध्ययनों के लिए मांसपेशियों की कोशिकाओं की इंसुलिन संवेदनशीलता का आकलन प्रमुख रूप से प्रासंगिक है और चयापचय संबंधी बदलावों को निस्र्पक करते हैं। मांसपेशियों की कोशिकाओं में ग्लूकोज ट्रांसपोर्टर टाइप 4 (ग्लूटा 4) प्रोटीन इंसुलिन के जवाब में प्लाज्मा झिल्ली को स्थानांतरित करते हैं, जिससे सेल में ग्लूकोज की भारी प्रविष्टि हो सकती है। ग्लूकोज तेज की दर बढ़ाने के द्वारा पेशी कोशिकाओं की इंसुलिन का जवाब देने की क्षमता इंसुलिन की मांसपेशियों की कोशिका संवेदनशीलता का आकलन करने के लिए मानक पढ़ाई है। मानव प्राथमिक मायोट्यूब इन विट्रो मॉडल में एक उपयुक्त हैं, क्योंकि कोशिकाओं में दाता phenotype की कई विशेषताएं हैं, जिनमें इंसुलिन संवेदनशीलता शामिल है। यह इन विट्रो मॉडल में भी किसी भी यौगिकों के परीक्षण के लिए उपयुक्त है जो इंसुलिन की प्रतिक्रिया को प्रभावित कर सकता है। विभेदित मायोट्यूब में ग्लूकोज तेज गति का माप प्रतिबिंबित करता हैइंसुलिन संवेदनशीलता

इस पद्धति में, मानव प्राथमिक मांसपेशियों की कोशिकाओं को विभेदित मैयोट्यूब प्राप्त करने के लिए इन विट्रो में सुसंस्कृत किया जाता है, और इंसुलिन उत्तेजना के बिना ग्लूकोज की तेज दरों को मापा जाता है। हम रेडियोलैलेड [ 3 एच] 2-डीओसी-डी-ग्लूकोज ([ 3 एच] 2 डीजी) के उपयोग से निष्क्रिय और सक्रिय ग्लूकोज ट्रांसपोर्ट रेटों को मापने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। सक्रिय बेसल और इंसुलिन से प्रेरित दरों की मात्रा के साथ-साथ उत्तेजना गुना की गणना के लिए गणना पद्धतियां प्रदान की जाती हैं।

Introduction

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स्केलेटल मांसपेशी स्तनधारियों में सबसे बड़ा ग्लूकोज जमा है और मोटे तौर पर ग्लूकोज होमोस्टैसिस में योगदान देता है। यह इंसुलिन उत्तरदायी ऊतक ग्लूकोस तेज की प्राथमिक साइट है जो इंसुलिन उत्तेजना 1 से शुरू हो रहा है।

टाइप 2 मधुमेह में, कंकाल की मांसपेशी सहित कई ऊतकों में इंसुलिन प्रतिरोध मनाया जाता है, और सामान्य रक्त शर्करा की एकाग्रता को ऊपर जाता है। इस प्रकार, इस ऊतक और उसके कोशिकाओं की इंसुलिन संवेदनशीलता के स्तर को निर्धारित करने के लिए यह एक महत्वपूर्ण प्रासंगिकता का है, चाहे उद्देश्य किसी विषय में किसी दोष को चिह्नित करना है या इसे बेहतर बनाने के इरादे से उपचार की दक्षता का मूल्यांकन करना है। मानव या पशु विषयों में, इंसुलिन संवेदनशीलता का आकलन करने के लिए सोने की मानक तकनीक हाइपरिन्सिलिनेमिक-इयूग्लेसेमिक क्लैंप है। 1 9 7 9 में डेफ्रोनो द्वारा प्रस्तुत किया गया और 3 से 4 में संशोधित किया गया , तब विधि पूरे शरीर को मापने की अनुमति देता हैसामान्य रक्त ग्लूकोज एकाग्रता बनाए रखने के लिए इंसुलिन उत्तेजना के तहत ग्लूकोज की दर के रूप में मापा गया एनडी ऊतक इंसुलिन की प्रतिक्रिया।

इंसुलिन संवेदनशीलता की खोज को इन विट्रो मांसपेशी मॉडल में उपयोग करके सेल स्तर पर किया जा सकता है, और ग्लूकोज तेज गति का माप इंसुलिन उत्तेजना 5 , 6 , 7 के लिए कोशिका के जैविक प्रतिक्रिया को मापने के लिए एक कुशल और विश्वसनीय उपकरण है। दरअसल, ग्लूकोज तेज गति इंसुलिन उत्तेजना को सेल जैविक प्रतिक्रिया, अपने रिसेप्टर से जीएलयूटी 4 समृद्ध vesicles के स्थानांतरण के लिए इंसुलिन की बाध्यता से, और इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग और फास्फोरायलेशन कैसकैड्स 8 सहित, मात्रा देता है।

