Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Glukoseopptaksmåling og respons på insulinstimulering i doi: 10.3791/55743 Published: June 25, 2017

Summary

I denne metoden dyrkes humane primære muskelceller in vitro for å oppnå differensierte myotubes og glukoseopptakshastigheter måles. Vi gir en detaljert protokoll for å kvantifisere frekvensene i basale og insulinstimulerte tilstander ved bruk av radioaktivt merket [3H] 2-deoksy-D-glukose.

Abstract

Skjelettmuskulatur er den største glukose innskudd i pattedyr og bidrar i stor grad til glukose homeostase. Vurdering av insulinkänslighet av muskelceller har stor relevans for alle studier dedikert til å undersøke muskelglukosemetabolismen og karakteriserende metabolske endringer. I muskelceller translaterer glukosebærer type 4 (GLUT4) proteiner til plasmamembranen som respons på insulin, slik at massiv innføring av glukose inn i cellen. Muskelcellers evne til å reagere på insulin ved å øke hastigheten på glukoseopptak er en av standardavlesningene for å kvantifisere muskelcellefølsomhet for insulin. Humane primære myotuber er en egnet in vitro- modell, da cellene opprettholder mange egenskaper av donorfenotypen, inkludert insulinfølsomhet. Denne in vitro- modellen er også egnet for test av eventuelle forbindelser som kan påvirke insulinresponsiviteten. Målinger av glukoseopptakshastigheten i differensierte myotubes reflektererInsulinfølsomhet.

I denne metoden dyrkes humane primære muskelceller in vitro for å oppnå differensierte myotubes, og glukoseopptakshastigheter med og uten insulinstimulering måles. Vi gir en detaljert protokoll for å kvantifisere passive og aktive glukosetransporthastigheter ved bruk av radioaktivt merket [3H] 2-deoksy-D-glukose ([ 3 H] 2dG). Beregningsmetoder blir gitt for å kvantifisere aktive basale og insulinstimulerte frekvenser, samt stimuleringsfold.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Skjelettmuskulatur er den største glukose innskudd i pattedyr og bidrar i stor grad til glukose homeostase. Dette insulinresponsive vevet er det primære stedet for glukoseopptaket som utløses av insulinstimulering 1 .

I type 2 diabetes observeres insulinresistens i flere vev, inkludert skjelettmuskulatur, og fører til over normal blodglukosekonsentrasjon. Således er det av stor betydning for å bestemme nivået av insulinfølsomhet for dette vevet og dets celler, enten målet er å karakterisere en defekt i et individ, eller å evaluere effektiviteten av en behandling som har til hensikt å forbedre den. I menneskelige eller dyrefag er gullstandardteknikken for å vurdere insulinfølsomhet hyperinsulinemisk-euglykemisk klemme. Introdusert av DeFronzo i 1979 2 og modifisert siden 3 , 4 da tillater metoden å kvantifisere hele kroppen aNd vev insulinresponsivitet målt som graden av glukose som skal perfusjoneres under insulinstimulering for å opprettholde normal blodglukosekonsentrasjon.

Insulinsensitivitetsutforskning kan også utføres på cellenivå ved bruk av in vitro muskelmodeller, og måling av glukoseopptakshastigheter er fortsatt et effektivt og pålitelig verktøy for å kvantifisere den biologiske responsen til cellen til insulinstimulering 5 , 6 , 7 . Faktisk kvantifiserer glukoseopptaksmåling den cellebiologiske responsen på insulinstimulering, fra bindingen av insulin til dets reseptor til translokasjon av GLUT4-berikede vesikler, og inklusiv intracellulære signalerings- og fosforyleringskaskader 8 .

Dette er av stor interesse med humane prøver, da differensierte myotubes opprettholder mange egenskaper av donorfenotypen, inkludert metabolisk egenskapSymptomer og lidelser observert i pasienten 9 , 10 , 11 , 12 . Myotubene viser strukturelle, metabolske og fenotypiske likheter med skjelettmuskulaturen 13 , 14 , inkludert ekspresjonen av glukosetransportører 15 og det cellulære insulinsignaleringsmaskineri 16 . Målingen av glukoseopptaket i primære myotubes er derfor relevant for å karakterisere en donors muskelfenotype, eller undersøke effekten av en intervensjon (medikament, næring eller fysisk aktivitet) på insulinfølsomheten i muskelcellen.

