इस पद्धति में, मानव प्राथमिक मांसपेशी कोशिकाओं को विभेदित मैयोट्यूब प्राप्त करने के लिए इन विट्रो में सुसंस्कृत किया जाता है और ग्लूकोज तेज गति मापा जाता है। हम रेडियोलैलेड [ 3 एच] 2-डीओसी-डी-ग्लूकोज का उपयोग करते हुए बेसल और इंसुलिन-उत्तेजित राज्यों में दरों का अनुमान लगाने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं।
स्केलेटल मांसपेशी स्तनधारियों में सबसे बड़ा ग्लूकोज जमा है और मोटे तौर पर ग्लूकोज होमोस्टैसिस में योगदान देता है। मांसपेशी के ग्लूकोज चयापचय की खोज के लिए समर्पित सभी अध्ययनों के लिए मांसपेशियों की कोशिकाओं की इंसुलिन संवेदनशीलता का आकलन प्रमुख रूप से प्रासंगिक है और चयापचय संबंधी बदलावों को निस्र्पक करते हैं। मांसपेशियों की कोशिकाओं में ग्लूकोज ट्रांसपोर्टर टाइप 4 (ग्लूटा 4) प्रोटीन इंसुलिन के जवाब में प्लाज्मा झिल्ली को स्थानांतरित करते हैं, जिससे सेल में ग्लूकोज की भारी प्रविष्टि हो सकती है। ग्लूकोज तेज की दर बढ़ाने के द्वारा पेशी कोशिकाओं की इंसुलिन का जवाब देने की क्षमता इंसुलिन की मांसपेशियों की कोशिका संवेदनशीलता का आकलन करने के लिए मानक पढ़ाई है। मानव प्राथमिक मायोट्यूब इन विट्रो मॉडल में एक उपयुक्त हैं, क्योंकि कोशिकाओं में दाता phenotype की कई विशेषताएं हैं, जिनमें इंसुलिन संवेदनशीलता शामिल है। यह इन विट्रो मॉडल में भी किसी भी यौगिकों के परीक्षण के लिए उपयुक्त है जो इंसुलिन की प्रतिक्रिया को प्रभावित कर सकता है। विभेदित मायोट्यूब में ग्लूकोज तेज गति का माप प्रतिबिंबित करता हैइंसुलिन संवेदनशीलता
इस पद्धति में, मानव प्राथमिक मांसपेशियों की कोशिकाओं को विभेदित मैयोट्यूब प्राप्त करने के लिए इन विट्रो में सुसंस्कृत किया जाता है, और इंसुलिन उत्तेजना के बिना ग्लूकोज की तेज दरों को मापा जाता है। हम रेडियोलैलेड [ 3 एच] 2-डीओसी-डी-ग्लूकोज ([ 3 एच] 2 डीजी) के उपयोग से निष्क्रिय और सक्रिय ग्लूकोज ट्रांसपोर्ट रेटों को मापने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। सक्रिय बेसल और इंसुलिन से प्रेरित दरों की मात्रा के साथ-साथ उत्तेजना गुना की गणना के लिए गणना पद्धतियां प्रदान की जाती हैं।
स्केलेटल मांसपेशी स्तनधारियों में सबसे बड़ा ग्लूकोज जमा है और मोटे तौर पर ग्लूकोज होमोस्टैसिस में योगदान देता है। यह इंसुलिन उत्तरदायी ऊतक ग्लूकोस तेज की प्राथमिक साइट है जो इंसुलिन उत्तेजना 1 से शुरू हो रहा है।
टाइप 2 मधुमेह में, कंकाल की मांसपेशी सहित कई ऊतकों में इंसुलिन प्रतिरोध मनाया जाता है, और सामान्य रक्त शर्करा की एकाग्रता को ऊपर जाता है। इस प्रकार, इस ऊतक और उसके कोशिकाओं की इंसुलिन संवेदनशीलता के स्तर को निर्धारित करने के लिए यह एक महत्वपूर्ण प्रासंगिकता का है, चाहे उद्देश्य किसी विषय में किसी दोष को चिह्नित करना है या इसे बेहतर बनाने के इरादे से उपचार की दक्षता का मूल्यांकन करना है। मानव या पशु विषयों में, इंसुलिन संवेदनशीलता का आकलन करने के लिए सोने की मानक तकनीक हाइपरिन्सिलिनेमिक-इयूग्लेसेमिक क्लैंप है। 1 9 7 9 में डेफ्रोनो द्वारा प्रस्तुत किया गया और 3 से 4 में संशोधित किया गया , तब विधि पूरे शरीर को मापने की अनुमति देता हैसामान्य रक्त ग्लूकोज एकाग्रता बनाए रखने के लिए इंसुलिन उत्तेजना के तहत ग्लूकोज की दर के रूप में मापा गया एनडी ऊतक इंसुलिन की प्रतिक्रिया।