मानव नमूनों के साथ यह मुख्य रूचि है, क्योंकि विभेदित मैयोट्यूब चयापचय गुण सहित दाता phenotype के कई विशेषताएं बनाए रखते हैंमरीज 9 , 10 , 11 , 12 में देखे गए रोग और विकार म्यूट्यूबल्स कंकाल की मांसपेशी 13 , 14 के लिए संरचनात्मक, चयापचय और फेनोटाइपिक समानताएं दिखाती है जिसमें ग्लूकोज ट्रांसपोर्टर 15 की अभिव्यक्ति और सेलुलर इंसुलिन सिग्नलिंग मशीनरी 16 शामिल है । इस प्रकार, प्राथमिक मैयोट्यूब में ग्लूकोज तेज की माप एक दाता की मांसपेशी फेनोटाइप को दर्शाने या मांसपेशी कोशिका में इंसुलिन संवेदनशीलता पर हस्तक्षेप (दवा, पोषण, या शारीरिक गतिविधि) के प्रभाव की जांच करने के लिए प्रासंगिकता है।

इन्सुलिन संवेदनशीलता 17 , 18 को संशोधित करने वाले प्रयोग करते समय सुसंस्कृत मैयोट्यूब पर ग्लूकोज तेज की माप एक विश्वसनीय उपकरण भी है। इन विट्रो में 19 , 20 , 21 , 22 , 23 को रोकने या रिवर्स कर सकता है।

यहां हम संस्कृति के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं और मानव मैथ्यूबस को अलग करते हैं और सेल ग्लूकोज तेज गति को मापते हैं। यह विधि मानव मांसपेशी पूर्ववर्ती कोशिकाओं के किसी भी स्रोत पर लागू होती है, चाहे वे इन-लैब की तैयारी, सहयोग या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध आपूर्तिकर्ताओं से आते हों। क्रमशः माउस और चूहा उत्पत्ति से क्रमशः सीसी 212 और एल 6 जैसी अमर स्नायविक सेल लाइनों का उपयोग इस प्रोटोकॉल 7 के साथ ग्लूकोज तेज गति के लिए भी किया जा सकता है।

हम रेडियोलैलेड [ 3 एच] 2 डीजी का उपयोग करते हुए बेसल और इंसुलिन-प्रेरित राज्यों में दरों का परिमाण के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। टीवह एक लेबल ग्लूकोज एनालॉग का उपयोग कम प्रारंभिक सामग्री के साथ ग्लूकोज प्रविष्टि के सटीक निर्धारण की अनुमति देता है, प्राथमिक कोशिकाओं के साथ काम करते समय एक सामान्य स्थिति। संशोधित ग्लूकोज अणु चयापचय मार्गों में प्रवेश करने में असमर्थ है, और इस प्रकार, सेल के भीतर जमा होता है, जो कुल सेल रेडियोधर्मिता के जरिये विश्वसनीय मात्रा का आदान-प्रदान करता है। प्रायोगिक स्थितियों में ग्लूकोज ट्रांसपोर्ट इनहिबिटर (cytochalasin B) का उपयोग शामिल है, और इंसुलिन के बिना और बिना मापन किया जाता है यह संयोजन ग्लूकोज सक्रिय प्रविष्टि दर के निर्धारण के साथ-साथ इंसुलिन प्रतिक्रिया सूचकांक के लिए गुना परिवर्तन की गणना भी देता है। विधि एक ऊष्मायन समय के दौरान इंसुलिन की एक खुराक के साथ प्रस्तुत की जाती है, लेकिन प्रोटोकॉल आसानी से खुराक प्रतिक्रिया या समय के पाठ्यक्रम प्रयोगों 12 के लिए संशोधित किया जा सकता है।

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Protocol

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1. सेल संस्कृति मीडिया और समाधान की तैयारी