Måling av glukoseopptak på dyrkede myotubes er også et pålitelig verktøy når du utfører eksperimenter som endrer insulinfølsomhet 17 , 18 . In vitro 19 , 20 , 21 , 22 , 23 .

Her beskriver vi en detaljert protokoll for kultur og differensiering av humane myotubes og for måling av celleglukoseopptakshastigheter. Metoden gjelder for hvilken som helst kilde til menneskelige muskelprecursorceller, enten de kommer fra in-lab preparater, samarbeid eller kommersielt tilgjengelige leverandører. Immortaliserte muskelcellelinjer, som henholdsvis C2C12 og L6, fra henholdsvis mus og rotte, kan også brukes til glukoseopptaksmåling med denne protokollen 7 .

Vi gir en detaljert protokoll for å kvantifisere frekvensene i basale og insulinstimulerte tilstander ved hjelp av radiomerket [ 3 H] 2dG. THan bruker en merket glukoseanalog tillater nøyaktig bestemmelse av glukoseoppføring med redusert utgangsmateriale, en vanlig tilstand ved arbeid med primære celler. Det modifiserte glukosemolekylet er ikke i stand til å gå inn i metabolske veier, og akkumuleres således i cellen, slik at det tillates pålitelig kvantifisering via total celleradioaktivitet. Eksperimentelle forhold inkluderer bruk av en glukose transportinhibitor (cytokalasin B), og målinger utføres med og uten insulin. Denne kombinasjonen tillater bestemmelse av glukose aktive inngangsrater, samt beregning av foldendring for insulinresponsindeksen. Metoden presenteres med en dose insulin under en enkelt inkubasjonstid, men protokollen kan lett modifiseres for dose respons eller tidskursforsøk 12 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Fremstilling av cellekulturmedier og -løsninger

  1. Fremstilling av kulturmedier
    1. Klargjør proliferasjonsmedium (PM) ved å supplere Hams F-10 medium med glutamin (2 mM), penicillin / streptomycin (5 μg / ml endelige), 2% føtalt kalvserum (FCS) og 2% serumsubstitutt.
    2. Forbered differensieringsmedium (DM) ved å supplere Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) med glutamin (2 mM), penicillin / streptomycin (5 μg / mL endelige) og 2% FCS.
  2. Fremstilling av glukoseopptaksløsninger
    Forsiktig: Håndtering av radioaktivt materiale er kun tillatt i et begrenset og kontrollert område av autorisert personell. Material og avfall skal håndteres i henhold til relevante prosedyrer, retningslinjer og lokal lovgivning.
    1. For å klargjøre X-Dulbeccos fosfatbufferte saltvann (X-DPBS), lag en oppløsning av DPBS som inneholder 0,2% (vekt / volum) (sluttkonsentrasjon) bovint serum albUmin (BSA). Filtrer løsningen gjennom et 0,2 μm filter. Oppbevares ved 4 ° C.
    2. For å fremstille kald 2-deoksy-D-glukose (2dG) oppløsning veier 16,4 mg 2dG og oppløses i 10 ml destillert vann for å oppnå en 10 mM løsning. Oppbevares ved 4 ° C.
    3. Tilsett 600 μL kald 2dG og 6 μl radiomerket [ 3 H] 2dG til 5400 μl X-DPBS for å oppnå den radiomerkede 2dG (2dG *) løsningen.
      MERK: Den endelige konsentrasjonen er 1 mM 2dG og merking er 1 μCi / mL.
      1. Legg til side en 20 μl alikvot (TC20) av radioaktivt merket 2dG * løsning.
  3. Fremstilling av inkubasjonsblandinger
    1. For cytokalasin B-blandingen, tilsett 2 μL 20 mM cytokalasin B til 2 ml radiomerket 2dG * løsning.
      MERK: Stamopløsning av cytokalasin B er ved 10 mg / ml i dimetylsulfoksid (DMSO).
    2. For DMSO-blandingen, tilsett 4 μL DMSO til de resterende 4 ml radiomerket 2dG * løsning.