इंसुलिन संवेदनशीलता की खोज को इन विट्रो मांसपेशी मॉडल में उपयोग करके सेल स्तर पर किया जा सकता है, और ग्लूकोज तेज गति का माप इंसुलिन उत्तेजना 5 , 6 , 7 के लिए कोशिका के जैविक प्रतिक्रिया को मापने के लिए एक कुशल और विश्वसनीय उपकरण है। दरअसल, ग्लूकोज तेज गति इंसुलिन उत्तेजना को सेल जैविक प्रतिक्रिया, अपने रिसेप्टर से जीएलयूटी 4 समृद्ध vesicles के स्थानांतरण के लिए इंसुलिन की बाध्यता से, और इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग और फास्फोरायलेशन कैसकैड्स 8 सहित, मात्रा देता है।
मानव नमूनों के साथ यह मुख्य रूचि है, क्योंकि विभेदित मैयोट्यूब चयापचय गुण सहित दाता phenotype के कई विशेषताएं बनाए रखते हैंमरीज 9 , 10 , 11 , 12 में देखे गए रोग और विकार म्यूट्यूबल्स कंकाल की मांसपेशी 13 , 14 के लिए संरचनात्मक, चयापचय और फेनोटाइपिक समानताएं दिखाती है जिसमें ग्लूकोज ट्रांसपोर्टर 15 की अभिव्यक्ति और सेलुलर इंसुलिन सिग्नलिंग मशीनरी 16 शामिल है । इस प्रकार, प्राथमिक मैयोट्यूब में ग्लूकोज तेज की माप एक दाता की मांसपेशी फेनोटाइप को दर्शाने या मांसपेशी कोशिका में इंसुलिन संवेदनशीलता पर हस्तक्षेप (दवा, पोषण, या शारीरिक गतिविधि) के प्रभाव की जांच करने के लिए प्रासंगिकता है।
इन्सुलिन संवेदनशीलता 17 , 18 को संशोधित करने वाले प्रयोग करते समय सुसंस्कृत मैयोट्यूब पर ग्लूकोज तेज की माप एक विश्वसनीय उपकरण भी है। इन विट्रो में </Em> मॉडल किसी भी यौगिकों के परीक्षण के लिए उपयुक्त है जो इंसुलिन की प्रतिक्रिया में सुधार कर सकता है, या अधिग्रहीत या प्रेरित इंसुलिन प्रतिरोध 19 , 20 , 21 , 22 , 23 को रोकने या रिवर्स कर सकता है।
यहां हम संस्कृति के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं और मानव मैथ्यूबस को अलग करते हैं और सेल ग्लूकोज तेज गति को मापते हैं। यह विधि मानव मांसपेशी पूर्ववर्ती कोशिकाओं के किसी भी स्रोत पर लागू होती है, चाहे वे इन-लैब की तैयारी, सहयोग या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध आपूर्तिकर्ताओं से आते हों। क्रमशः माउस और चूहा उत्पत्ति से क्रमशः सीसी 212 और एल 6 जैसी अमर स्नायविक सेल लाइनों का उपयोग इस प्रोटोकॉल 7 के साथ ग्लूकोज तेज गति के लिए भी किया जा सकता है।