  1. संस्कृति मीडिया की तैयारी
    1. ग्लूटामाइन (2 मिमी), पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (5 माइक्रोग्राम / एमएल फाइनल), 2% फेलल कैल्फ सीरम (एफसीएस) और 2% सीरम ऑप्शन के साथ हैम एफ -110 के माध्यम से प्रसार के माध्यम से प्रसार माध्यम (पीएम) तैयार करें।
    2. ग्लुटामाइन (2 मिमी), पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (5 माइक्रोग्राम / एमएल फाइनल), और 2% एफसीएस के साथ दल्बेईको के संशोधित ईगल मध्यम (डीएमईएम) को पूरक करके भेदभाव माध्यम (डीएम) तैयार करें।
  2. ग्लूकोज तेज गति की तैयारी
    सावधानी: रेडियोधर्मी सामग्री को संभालने के लिए केवल अधिकृत कर्मियों द्वारा सीमित और नियंत्रित क्षेत्र में अनुमति दी जाती है। उपयुक्त प्रक्रिया, दिशानिर्देशों और स्थानीय कानून के अनुसार सामग्री और कचरे को संभालना आवश्यक है।
    1. एक्स-दुलबेको के फॉस्फेट-बफर्ड खारा (एक्स-डीपीबीएस) तैयार करने के लिए, डीपीबीएस का समाधान करें जिसमें 0.2% (वाय / वी) (अंतिम एकाग्रता) गोजाइन सीरम अल्बUmin (बीएसए) 0.2 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से समाधान फ़िल्टर करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें
    2. ठंडा 2-डीओसी-डी-ग्लूकोस (2 डीजी) समाधान तैयार करने के लिए, 10 एमएम का समाधान प्राप्त करने के लिए 2 डीजी की 16.4 मिलीग्राम वजन और 10 एमएल डिस्टिल्ड वॉटर में घुलनशील करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें
    3. रेडियोलैबैड 2 डीजी (2 डीजी *) समाधान प्राप्त करने के लिए 600 μL का 2 डीजी और 6 μ एल रेडियोलैलेड युक्त [ 3 एच] 2 डीजी को एक्स-डीपीबीएस के 5400 μL जोड़ें।
      नोट: अंतिम एकाग्रता 1 एमएम 2 डीजी है और लेबलिंग 1 माइक्रिया / एमएल है।
      1. रेडियोलैबैड 2 डीजी * समाधान के एक 20 μL विभाज्य (टीसी 20) को अलग रखें।
  3. ऊष्मायन मिश्रण की तैयारी
    1. साइटोचैलासिन बी मिश्रण के लिए, 2 एमएल का 20 एमएम साइटोचालसिन बी से 2 एमएल रेडियोलैबैड 2 डीजी * सोल्यूशन जोड़ें।
      नोट: साइटोचालसिन बी का स्टॉक समाधान डाइमिथाइल सल्फाओक्साइड (डीएमएसओ) में 10 मिलीग्राम / एमएल पर है।
    2. डीएमएसओ मिश्रण के लिए, 4 μL डीएमएसओ को शेष 4 एमएल रेडियोलैबैड 2 डीजी * समाधान में जोड़ें।