    2. Kultur av humane primære muskelceller

    1. Frø av 6-brønnsplater med menneskelige muskel-satellittceller
      MERK: Bruk internt (se referanse 24 for detaljer) eller kommersielt tilgjengelige humane muskel-satellittceller fra et frosset hetteglass (inneholdende 250.000 celler). Følgende fremgangsmåte er gitt for 250 000 celler for å oppnå en 6-brønnplate som er nødvendig for måling av glukoseopptak i en enkelt tilstand.
      1. Tørk frosne hetteglass med internt 24 eller kommersielle preparater av humane muskel-satellittsceller i forvarmet vann (37 ° C), til bare en liten isblokk forblir i hetteglasset.
      2. Hell direkte inn i et 50 ml plastrør som inneholder 10 ml forvarmet (37 ° C) PM.
      3. Sentrifuger i 5 minutter ved 500 xg og kast supernatanten.
      4. Resuspender cellepellet forsiktig med 18 ml forvarmet PM (for å oppnå 42 000 celler pr3 ml medium). Fordel 3 ml i hver brønn på en 6-brønn plate (9,6 cm 2 ).
        MERK: De seks individuelle brønnene på en plate er pålagt å utføre en duplikatmåling av glukoseopptaket ved følgende forhold: Passiv transportinhibering (brønn 1 og 2), basalhastighet (brønn 3 og 4) og insulinstimulert hastighet (brønner 5 og 6). Gjenta så mange seks brønnplater som forskjellige behandlinger er nødvendig.
      5. Inkuber i standardkulturforhold (37 ° C, 5% CO2) til celler når 90% sammenløp.
        MERK: Dette trinnet tar mellom 48 og 72 timer, avhengig av cellesammenheng. Ikke endre medium under dette trinnet.
    2. Differensiering av muskelceller
      1. Fjern PM (etter 48-72 timer) og erstatt med forvarmet DM (3 mL per brønn). Inkuber ved 37 ° C, 5% C02.
        MERK: Differensiering tar fem dager for å nå en stabil tilstand der cellene er justert og polynukleert. Vanligvis er den primæreMyotubes dyrkes i et 1 g / l glukose medium. For å unngå glukoseutslipp under kulturen, fyll deretter platen med 3 ml medium for å sikre at nok glukose substrat er tilgjengelig for cellene til enhver tid.
      2. Bytt DM-medium hver annen dag.
        MERK: Fra dette punktet er myotubene stabile i opptil 7 dager uten noen vesentlig forandring, og glukoseopptaksmåling kan utføres når som helst.
    3. Behandling av muskelceller (valgfritt)
      MERK: Primære myotubes kan behandles i flere dager for å indusere modifikasjon (legemiddeltest, inhibitorer / aktivatorer av signalvei, etc. ) før insulinstimulering og glukoseopptaksmålinger. Muskelceller kan gis til behandling som kan påvirke insulinfølsomheten, og glukoseopptaksmåling vil kvantifisere denne effekten. For eksempel fremmer inkubering av muskelceller med det mettede fettsyrepalmitatet insulinresistens, og celler viser redusert iNsulin stimulert glukoseopptak.
      1. Tilbered 12 ml DM tilsatt 10% BSA (fettsyrefri) og 0,5 mL palmitat (PALM). Klargjør 12 ml DM tilsatt 10% BSA (fettsyrefri).
      2. Klargjør to 6-brønnsplater med menneskelige primære myotubes, og dyrk dem som beskrevet i avsnitt 2.1 og 2.2 (med 5 dagers differensiering).
      3. På dag 5 vaskes hver brønn med 2 ml PBS. Til en plate, tilsett 2 ml DM som inneholder PALM. Til den andre platen legger du til 2 ml BSA som bare inneholder DM.
      4. Inkuber i 48 timer ved 37 ° C, 5% C02.

    3. Insulinstimulering

    1. Vask differensierte muskelceller to ganger med 2 ml PBS.
    2. Fjern PBS forsiktig og inkuber med 3 ml DM uten FCS i 3 timer (37 ° C, 5% CO2) for serumutarmning.
    3. Bytt media i alle brønner med 3 ml DM uten FCS. Tilsett 100 nM insulin til brønner 5 og 6.
    4. Inkubér menneskelig myotubes kultur for1 time (37 ° C, 5% CO2).

    4. Glukoseopptak

    1. Etter 1 time insulinstimulering, vask brønner to ganger med X-DPBS (1 ml per vask).
    2. Tilsett 1 ml cytokalasin B-blanding til brønnene 1 og 2 og 1 ml DMSO-blanding til brønner 3-6. Inkuber i 15 minutter (37 ° C, 5% CO2). På slutten av inkubasjonen plasserer du platen umiddelbart på is.

