I denne metoden dyrkes humane primære muskelceller in vitro for å oppnå differensierte myotubes og glukoseopptakshastigheter måles. Vi gir en detaljert protokoll for å kvantifisere frekvensene i basale og insulinstimulerte tilstander ved bruk av radioaktivt merket [3H] 2-deoksy-D-glukose.
Skjelettmuskulatur er den største glukose innskudd i pattedyr og bidrar i stor grad til glukose homeostase. Vurdering av insulinkänslighet av muskelceller har stor relevans for alle studier dedikert til å undersøke muskelglukosemetabolismen og karakteriserende metabolske endringer. I muskelceller translaterer glukosebærer type 4 (GLUT4) proteiner til plasmamembranen som respons på insulin, slik at massiv innføring av glukose inn i cellen. Muskelcellers evne til å reagere på insulin ved å øke hastigheten på glukoseopptak er en av standardavlesningene for å kvantifisere muskelcellefølsomhet for insulin. Humane primære myotuber er en egnet in vitro- modell, da cellene opprettholder mange egenskaper av donorfenotypen, inkludert insulinfølsomhet. Denne in vitro- modellen er også egnet for test av eventuelle forbindelser som kan påvirke insulinresponsiviteten. Målinger av glukoseopptakshastigheten i differensierte myotubes reflektererInsulinfølsomhet.
I denne metoden dyrkes humane primære muskelceller in vitro for å oppnå differensierte myotubes, og glukoseopptakshastigheter med og uten insulinstimulering måles. Vi gir en detaljert protokoll for å kvantifisere passive og aktive glukosetransporthastigheter ved bruk av radioaktivt merket [3H] 2-deoksy-D-glukose ([ 3 H] 2dG). Beregningsmetoder blir gitt for å kvantifisere aktive basale og insulinstimulerte frekvenser, samt stimuleringsfold.
Skjelettmuskulatur er den største glukose innskudd i pattedyr og bidrar i stor grad til glukose homeostase. Dette insulinresponsive vevet er det primære stedet for glukoseopptaket som utløses av insulinstimulering 1 .
I type 2 diabetes observeres insulinresistens i flere vev, inkludert skjelettmuskulatur, og fører til over normal blodglukosekonsentrasjon. Således er det av stor betydning for å bestemme nivået av insulinfølsomhet for dette vevet og dets celler, enten målet er å karakterisere en defekt i et individ, eller å evaluere effektiviteten av en behandling som har til hensikt å forbedre den. I menneskelige eller dyrefag er gullstandardteknikken for å vurdere insulinfølsomhet hyperinsulinemisk-euglykemisk klemme. Introdusert av DeFronzo i 1979 2 og modifisert siden 3 , 4 da tillater metoden å kvantifisere hele kroppen aNd vev insulinresponsivitet målt som graden av glukose som skal perfusjoneres under insulinstimulering for å opprettholde normal blodglukosekonsentrasjon.
Insulinsensitivitetsutforskning kan også utføres på cellenivå ved bruk av in vitro muskelmodeller, og måling av glukoseopptakshastigheter er fortsatt et effektivt og pålitelig verktøy for å kvantifisere den biologiske responsen til cellen til insulinstimulering 5 , 6 , 7 . Faktisk kvantifiserer glukoseopptaksmåling den cellebiologiske responsen på insulinstimulering, fra bindingen av insulin til dets reseptor til translokasjon av GLUT4-berikede vesikler, og inklusiv intracellulære signalerings- og fosforyleringskaskader 8 .
Dette er av stor interesse med humane prøver, da differensierte myotubes opprettholder mange egenskaper av donorfenotypen, inkludert metabolisk egenskapSymptomer og lidelser observert i pasienten 9 , 10 , 11 , 12 . Myotubene viser strukturelle, metabolske og fenotypiske likheter med skjelettmuskulaturen 13 , 14 , inkludert ekspresjonen av glukosetransportører 15 og det cellulære insulinsignaleringsmaskineri 16 . Målingen av glukoseopptaket i primære myotubes er derfor relevant for å karakterisere en donors muskelfenotype, eller undersøke effekten av en intervensjon (medikament, næring eller fysisk aktivitet) på insulinfølsomheten i muskelcellen.