    2. मानव प्राथमिक मांसल कोशिकाओं की संस्कृति

    1. मानव मांसपेशी उपग्रह कोशिकाओं के साथ 6 अच्छी तरह से प्लेटों की सीडिंग
      नोट: घर में उपयोग करें (विवरण के लिए संदर्भ 24 देखें) या वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध मानव मांसपेशी उपग्रह कोशिकाओं को जमे हुए शीशी से (250,000 कोशिकाओं से युक्त) एक ही स्थिति में ग्लूकोज तेज की माप के लिए जरूरी 6-अच्छी प्लेट की आवश्यकता के लिए 250,000 कोशिकाओं के लिए निम्नलिखित प्रक्रिया दी गई है।
      1. पहले से गरम पानी (37 डिग्री सेल्सियस) में इंसान घर की मांसपेशी उपग्रह कोशिकाओं के वाणिज्यिक घरों की जमे हुए शीशियों को तेजी से पिघलना और जब तक केवल एक छोटा सा बर्फ ब्लॉक शीशी में नहीं रहता।
      2. सीधे 50 एमएल प्लास्टिक ट्यूब में 10 एमएल प्री-वार्मिंग (37 डिग्री सेल्सियस) पीएम डालो।
      3. 500 मिनट में 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
      4. धीरे-धीरे 18 एमएल पूर्व गर्म प्रधानमंत्री के साथ सेल गोली resuspend (प्रति 42,000 कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए3 एमएल का माध्यम)। एक 6-अच्छी तरह से प्लेट (9.6 सेमी 2 ) के प्रत्येक कुएं में 3 एमएल वितरित करें।
        नोट: एक थाली के छह व्यक्तिगत कुओं को निम्नलिखित शर्तों के लिए ग्लूकोज तेज की एक डुप्लिकेट मापन करने की आवश्यकता होती है: निष्क्रिय परिवहन अवरोध (कुओं 1 और 2), बेसल दर (कुओं 3 और 4) और इंसुलिन प्रेरित दर (कुओं 5 और 6)। कई छः-अच्छी तरह प्लेटें दोहराएं क्योंकि अलग-अलग उपचार आवश्यक हैं।
      5. मानक संस्कृति परिस्थितियों में सेते (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 ) जब तक कोशिकाओं तक पहुंच 90% संगम नहीं होती है।
        नोट: यह चरण सेल बैच के आधार पर 48-72 घंटे के बीच ले जाता है। इस चरण के दौरान माध्यम को मत बदलें।
    2. मांसपेशी कोशिकाओं का विभेद
      1. प्रधानमंत्री (48-72 घंटे के बाद) को हटा दें और पूर्व गर्म डीएम (प्रति 3 एमएल प्रति) के साथ बदलें। 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 में सेते हैं
        नोट: भेदभाव स्थिर राज्य तक पहुंचने में पांच दिनों का समय लगता है जहां कोशिकाओं को गठबंधन किया जाता है और पॉलिनक्लेक्एक्चुएटेड। आमतौर पर, प्राथमिकमयोट्यूब एक 1 जी / एल ग्लूकोस माध्यम में सुसंस्कृत हैं इसलिए, संस्कृति के दौरान ग्लूकोज की कमी से बचने के लिए, प्लेट को 3 एमएल माध्यम से भरें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि सभी समय में कोशिकाओं के लिए पर्याप्त ग्लूकोज सब्सट्रेट उपलब्ध है।
      2. डीएम माध्यम हर दो दिनों में बदलें।
        नोट: इस बिंदु से, मायोट्यूब किसी भी महत्वपूर्ण परिवर्तन के बिना 7 दिनों के लिए स्थिर होते हैं और ग्लूकोज तेज गति किसी भी समय किया जा सकता है।
    3. स्नायु कोशिकाओं के उपचार (वैकल्पिक)
      नोट: इंसुलिन उत्तेजना और ग्लूकोज तेज गति से पहले संशोधित करने के लिए प्राथमिक मैयोट्यूब का इलाज कई दिनों तक किया जा सकता है (दवा परीक्षण, संकेतन पथ के अवरोधक / सक्रियकर्ता आदि )। स्नायु कोशिकाओं को किसी भी उपचार के लिए प्रस्तुत किया जा सकता है जिसका इंसुलिन संवेदनशीलता पर असर पड़ सकता है, और ग्लूकोज तेज गति से इस प्रभाव का अनुमान लगाया जा सकता है उदाहरण के लिए, संतृप्त फैटी एसिड के साथ मांसपेशी कोशिकाओं के ऊष्मायन इंसुलिन प्रतिरोध को बढ़ावा देता है, और कोशिकाओं को कम कर देता है Iनासलीन ने ग्लूकोज तेज को प्रेरित किया।
      1. 10% बीएसए (फैटी एसिड फ्री) और 0.5 एमएल पालिमेट (पाम) के साथ 12 एमएल डीएम तैयार करें। डीएम के 12 एमएल तैयार करें जो केवल 10% बीएसए (फैटी एसिड फ्री) से पूरक है।
      2. मानव प्राथमिक मायोट्यूब के साथ दो 6 अच्छी तरह प्लेटें तैयार करें, और उन्हें खंड 2.1 और 2.2 (भेदभाव के 5 दिनों के साथ) में बताया गया है।
      3. 5 दिन, पीबीएस के 2 एमएल के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से धो लें। एक प्लेट में, डीएम युक्त पाम के 2 एमएल जोड़ें। दूसरी प्लेट में बीएसए के 2 एमएल का डीएम शामिल है
      4. 48 घंटे 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 के लिए सेते हैं

    3. इंसुलिन उत्तेजना

    1. 2 एमएल पीबीएस के साथ दो बार विभेदित पेशी कोशिकाओं को धो लें
    2. पीबीएस को सावधानी से निकालें और 3 एमएल (सीएनआर की कमी के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 ) के लिए एफसी के बिना डीएम के 3 एमएल के साथ सेते हैं।
    3. सभी कुओं में मीडिया को एफसीएस के बिना डीएम के 3 एमएल के साथ बदलें। कुओं के लिए 100 एनएम इंसुलिन 5 और 6 जोड़ें
    4. मानव मैयोट्यूब संस्कृति को सेते हैं1 घंटे (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 )।

    4. ग्लूकोज अपटेक

    1. इंसुलिन उत्तेजना के 1 घंटे के बाद, एक्स-डीपीबीएस (1 एमएल प्रति धोने) के साथ दो बार कुओं को धो लें।
    2. 1 एमएल का साइटोचालसिन बी मिश्रण कुओं को 1 और 2, और 1 एमएल के डीएमएसओ मिश्रण को कुओं में 3 - 6 जोड़ें। 15 मिनट (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 ) के लिए सेते हैं। ऊष्मायन के अंत में, तुरंत बर्फ पर प्लेट रखो।