हम रेडियोलैलेड [ 3 एच] 2 डीजी का उपयोग करते हुए बेसल और इंसुलिन-प्रेरित राज्यों में दरों का परिमाण के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। टीवह एक लेबल ग्लूकोज एनालॉग का उपयोग कम प्रारंभिक सामग्री के साथ ग्लूकोज प्रविष्टि के सटीक निर्धारण की अनुमति देता है, प्राथमिक कोशिकाओं के साथ काम करते समय एक सामान्य स्थिति। संशोधित ग्लूकोज अणु चयापचय मार्गों में प्रवेश करने में असमर्थ है, और इस प्रकार, सेल के भीतर जमा होता है, जो कुल सेल रेडियोधर्मिता के जरिये विश्वसनीय मात्रा का आदान-प्रदान करता है। प्रायोगिक स्थितियों में ग्लूकोज ट्रांसपोर्ट इनहिबिटर (cytochalasin B) का उपयोग शामिल है, और इंसुलिन के बिना और बिना मापन किया जाता है यह संयोजन ग्लूकोज सक्रिय प्रविष्टि दर के निर्धारण के साथ-साथ इंसुलिन प्रतिक्रिया सूचकांक के लिए गुना परिवर्तन की गणना भी देता है। विधि एक ऊष्मायन समय के दौरान इंसुलिन की एक खुराक के साथ प्रस्तुत की जाती है, लेकिन प्रोटोकॉल आसानी से खुराक प्रतिक्रिया या समय के पाठ्यक्रम प्रयोगों 12 के लिए संशोधित किया जा सकता है।
ग्लूकोज तेज गति से सेल संस्कृति पर सक्रियणकर्ता या अवरोधकों के परीक्षण के लिए एक महत्वपूर्ण जैविक माप है और यह कि कैसे ग्लूकोज का इस्तेमाल करते हैं और इंसुलिन का जवाब देने के लिए सेल की क्षमता। यहां वर…
The authors have nothing to disclose.
लेखकों ने रेडियोलॉजी सेवा (लियोन-सूद अस्पताल) और उनके वित्तीय सहायता के लिए शौकीन राष्ट्रीय सुसे (एफएनएस) में ऐन चार्री को स्वीकार किया है।
Human primary muscle cell | In house preparation from human skeletal muscle biopsies | In house preparation from human skeletal muscle biopsies | If not available, use commercial source |
Human primary muscle cell | Promocell | C-12530 | Should be cultured with associated media C23060 and C23061 |
6-well plate | Corning | 356400 | BioCoat Collagen I Multiwell Plates |
Ham's F10 | Dutscher | L0145-500 | 1 g/l glucose |
Glutamine | Dutscher | X0551-100 | |
penicilin/streptomycin 100x | Thermo fisher scientific | 15140122 | |
Serum substitute UltroserG | Pall France | 15950.017 | serum substitute in text |
DMEM low glucose | Dutscher | L0064-500 | 1 g/l glucose |
Fetal Calf Serum | Eurobio | CVFSVF00-01 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Dutscher | L0625-500 | Contains Mg2+ (0.5 mM) and Ca2+ (0.9 mM) |
Insulin solution human | Sigma-Aldrich | I9278 | |
2-deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich | D6134 | |
Albumin bovine | euromedex | 04-100-812-E | |
fatty acid-free BSA | Roche | 10,775,835,001 | |
palmitate | Sigma-Aldrich | P0500 | |
Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)] | PerkinElmer | NET328A001MC | Specific Activity: 5-10Ci (185-370GBq)/mmol, 1mCi (37MBq |
Cytochalasin B | Sigma-Aldrich | c2743 | |
PICO PRIAS VIAL 6ml | PerkinElmer | 6000192 | |
ultima gold MW CA | PerkinElmer | 6013159 | scintillation liquid |
bêta counter | PerkinElmer | 2900TR |