    5. Cell Lysis

    1. Vask cellene to ganger med 1 ml iskald PBS.
    2. Lyse cellene i hver brønn med 600 ul 50 mM NaOH. Inkubér på is i 5 minutter og bland forsiktig med sakte omløpshorisont.
      MERK: Hvis lysatet er for viskøst, fortynn med opptil 1,5 ml NaOH.
    3. Bruk en pipette, resuspender og saml cellelysatet.

    6. Bestemmelse av radiomerket glukose

    1. Sett 400 μl av hvert cellelysat i et væskescintillasjonstelt hetteglass. Klargjør et negativt kontroll-hetteglass med 400ΜL av 50 mM NaOH og et positivt kontroll-hetteglass med 20 ul TC20 (fra trinn 1.2.3.1).
    2. Tilsett 4 ml væskescintillasjonsløsning til hvert hetteglass. Lukk hetten og bland hvert hetteglass grundig (1-2 s).
    3. Sett hvert hetteglass i en væskescintillasjonsteller og måler radioaktiviteten i henhold til produsentens instruksjon. Opptakstelling per minutt (CPM) for hvert scintillasjonsflaske i 10 minutter.
      MERK: CPM = "disintegrations per minutt" x "telling effektivitet".

    7. Glukoseopptakshastighet

    1. Bruk det gjenværende lysatet (200 μL, fra trinn 5.2) for å måle proteinkonsentrasjonen. Bestem proteinkonsentrasjonen av hvert cellelysat ved bruk av Bradford 25 eller en ekvivalent metode. Beregn total proteinmengde (Q) i mg for hver brønn.
    2. For å oppnå TC1 (verdien for 1 μl radioaktivt merket 2dG *), divisjon CPM verdien av TC20 med 20.
    3. For hvert hetteglass skal du beregne tHan tar hensyn til glukoseopptaket som følger:
      ligningen
      MERK: R måles i pmol / mg / min. Middel av R for brønner 1 - 2 gir passiv transporthastighet, R p . Middel for R for brønner 3-4 gir basaltall transporthastighet, R bt . Middel av R for brønner 5-6 gir insulinstimulert total transportrate, R det .
      1. Beregn den basale aktive transporthastigheten (R ba ) som følger:
        ligningen
      2. Beregn den insulinstimulerte aktive transporthastigheten (R ia ) som følger:
        ligningen
        MERK: I insulinresponsive celler som myotuber, er glukoseopptakshastigheter vanligvis representert ved tre verdier: R ba , R ia og den felle insulinstimuleringen som R ia / R ba .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

På dag 3 når myoblastene sammenløp ( figur 1A ). Myoblastene på dette stadiet er vanligvis mononukleerte. Medium ble endret og på dag 8 ble differensiering fullført ( figur 1B ) (protokoll avsnitt 2). Etter 5 dager med differensiering er myotubene justert og typisk polynukleert. Humane primære myotubes ble utsatt for en palmitat eller en BSA-eneste behandling før glukoseopptakshastighetsmåling. Celler ble inkubert i 48 timer med palmitat 0,5 mM i BSA (PALM) eller BSA alene (BSA). Insulinstimulering ble utført (protokoll 3) og glukoseopptak ble målt (protokoll 4). Figur 2 viser glukoseopptakshastighet i en kontrolltilstand (BSA) og en behandlingsbetingelse (PALM). Ikke-spesifikk opptak kvantifiseres i myotuber inkubert med cytokalasin B. Basal- og insulinstimulerte glukoseopptakshastigheter kan sammenlignes i BSA og PAL M forhold. Insulin øker signifikant glukose transport i BSA tilstanden (p <0,01). Insulinstimulert glukoseopptakshastighet er signifikant lavere i myotubes behandlet med PALM (p <0,05). Videre kan den humane myotube-cellenes respons på insulin også uttrykkes som foldendring. Figur 3 viser at responsen på insulin er redusert i myotubes behandlet med PALM sammenlignet med kontroll (p <0,05).