    5. सेल लसीस

    1. कोशिकाओं को 1 मिलीलीटर बर्फ ठंडा पीबीएस के साथ दो बार धो लें
    2. प्रत्येक अच्छी तरह से कोशिकाओं में लिसे 600 एमएल के 50 मिमी NaOH 5 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं और धीमे कक्षीय रोटेशन के साथ धीरे मिश्रण करें।
      नोट: यदि lysate बहुत चिपचिपा है, 1.5 एमएल NaOH तक कमजोर पड़ें।
    3. एक विंदुक का उपयोग, resuspend और सेल lysate इकट्ठा

    6. रेडियोलैलेड ग्लूकोज का निर्धारण

    1. एक तरल जगमगाहट गिनती शीशी में प्रत्येक सेल lysate के 400 μL रखो। 400 के साथ एक नकारात्मक नियंत्रण शीशी तैयार करें50 एमएम NaOH के μL, और टीसी 20 के 20 μL (चरण 1.2.3.1 से) के साथ एक सकारात्मक नियंत्रण शीशी।
    2. प्रत्येक शीशी में तरल जगमगाहट समाधान के 4 एमएल जोड़ें। कैप बंद करें और प्रत्येक शीशी को अच्छी तरह से मिलाएं (1-2 s)।
    3. एक तरल जगमगाहट काउंटर में प्रत्येक शीशी को सम्मिलित करें और निर्माता के निर्देश के अनुसार रेडियोधर्मिता को मापें। 10 मिनट के लिए प्रत्येक झुर्रीदार शीशी के लिए प्रति मिनट (सीपीएम) रिकॉर्ड गणना
      नोट: सीपीएम = "विखंडन प्रति मिनट" एक्स "दक्षता की गिनती"

    7. ग्लूकोज अपटेक की दर

    1. प्रोटीन एकाग्रता को मापने के लिए शेष lysate (200 μL; 5.2 कदम से) का उपयोग करें। प्रत्येक सेल lysate के प्रोटीन एकाग्रता ब्रैडफोर्ड 25 या समतुल्य विधि का उपयोग करके निर्धारित करें। प्रत्येक अच्छी तरह से मिलीग्राम के लिए कुल प्रोटीन मात्रा (क्यू) की गणना करें
    2. टीसी 1 प्राप्त करने के लिए (1 μL रेडियोलैबैड 2 डीजी * के लिए मान), 20 तक टीसी 20 के सीपीएम मूल्य को विभाजित करें।
    3. प्रत्येक शीशी के लिए, टी की गणना करेंवह ग्लूकोज तेज की दर निम्नानुसार है:
      समीकरण
      नोट: आर pmol / mg / min में मापा जाता है कुओं 1 - 2 के लिए आर का मतलब निष्क्रिय परिवहन दर, आर पी देता है कुओं 3-4 के लिए आर का मतलब बेसल कुल परिवहन दर देता है, आर बीटी । कुओं के आर 5 का मतलब इंसुलिन से कुल परिवहन दर को प्रेरित करता है, आर यह
      1. बुनियादी सक्रिय दर (आर बीए ) की निम्नानुसार गणना करें:
        समीकरण
      2. निम्नानुसार इंसुलिन सक्रिय परिवहन दर ( आरआईआई ) को प्रोत्साहित करें:
        समीकरण
        नोट: इंसुलिन संवेदनशील कोशिकाओं जैसे मैयोट्यूब, ग्लूकोज तेज करने की दर आमतौर पर तीन मानों द्वारा दर्शायी जाती है: आर बीए , आरआईआई , और आरआईआई / आर बीए के रूप में गुना इंसुलिन उत्तेजना।

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Representative Results

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3 दिन, म्यॉब्लास्ट संगम तक पहुंचते हैं ( चित्रा 1 ए )। इस स्तर पर म्यॉब्लास्ट आम तौर पर मोनोन्यूकेक्एक्चुएटेड हैं। माध्यम बदल गया था और 8 दिन, भेदभाव पूरा हुआ ( चित्रा 1 बी ) (प्रोटोकॉल अनुभाग 2)। भेदभाव के 5 दिनों के बाद, मयोट्यूब गठबंधन कर रहे हैं और आम तौर पर polynucleated। ग्लूकोस तेज गति माप से पहले मानवीय प्राथमिक मयोट्यूब को एक कोलेमिट या बीएसए-केवल उपचार के अधीन किया गया था। बीएसए (पाम) या बीएसए (बीएसए) अकेले (बीएसए) में 0.5 एमएम में पामेटीइट के साथ 48 घंटे के लिए सेल लगाए गए थे। इंसुलिन उत्तेजना (प्रोटोकॉल 3 अनुभाग) और ग्लूकोज तेज गति (प्रोटोकॉल अनुभाग 4) मापा गया था प्रदर्शन किया गया था। चित्रा 2 एक नियंत्रण हालत (बीएसए) और एक उपचार की स्थिति (पाम) में ग्लूकोज तेज गति से पता चलता है। गैर-विशिष्ट चपेट में साइटोचैलिसिन बी। बेसल और इंसुलिन के साथ incubated myotubes में मात्रा निर्धारित है, ग्लूकोज तेज दर बीएसए और पाल में तुलना की जा सकती है एम शर्तें इंसुलिन में बीएसए हालत (पी <0.01) में ग्लूकोज ट्रांसपोर्ट काफी बढ़ गया है। पाम (पी <0.05) के साथ इलाज किए गए मैयूट्यूब में ग्लूकोस तेज गति से इंसुलिन प्रेरित हो रहा है। इसके अलावा, इंसुलिन के लिए मानव म्यूटेबेब सेल प्रतिक्रिया भी गुना परिवर्तन के रूप में व्यक्त की जा सकती है। चित्रा 3 दर्शाता है कि नियंत्रण (पी <0.05) के मुकाबले की तुलना में पाम के साथ इंसुलिन की प्रतिक्रिया में कमी आई है।