Måling av glukoseopptak på dyrkede myotubes er også et pålitelig verktøy når du utfører eksperimenter som endrer insulinfølsomhet 17 , 18 . In vitro </Em> -modellen er egnet til test av noen forbindelser som kan forbedre insulinresponsiviteten, eller kunne forhindre eller reversere oppnådd eller indusert insulinresistens 19 , 20 , 21 , 22 , 23 .
Her beskriver vi en detaljert protokoll for kultur og differensiering av humane myotubes og for måling av celleglukoseopptakshastigheter. Metoden gjelder for hvilken som helst kilde til menneskelige muskelprecursorceller, enten de kommer fra in-lab preparater, samarbeid eller kommersielt tilgjengelige leverandører. Immortaliserte muskelcellelinjer, som henholdsvis C2C12 og L6, fra henholdsvis mus og rotte, kan også brukes til glukoseopptaksmåling med denne protokollen 7 .
Vi gir en detaljert protokoll for å kvantifisere frekvensene i basale og insulinstimulerte tilstander ved hjelp av radiomerket [ 3 H] 2dG. THan bruker en merket glukoseanalog tillater nøyaktig bestemmelse av glukoseoppføring med redusert utgangsmateriale, en vanlig tilstand ved arbeid med primære celler. Det modifiserte glukosemolekylet er ikke i stand til å gå inn i metabolske veier, og akkumuleres således i cellen, slik at det tillates pålitelig kvantifisering via total celleradioaktivitet. Eksperimentelle forhold inkluderer bruk av en glukose transportinhibitor (cytokalasin B), og målinger utføres med og uten insulin. Denne kombinasjonen tillater bestemmelse av glukose aktive inngangsrater, samt beregning av foldendring for insulinresponsindeksen. Metoden presenteres med en dose insulin under en enkelt inkubasjonstid, men protokollen kan lett modifiseres for dose respons eller tidskursforsøk 12 .
Glukoseopptak er en viktig biologisk måling for testing av aktivatorer eller inhibitorer på cellekultur og hvordan de påvirker glukosebruk, og cellens evne til å reagere på insulin. Metoden beskrevet her har vist seg å være rask og pålitelig og har blitt mye brukt i mange studier ved bruk av primære myotubes fra friske individer og / eller metabolisk berørte pasienter 6 , 7 , 10 , 12…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne anerkjenner Anne Charrié ved Radiobiology-tjenesten (Lyon-Sud sykehus) og Fond National Suisse (FNS) for økonomisk støtte.
Human primary muscle cell | In house preparation from human skeletal muscle biopsies | In house preparation from human skeletal muscle biopsies | If not available, use commercial source |
Human primary muscle cell | Promocell | C-12530 | Should be cultured with associated media C23060 and C23061 |
6-well plate | Corning | 356400 | BioCoat Collagen I Multiwell Plates |
Ham's F10 | Dutscher | L0145-500 | 1 g/l glucose |
Glutamine | Dutscher | X0551-100 | |
penicilin/streptomycin 100x | Thermo fisher scientific | 15140122 | |
Serum substitute UltroserG | Pall France | 15950.017 | serum substitute in text |
DMEM low glucose | Dutscher | L0064-500 | 1 g/l glucose |
Fetal Calf Serum | Eurobio | CVFSVF00-01 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Dutscher | L0625-500 | Contains Mg2+ (0.5 mM) and Ca2+ (0.9 mM) |
Insulin solution human | Sigma-Aldrich | I9278 | |
2-deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich | D6134 | |
Albumin bovine | euromedex | 04-100-812-E | |
fatty acid-free BSA | Roche | 10,775,835,001 | |
palmitate | Sigma-Aldrich | P0500 | |
Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)] | PerkinElmer | NET328A001MC | Specific Activity: 5-10Ci (185-370GBq)/mmol, 1mCi (37MBq |
Cytochalasin B | Sigma-Aldrich | c2743 | |
PICO PRIAS VIAL 6ml | PerkinElmer | 6000192 | |
ultima gold MW CA | PerkinElmer | 6013159 | scintillation liquid |
bêta counter | PerkinElmer | 2900TR |