Til tross for begrenset ekspresjon av GLUT4-protein i dyrkede myotubes, kan primære muskelceller reagere på insulin med økning i glukoseopptaket ( figur 2 ). Den gjennomsnittlige faltendring som observeres er ~ 1,3, ligner det som ble beskrevet av andre grupper med humane muskelceller 6 , 7 , 10 , 26 ,> 27. Induksjon av insulinresistens i muskelceller med mettet fettsyre er vanligvis beskrevet i mus, rotte og humane muskelceller, og har blitt vist å redusere glukoseopptaket av behandlede muskelceller 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 . Vi utførte palmitat (0,5 mM) inkubering i 48 timer og observert en reduksjon i frekvensen av basal og insulinstimulert glukoseopptak og en reduksjon i insulinfoldendringen som reflekterer insulinresistent tilstand. Inkubasjonstiden som brukes i dette manuskriptet er valgt for å demonstrere den hemmende effekten på glukoseopptaket fullt ut. Kortere inkubasjonstider kan også gi insulinresistens og redusert glukoseopptak 31 , 32 , 33 , 34 . Lavere og dermed flere fysiologiske konsentrasjoner kan benyttes in vitro , så vel som dosisrespons og / eller tidskursforsøk, og sammenligning med effekten av umettede fettsyrer som oleat 29 , 35 .

Figur 1
Figur 1: In Vitro Primær Human Myotubes. Bilder av humane myotubes ved 2 stadier av kultur oppnådd ved bruk av et optisk mikroskop er vist. ( A ) Dag 3 av myoblastkultur ved sammenløp. ( B ) På dag 8 (5 dager med differensiering) er myotubene justert. Skalestang = 200 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.


Figur 2: Effekt av insulinstimulering på glukoseopptakshastighet i humane myotuber under BSA og PALM-forhold. Myotubes ble behandlet med BSA alene eller 0,5 mM PALM i 48 timer. Etter middels forandring og 3 h serumutarmning ble spesifikk glukoseopptakshastighet (i pmol / mg / min) målt i fravær (-) eller i nærværet (+) av insulin (1 time, 100 nM). Data er gjennomsnittlige ± som av fire uavhengige eksperimenter ved bruk av myotubes fra fire forskjellige donorer. #P <0,05 sammenlignet med basalverdien; * P <0,05 sammenlignet med BSA insulinstimuleringsverdien. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3
Figur 3: Brett INsulin respons i BSA og PALM kultur betingelser. Forholdet mellom insulin stimulert på basal glukose transportrate i BSA og PALM forhold. Dette forholdet gir fold-glukoseopptakshastigheten ved insulinstimulering (100 nM). * P <0,05 sammenlignet med BSA tilstand (n = 4). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Glukoseopptak er en viktig biologisk måling for testing av aktivatorer eller inhibitorer på cellekultur og hvordan de påvirker glukosebruk, og cellens evne til å reagere på insulin. Metoden beskrevet her har vist seg å være rask og pålitelig og har blitt mye brukt i mange studier ved bruk av primære myotubes fra friske individer og / eller metabolisk berørte pasienter 6 , 7 , 10 , 12 , 21 , 26 , 27 , 36 , 37 . Med bare en 6-brønnplate kan man få priser i duplikater for total basal transport, basal aktiv transport og insulinstimulert aktiv transport. Disse tre verdiene beskriver fullstendig insulinfølsomheten til de in vitro- dyrkede muskelceller.

2dG-blanding kan tilsettes til alle testede brønner. For cellelys kan volumet av NaOH modifiseres i henhold til celleegenskapene. Når man arbeider med celler som inneholder høye nivåer av fettsyrer, dvs. for meget viskøse lysater, kan volumet av NaOH økes opp til 1,5 ml.

Metoden bruker radioaktivt merket materiale som øker følsomheten til målingen, men krever at protokollen utføres i kontrollerte områder. Materialer og avfall må håndteres i henhold til de lokale sikkerhetsretningslinjene. For ikke-utstyrte laboratorier finnes andre metoder for fargetimetrisk og fluorescenskvantifisering 38 . I ikke-radioaktive analyser kan fluorescensintensitet måles etter inkubering av cellene med en fluorescerende D-glukoseanalog 2- [ N- (7-nitrobenz-2-oksa-1,3-diazol-4-yl) amino] - 2-deoksy-D-glukose (2-NBDG). Med denne analogen rapporterer noen grupper at insulin har mistet sine fysiologiske effekter i L6-cellerAss = "xref"> 39, mens andre grupper viste at insulin fortsatt øker glukoseopptaket (i humane primære muskelceller) 38 . På grunn av lav GLUT4-ekspresjon, blir kvantifisering av insulinstimulert glukoseopptak i dyrkede muskelceller redusert sammenlignet med in vivo- tilstandene 6 , 16 . Det er derfor viktig å ytterligere karakterisere insulinresponsiviteten til de dyrkede muskelceller gjennom andre tilnærminger. Målinger av fosforyleringsstatus for sentrale proteiner fra insulin-signalveien (som Akt / PKB og / eller GSK3) ved hjelp av immundeteksjon kan brukes 14 , 21 , 31 . På enzymatisk nivå kan glykogensyntese, glukose og / eller lipidoksidasjon også vurderes under forhold med og uten insulin 14 , 26 , 31 . Enhver annen cel L-typen (om den reagerer på insulin eller ikke) kan teoretisk analyseres da alle celler kan aktivt eller passivt oppta glukose. De insulinstimulerte brønnene kan således erstattes av enhver annen egnet behandling.