सुसंस्कृत मैयोट्यूब में जीएलयूटी 4 प्रोटीन की सीमित अभिव्यक्ति के बावजूद, प्राथमिक मांसपेशियों की कोशिकाएं ग्लुकोज तेज गति ( चित्रा 2 ) में वृद्धि के साथ इंसुलिन का जवाब देती हैं। मानव पंसल कोशिकाओं 6 , 7 , 10 , 26 के साथ अन्य समूहों द्वारा वर्णित वस्तु के अनुसार, जो औसत गुना परिवर्तन देखा गया है ~ 1.3 है ,> 27 मांसपेशियों की कोशिकाओं में संतृप्त फैटी एसिड में इंसुलिन प्रतिरोध का प्रेरण आमतौर पर माउस, चूहा और मानव मांसपेशी कोशिकाओं में वर्णित है, और यह इलाज किया गया पेशाब कोशिकाओं 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 के ग्लूकोज तेज को कम करने का प्रदर्शन किया गया है। हमने 48 घंटे के लिए कोलेमिट (0.5 मिमी) ऊष्मायन किया और पाया गया कि बेसल की दर में कमी और इंसुलिन ने ग्लूकोज तेज गति को बढ़ाया और इंसुलिन की मात्रा में कमी, इंसुलिन प्रतिरोधी स्थिति को दर्शाया। इस पांडुलिपि में प्रयुक्त ऊष्मायन समय को ग्लूकोज तेज पर निरोधात्मक प्रभाव का पूर्ण रूप से प्रदर्शित करने के लिए चुना गया है। कम ऊष्मायन समय भी इंसुलिन प्रतिरोध और कम ग्लूकोज तेजता 31 , 32 , 33 का उत्पादन कर सकता है , 34 इन विट्रो में लोअर और इस प्रकार अधिक शारीरिक सांद्रता का उपयोग किया जा सकता है, साथ ही खुराक की प्रतिक्रिया और / या समय के पाठ्यक्रम प्रयोगों, और oleate 29 , 35 जैसे असंतृप्त फैटी एसिड के प्रभाव के साथ तुलना में।

आकृति 1
चित्रा 1: विट्रो प्राथमिक मानव मैट्यूब में एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर प्राप्त की गई संस्कृति के 2 चरणों में मानव म्युट्यूब के चित्र दिखाए गए हैं। ( ) संगम में म्योबालास्ट संस्कृति के 3 दिन। ( बी ) दिन 8 (भेदभाव के 5 दिन), मैयोट्यूब गठबंधन कर रहे हैं। स्केल बार = 200 माइक्रोन इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें


चित्रा 2: बीएसए और पाम स्थितियों के तहत इंसुलिन उत्तेजना के प्रभाव मानव माइोट्यूब में ग्लूकोज अपटैप दर पर। म्युट्यूब्स का इलाज अकेले बीएसएएस या 48 एम के लिए 0.5 एमएम पाम के साथ किया गया था। मध्यम परिवर्तन और 3 एच सीरम की कमी के बाद, विशिष्ट ग्लूकोज तेज गति (पीएमओएल / एमजी / मिन में) अनुपस्थिति (-) या इंसुलिन की मौजूदगी (+) (1 एच, 100 एनएम) में मापा गया था। आंकड़े चार अलग-अलग दाताओं से मैयोट्यूब का उपयोग करते हुए चार स्वतंत्र प्रयोगों का मतलब ± सा है। मूल मूल्य के साथ तुलना में # पी <0.05; * पी <0.05 बीएसए इंसुलिन उत्तेजना मूल्य की तुलना में। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र तीन
3 चित्रा: मैं मोड़ो Iबीएसए और पाम संस्कृति स्थितियों में नासिकिन प्रतिक्रिया बीएसए और पाम स्थितियों में बेसल ग्लूकोज परिवहन दर पर प्रेरित इंसुलिन का अनुपात। यह अनुपात इंसुलिन उत्तेजना (100 एनएम) पर गुना ग्लूकोज तेज दर देता है। बीएसए की स्थिति (एन = 4) की तुलना में * पी <0.05। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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Discussion

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ग्लूकोज तेज गति से सेल संस्कृति पर सक्रियणकर्ता या अवरोधकों के परीक्षण के लिए एक महत्वपूर्ण जैविक माप है और यह कि कैसे ग्लूकोज का इस्तेमाल करते हैं और इंसुलिन का जवाब देने के लिए सेल की क्षमता। यहां वर्णित विधि त्वरित और विश्वसनीय होने के लिए दिखाया गया है और कई अध्ययनों में स्वस्थ विषयों और / या मेटाबोलिक रूप से प्रभावित मरीजों के प्राथमिक मैयोट्यूब का उपयोग करते हुए 6 , 7 , 10 , 12 , 21 , 26 , 27 , 36 , 37 का व्यापक अध्ययन किया गया है। केवल एक 6 अच्छी तरह से प्लेट के साथ, कुल मूल परिवहन, बेसल सक्रिय परिवहन, और इंसुलिन से प्रेरित सक्रिय परिवहन के लिए डुप्लिकेट में दरों को प्राप्त किया जा सकता है। ये तीन मूल्य इन विट्रो सुसंस्कृत मांसपेशी कोशिकाओं की इंसुलिन संवेदनशीलता का पूरी तरह से वर्णन करते हैं।

2 डीजी मिश्रण को सभी परीक्षण कुओं में जोड़ा जा सकता है। कोशिका विश्लेषण के लिए, सेल की विशेषताओं के अनुसार, NaOH का मात्रा संशोधित किया जा सकता है। जब कोशिकाओं के साथ काम करना होता है जिसमें फैटी एसिड के उच्च स्तर होते हैं, अर्थात् बहुत चिपचिपा lysates के लिए, NaOH का वॉल्यूम 1.5 एमएल तक बढ़ाया जा सकता है।

विधि रेडियोलैबैड सामग्री का उपयोग करती है जो माप की संवेदनशीलता को बढ़ाती है, लेकिन यह आवश्यक है कि प्रोटोकॉल नियंत्रित क्षेत्रों में किया जाना चाहिए। स्थानीय सुरक्षा दिशानिर्देशों के मुताबिक सामग्री और कचरे को संभालना आवश्यक है गैर-सुसज्जित प्रयोगशालाओं के लिए, अन्य रंगनिर्मीक और प्रतिदीप्ति मात्रा का 38 मात्रा उपलब्ध हैं। गैर-रेडियोधर्मी एशेज में, प्रतिदीप्ति तीव्रता को फ्लोरोसेंट डी-ग्लूकोस एनालॉग 2- [ एन - (7-नाइट्रोबेन्ज़-2-ऑक्सा -13-डायज़ोल -4-यिल) एमिनो के साथ कोशिकाओं के ऊष्मायन के बाद मापा जा सकता है - 2-डीओसी-डी-ग्लूकोज (2-एनबीडीजी) इस एनालॉग के साथ, कुछ समूह रिपोर्ट करते हैं कि एल 6 कोशिकाओं में इंसुलिन का शारीरिक प्रभाव खो गया हैAss = "xref"> 39, जबकि अन्य समूहों ने दिखाया कि इंसुलिन अभी भी ग्लूकोज तेज (मानव प्राथमिक मांसपेशी कोशिकाओं में) 38 को बढ़ाता है। कम जीएलयूटी 4 अभिव्यक्ति के कारण, इंसुलिन की मात्रा का ठहराव सुविख्यात मांसपेशियों की कोशिकाओं में ग्लूकोज तेज गति से विवो शर्तों 6 , 16 की तुलना में कम हो गया है । अन्य तरीकों के माध्यम से सुसंस्कृत मांसपेशी कोशिकाओं के इंसुलिन की प्रतिक्रिया को आगे बढ़ाने के लिए यह आगे महत्वपूर्ण है। इम्युनो-डिटेक्शन का उपयोग करते हुए इंसुलिन-सिग्नलिंग मार्ग (जैसे, अटका / पीकेबी और / या जीएसके 3) की प्रमुख प्रोटीनों की फास्फोराइलेशन स्थिति का माप 14 , 21 , 31 का इस्तेमाल किया जा सकता है। एंजाइमिक स्तर पर, ग्लाइकोजन संश्लेषण, ग्लूकोज और / या लिपिड ऑक्सीकरण का मूल्यांकन इंसुलिन 14 , 26 , 31 के साथ और बिना परिस्थितियों में किया जा सकता है। कोई अन्य cel एल प्रकार (चाहे यह इंसुलिन का जवाब देता है या नहीं) सैद्धांतिक रूप से विश्लेषण किया जा सकता है क्योंकि सभी कोशिका सक्रिय रूप से या निष्क्रिय रूप से ग्लूकोज को तेज कर सकती हैं इंसुलिन से प्रेरित कुएं इस प्रकार किसी अन्य उचित उपचार से बदला जा सकता है।