Bruken av menneskelig primær myotube innebærer at muskelceller har nådd en differensieringstilstand i samsvar med nok uttrykk for GLUT4-protein. Hvis preparatet inneholder ikke-muskelceller eller i det vesentlige myoblaster, vil glukoseopptaksvurderingene i insulinstimuleringsbetingelsen ikke være forskjellig fra basal tilstanden (R ia versus R ba ), hovedsakelig på grunn av overhodet av GLUT1-transportør.

Insulin kan legges til det primære muskelcellekulturmediet for å fremme og forbedre muskelcelleproliferasjon og differensiering. Likevel har insulin også vist seg å indusere insulinresistens ved kronisk stimulering 40 , 41 ,Class = "xref"> 42. I våre eksperimenter, skilles menneskelige primære muskelceller bare ved middels forandring med redusert serum. Vi foretrekker derfor ikke å legge til eksternt insulin under kulturen for å bevare cellene fra kronisk stimulering før vurdering av insulinresponsivitet. Endelig krever metoden flere vaske trinn. Derfor må det tas hensyn til ikke å løsne celler fra platen som det kan skje med primære celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne anerkjenner Anne Charrié ved Radiobiology-tjenesten (Lyon-Sud sykehus) og Fond National Suisse (FNS) for økonomisk støtte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human primary muscle cell In house preparation from human skeletal muscle biopsies In house preparation from human skeletal muscle biopsies If not available, use commercial source
Human primary muscle cell Promocell C-12530 Should be cultured with associated media C23060 and C23061
6-well plate Corning 356400 BioCoat Collagen I Multiwell Plates
Ham's F10 Dutscher L0145-500 1 g/L glucose
Glutamine Dutscher X0551-100
penicilin/streptomycin 100x Thermo fisher scientific 15140122
Serum substitute UltroserG Pall France 15950.017 serum substitute in text
DMEM low glucose Dutscher L0064-500 1 g/L glucose
Fetal Calf Serum Eurobio CVFSVF00-01
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Dutscher L0625-500 Contains Mg2+ (0.5 mM) and Ca2+ (0.9 mM)
Insulin solution human Sigma-Aldrich I9278
2-deoxy-D-glucose  Sigma-Aldrich D6134
Albumin bovine euromedex 04-100-812-E
fatty acid-free BSA Roche 10,775,835,001
palmitate Sigma-Aldrich P0500
Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)] PerkinElmer NET328A001MC Specific Activity: 5 - 10 Ci (185-370GBq)/mmol, 1 mCi (37MBq
Cytochalasin B Sigma-Aldrich c2743
PICO PRIAS VIAL 6 mL PerkinElmer 6000192
ultima gold MW CA  PerkinElmer 6013159 scintillation liquid
bêta counter  PerkinElmer 2900TR