मानव प्राथमिक मायोट्यूब का उपयोग यह दर्शाता है कि मांसल कोशिकाओं को एक भिन्नता राज्य जीएलयूटी 4 प्रोटीन की पर्याप्त अभिव्यक्ति के अनुरूप मिलती है। यदि तैयारी में गैर-मांसपेशी कोशिकाओं या अनिवार्य रूप से मायोबलास्ट हैं, तो इंसुलिन उत्तेजना हालत में ग्लूकोज तेज गति मूलभूत राज्य (आरआईआई बनाम आर बीए ) से अलग नहीं होगी, मुख्य रूप से जीएलयूटी 1 ट्रांसपोर्टर की प्रबलता के कारण।

पेशी सेल प्रसार और भेदभाव को बढ़ावा देने और बढ़ाने के लिए प्राथमिक मांसपेशी कोशिका संस्कृति माध्यम में इंसुलिन को जोड़ा जा सकता है। फिर भी, इंसुलिन को भी पुरानी उत्तेजना में इंसुलिन प्रतिरोध को प्रेरित करने के लिए 40 , 41 ,Class = "xref"> 42 हमारे प्रयोगों में, मानव प्राथमिक मांसपेशियों की कोशिकाओं को केवल कम सीरम के साथ मध्यम बदलाव पर अंतर होता है। हम इस प्रकार इंसुलिन की प्रतिक्रिया के आकलन से पहले पुरानी उत्तेजना से कोशिकाओं को संरक्षित रखने के लिए संस्कृति के दौरान बाहरी इंसुलिन नहीं जोड़ना पसंद करते हैं। अंत में, विधि कई धोने के चरणों की आवश्यकता है। इसलिए, प्लेट से कोशिकाओं को अलग नहीं करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए क्योंकि यह प्राथमिक कोशिकाओं के साथ हो सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखकों ने रेडियोलॉजी सेवा (लियोन-सूद अस्पताल) और उनके वित्तीय सहायता के लिए शौकीन राष्ट्रीय सुसे (एफएनएस) में ऐन चार्री को स्वीकार किया है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human primary muscle cell In house preparation from human skeletal muscle biopsies In house preparation from human skeletal muscle biopsies If not available, use commercial source
Human primary muscle cell Promocell C-12530 Should be cultured with associated media C23060 and C23061
6-well plate Corning 356400 BioCoat Collagen I Multiwell Plates
Ham's F10 Dutscher L0145-500 1 g/L glucose
Glutamine Dutscher X0551-100
penicilin/streptomycin 100x Thermo fisher scientific 15140122
Serum substitute UltroserG Pall France 15950.017 serum substitute in text
DMEM low glucose Dutscher L0064-500 1 g/L glucose
Fetal Calf Serum Eurobio CVFSVF00-01
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Dutscher L0625-500 Contains Mg2+ (0.5 mM) and Ca2+ (0.9 mM)
Insulin solution human Sigma-Aldrich I9278
2-deoxy-D-glucose  Sigma-Aldrich D6134
Albumin bovine euromedex 04-100-812-E
fatty acid-free BSA Roche 10,775,835,001
palmitate Sigma-Aldrich P0500
Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)] PerkinElmer NET328A001MC Specific Activity: 5 - 10 Ci (185-370GBq)/mmol, 1 mCi (37MBq
Cytochalasin B Sigma-Aldrich c2743
PICO PRIAS VIAL 6 mL PerkinElmer 6000192
ultima gold MW CA  PerkinElmer 6013159 scintillation liquid
bêta counter  PerkinElmer 2900TR

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ग्लूकोज अपटेक मापन और इनसुलिन उत्तेजना के प्रति प्रतिक्रिया<em&gt; विट्रो में</em&gt; संवर्धित मानव प्राथमिक म्यूट्यूब्स
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Chanon, S., Durand, C., Vieille-Marchiset, A., Robert, M., Dibner, C., Simon, C., Lefai, E. Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes. J. Vis. Exp. (124), e55743, doi:10.3791/55743 (2017).More

Chanon, S., Durand, C., Vieille-Marchiset, A., Robert, M., Dibner, C., Simon, C., Lefai, E. Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes. J. Vis. Exp. (124), e55743, doi:10.3791/55743 (2017).

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