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stump, C. S., Henriksen, E. J., Wei, Y., Sowers, J. R. The metabolic syndrome: role of skeletal muscle metabolism. Ann Med. 38, (6), 389-402 (2006).
  2. DeFronzo, R. A., Tobin, J. D., Andres, R. Glucose clamp technique: a method for quantifying insulin secretion and resistance. Am J Physiol. 237, (3), E214-E223 (1979).
  3. Fossum, E., Hoieggen, A., Moan, A., Nordby, G., Kjeldsen, S. E. Insulin sensitivity relates to other cardiovascular risk factors in young men: validation of some modifications of the hyperinsulinaemic, isoglycaemic glucose clamp technique. Blood Press Suppl. 2, 113-119 (1997).
  4. Heise, T., et al. Euglycaemic glucose clamp: what it can and cannot do, and how to do it. Diabetes Obes Metab. 18, (10), 962-972 (2016).
  5. Sell, H., Jensen, J., Eckel, J. Measurement of insulin sensitivity in skeletal muscle in vitro. Methods Mol Biol. 933, 255-263 (2012).
  6. Sarabia, V., Lam, L., Burdett, E., Leiter, L. A., Klip, A. Glucose transport in human skeletal muscle cells in culture. Stimulation by insulin and metformin. J Clin Invest. 90, (4), 1386-1395 (1992).
  7. Sarabia, V., Ramlal, T., Klip, A. Glucose uptake in human and animal muscle cells in culture. Biochem Cell Biol. 68, (2), 536-542 (1990).
  8. Richter, E. A., Hargreaves, M. Exercise, GLUT4, and skeletal muscle glucose uptake. Physiol Rev. 93, (3), 993-1017 (2013).
  9. Gaster, M., Kristensen, S. R., Beck-Nielsen, H., Schroder, H. D. A cellular model system of differentiated human myotubes. Apmis. 109, (11), 735-744 (2001).
  10. Bouzakri, K., et al. Reduced activation of phosphatidylinositol-3 kinase and increased serine 636 phosphorylation of insulin receptor substrate-1 in primary culture of skeletal muscle cells from patients with type 2 diabetes. Diabetes. 52, (6), 1319-1325 (2003).
  11. Scheele, C., et al. Satellite cells derived from obese humans with type 2 diabetes and differentiated into myocytes in vitro exhibit abnormal response to IL-6. PLoS One. 7, (6), e39657 (2012).
  12. Jackson, S., et al. Decreased insulin responsiveness of glucose uptake in cultured human skeletal muscle cells from insulin-resistant nondiabetic relatives of type 2 diabetic families. Diabetes. 49, (7), 1169-1177 (2000).
  13. Aas, V., et al. Are cultured human myotubes far from home? Cell Tissue Res. 354, (3), 671-682 (2013).
  14. Bakke, S. S., et al. Myotubes from severely obese type 2 diabetic subjects accumulate less lipids and show higher lipolytic rate than myotubes from severely obese non-diabetic subjects. PLoS One. 10, (3), e0119556 (2015).
  15. Stuart, C. A., et al. Hexose transporter mRNAs for GLUT4, GLUT5, and GLUT12 predominate in human muscle. Am J Physiol Endocrinol Metab. 291, (5), E1067-E1073 (2006).
  16. Al-Khalili, L., et al. Insulin action in cultured human skeletal muscle cells during differentiation: assessment of cell surface GLUT4 and GLUT1 content. Cell Mol Life Sci. 60, (5), 991-998 (2003).
  17. Tsuka, S., et al. Promotion of insulin-induced glucose uptake in C2C12 myotubes by osteocalcin. Biochem Biophys Res Commun. 459, (3), 437-442 (2015).
  18. Gorbunov, E. A., Nicoll, J., Myslivets, A. A., Kachaeva, E. V., Tarasov, S. A. Subetta Enhances Sensitivity of Human Muscle Cells to Insulin. Bull Exp Biol Med. 159, (4), 463-465 (2015).
  19. Breen, D. M., Sanli, T., Giacca, A., Tsiani, E. Stimulation of muscle cell glucose uptake by resveratrol through sirtuins and AMPK. Biochem Biophys Res Commun. 374, (1), 117-122 (2008).
  20. Pinnamaneni, S. K., Southgate, R. J., Febbraio, M. A., Watt, M. J. Stearoyl CoA desaturase 1 is elevated in obesity but protects against fatty acid-induced skeletal muscle insulin resistance in vitro. Diabetologia. 49, (12), 3027-3037 (2006).
  21. Gastebois, C., et al. Transition from physical activity to inactivity increases skeletal muscle miR-148b content and triggers insulin resistance. Physiol Rep. 4, (17), (2016).
  22. Naimi, M., Tsakiridis, T., Stamatatos, T. C., Alexandropoulos, D. I., Tsiani, E. Increased skeletal muscle glucose uptake by rosemary extract through AMPK activation. Appl Physiol Nutr Metab. 40, (4), 407-413 (2015).
  23. Feng, Y. Z., et al. PPARdelta activation in human myotubes increases mitochondrial fatty acid oxidative capacity and reduces glucose utilization by a switch in substrate preference. Arch Physiol Biochem. 120, (1), 12-21 (2014).
  24. Perrin, L., et al. Human skeletal myotubes display a cell-autonomous circadian clock implicated in basal myokine secretion. Mol Metab. 4, (11), 834-845 (2015).
  25. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  26. Bouzakri, K., et al. Malonyl CoenzymeA decarboxylase regulates lipid and glucose metabolism in human skeletal muscle. Diabetes. 57, (6), 1508-1516 (2008).
  27. Shemyakin, A., et al. Endothelin-1 reduces glucose uptake in human skeletal muscle in vivo and in vitro. Diabetes. 60, (8), 2061-2067 (2011).
  28. Alkhateeb, H., Chabowski, A., Glatz, J. F., Luiken, J. F., Bonen, A. Two phases of palmitate-induced insulin resistance in skeletal muscle: impaired GLUT4 translocation is followed by a reduced GLUT4 intrinsic activity. Am J Physiol Endocrinol Metab. 293, (3), E783-E793 (2007).
  29. Coll, T., et al. Oleate reverses palmitate-induced insulin resistance and inflammation in skeletal muscle cells. J Biol Chem. 283, (17), 11107-11116 (2008).
  30. Gaster, M., Rustan, A. C., Beck-Nielsen, H. Differential utilization of saturated palmitate and unsaturated oleate: evidence from cultured myotubes. Diabetes. 54, (3), 648-656 (2005).
  31. Hage Hassan, R., et al. Endoplasmic reticulum stress does not mediate palmitate-induced insulin resistance in mouse and human muscle cells. Diabetologia. 55, (1), 204-214 (2012).
  32. Haghani, K., Pashaei, S., Vakili, S., Taheripak, G., Bakhtiyari, S. TNF-alpha knockdown alleviates palmitate-induced insulin resistance in C2C12 skeletal muscle cells. Biochem Biophys Res Commun. 460, (4), 977-982 (2015).
  33. Hommelberg, P. P., et al. Palmitate-induced skeletal muscle insulin resistance does not require NF-kappaB activation. Cell Mol Life Sci. 68, (7), 1215-1225 (2011).
  34. Yang, M., et al. Saturated fatty acid palmitate-induced insulin resistance is accompanied with myotube loss and the impaired expression of health benefit myokine genes in C2C12 myotubes. Lipids Health Dis. 12, 104 (2013).
  35. Peng, G., et al. Oleate blocks palmitate-induced abnormal lipid distribution, endoplasmic reticulum expansion and stress, and insulin resistance in skeletal muscle. Endocrinology. 152, (6), 2206-2218 (2011).
  36. Lambernd, S., et al. Contractile activity of human skeletal muscle cells prevents insulin resistance by inhibiting pro-inflammatory signalling pathways. Diabetologia. 55, (4), 1128-1139 (2012).
  37. Nikolic, N., et al. Electrical pulse stimulation of cultured human skeletal muscle cells as an in vitro model of exercise. PLoS One. 7, (3), e33203 (2012).
  38. Hsu, F. L., et al. Antidiabetic effects of pterosin A, a small-molecular-weight natural product, on diabetic mouse models. Diabetes. 62, (2), 628-638 (2013).
  39. Zou, C., Wang, Y., Shen, Z. 2-NBDG as a fluorescent indicator for direct glucose uptake measurement. J Biochem Biophys Methods. 64, (3), 207-215 (2005).
  40. Catalano, K. J., et al. Insulin resistance induced by hyperinsulinemia coincides with a persistent alteration at the insulin receptor tyrosine kinase domain. PLoS One. 9, (9), e108693 (2014).
  41. Liu, H. Y., et al. Insulin is a stronger inducer of insulin resistance than hyperglycemia in mice with type 1 diabetes mellitus (T1DM). J Biol Chem. 284, (40), 27090-27100 (2009).
  42. Renstrom, F., Buren, J., Svensson, M., Eriksson, J. W. Insulin resistance induced by high glucose and high insulin precedes insulin receptor substrate 1 protein depletion in human adipocytes. Metabolism. 56, (2), 190-198 (2007).
Glukoseopptaksmåling og respons på insulinstimulering i<em&gt; I Vitro</em&gt; Dyrket humant primært myotubes
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chanon, S., Durand, C., Vieille-Marchiset, A., Robert, M., Dibner, C., Simon, C., Lefai, E. Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes. J. Vis. Exp. (124), e55743, doi:10.3791/55743 (2017).More

Chanon, S., Durand, C., Vieille-Marchiset, A., Robert, M., Dibner, C., Simon, C., Lefai, E. Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes. J. Vis. Exp. (124), e55743, doi:10.3791/55743 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter