В этом методе человеческие первичные мышечные клетки культивируют in vitro для получения дифференцированных миотубов и измеряют скорости поглощения глюкозы. Мы предоставляем подробный протокол для количественной оценки показателей в базальных и стимулированных инсулином состояниях с использованием радиоактивно меченого [ 3 H] 2-дезокси-D-глюкозы.
Скелетные мышцы являются самым большим содержанием глюкозы у млекопитающих и в значительной степени способствуют гомеостазу глюкозы. Оценка чувствительности к инсулину мышечных клеток имеет большое значение для всех исследований, посвященных изучению метаболизма глюкозы в мышцах и характеризующих метаболические изменения. В мышечных клетках белки транспортера белка глюкозы типа 4 (GLUT4) транслоцируются в плазматическую мембрану в ответ на инсулин, что позволяет массово вводить глюкозу в клетку. Способность мышечных клеток реагировать на инсулин путем увеличения скорости поглощения глюкозы является одним из стандартных показателей для количественной оценки чувствительности мышечных клеток к инсулину. Первичные миотубы человека являются подходящей моделью in vitro , так как клетки поддерживают многие особенности фенотипа донора, включая чувствительность к инсулину. Эта модель in vitro также подходит для тестирования любых соединений, которые могут влиять на чувствительность к инсулину. Измерения скорости поглощения глюкозы в дифференцированных миотубах отражаютЧувствительность к инсулину.
В этом методе человеческие первичные мышечные клетки культивируют in vitro для получения дифференцированных миотубов и измеряют уровни поглощения глюкозы с стимуляцией инсулина и без нее. Мы предоставляем подробный протокол для количественной оценки пассивных и активных скоростей переноса глюкозы с использованием радиоактивно меченой [ 3 H] 2-дезокси-D-глюкозы ([ 3 H] 2dG). Методы расчета предоставляются для количественного определения активных базальных и стимулированных инсулином скоростей, а также сгибания стимуляции.
Скелетные мышцы являются самым большим содержанием глюкозы у млекопитающих и в значительной степени способствуют гомеостазу глюкозы. Эта чувствительная к инсулину ткань является основным участком поглощения глюкозы, вызванным стимуляцией инсулина 1 .
При диабете 2 типа резистентность к инсулину наблюдается в нескольких тканях, включая скелетную мышцу, и приводит к превышению нормальной концентрации глюкозы в крови. Таким образом, очень важно определить уровень чувствительности к инсулину этой ткани и ее клеток, независимо от того, является ли цель характеризовать дефект у субъекта или оценить эффективность лечения, направленного на его улучшение. У людей или животных, метод золотого стандарта для оценки чувствительности к инсулину – это гиперинсулинемико-эвгликемический зажим. Введенный DeFronzo в 1979 году 2 и измененный с 3 , 4, тогда метод позволяет количественно измерить все тело aЙ сыворотке крови, измеряемой как скорость глюкозы, которую нужно перфузировать при стимуляции инсулина для поддержания нормальной концентрации глюкозы в крови.
Исследование чувствительности к инсулину также может быть выполнено на уровне клеток с использованием моделей мышц in vitro , а измерение уровня поглощения глюкозы остается эффективным и надежным инструментом для количественной оценки биологической реакции клетки на стимуляцию инсулина 5 , 6 , 7 . Действительно, измерение поглощения глюкозы количественно оценивает биологическую реакцию клеток на стимуляцию инсулина, от связывания инсулина с его рецептором с транслокацией обогащенных GLUT4 везикул и включая внутриклеточные сигнальные и фосфорилирующие каскады 8 .
Это представляет большой интерес для образцов человека, поскольку дифференцированные миотубы поддерживают многие особенности донорского фенотипа, включая метаболическое свойствоИ нарушениями, наблюдаемыми у пациента 9 , 10 , 11 , 12 . Миотубы демонстрируют структурное, метаболическое и фенотипическое сходство с скелетной мышцей 13 , 14 , включая экспрессию транспортеров 15 для глюкозы и аппаратуру сигнализации клеточного инсулина 16 . Таким образом, измерение поглощения глюкозы в первичных миопутах имеет значение для характеристики фенотипа мышц донора или исследования влияния вмешательства (лекарственного средства, питания или физической активности) на чувствительность к инсулину в мышечной клетке.
Измерение поглощения глюкозы на культивируемых миопутах также является надежным инструментом при проведении экспериментов, которые изменяют чувствительность к инсулину 17 , 18 . В пробирке </Em> подходит для испытаний любых соединений, которые могут улучшить чувствительность к инсулину, или могут предотвратить или обратить вспять приобретенную или индуцированную резистентность к инсулину 19 , 20 , 21 , 22 , 23 .
Здесь мы описываем подробный протокол к культуре и дифференцируем человеческие миотубы и измеряем уровни поглощения глюкозы клеток. Этот метод применим к любому источнику клеток-предшественников мышечных клеток человека, независимо от того, поступают ли они из лабораторных препаратов, совместной работы или коммерчески доступных поставщиков. Иммертизированные линии мышечных клеток, такие как C2C12 и L6, соответственно, из происхождения мыши и крысы, также могут использоваться для измерения поглощения глюкозы с помощью этого протокола 7 .
Мы предоставляем подробный протокол для количественной оценки показателей в базальных и стимулированных инсулином состояниях с использованием радиоактивно меченого [ 3 H] 2dG. TОн использует маркированный глюкозный аналог, позволяющий точно определять введение глюкозы с уменьшенным исходным материалом, обычное условие при работе с первичными клетками. Модифицированная молекула глюкозы неспособна проникать в метаболические пути и, таким образом, накапливается внутри клетки, обеспечивая надежную количественную оценку с помощью полной радиоактивности клеток. Экспериментальные условия включают использование ингибитора транспорта глюкозы (цитохалазин В), а измерения проводятся с инсулином и без него. Эта комбинация позволяет определить уровни активности активного глюкозы, а также расчет изменения смены индекса инсулина. Метод представлен одной дозой инсулина в течение одного времени инкубации, но протокол может быть легко модифицирован для дозозависимых или временных экспериментов 12 .
Поглощение глюкозы является ключевым биологическим измерением для тестирования активаторов или ингибиторов клеточной культуры и того, как они влияют на использование глюкозы, и способность клетки реагировать на инсулин. Описанный здесь метод оказался быстрым и надежным и широко исп…
The authors have nothing to disclose.
Авторы признают Энн Шарри в службе радиобиологии (больница Лион-Сюд) и Фонд «Национальный суис» (FNS) за финансовую поддержку.
Human primary muscle cell | In house preparation from human skeletal muscle biopsies | In house preparation from human skeletal muscle biopsies | If not available, use commercial source |
Human primary muscle cell | Promocell | C-12530 | Should be cultured with associated media C23060 and C23061 |
6-well plate | Corning | 356400 | BioCoat Collagen I Multiwell Plates |
Ham's F10 | Dutscher | L0145-500 | 1 g/l glucose |
Glutamine | Dutscher | X0551-100 | |
penicilin/streptomycin 100x | Thermo fisher scientific | 15140122 | |
Serum substitute UltroserG | Pall France | 15950.017 | serum substitute in text |
DMEM low glucose | Dutscher | L0064-500 | 1 g/l glucose |
Fetal Calf Serum | Eurobio | CVFSVF00-01 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Dutscher | L0625-500 | Contains Mg2+ (0.5 mM) and Ca2+ (0.9 mM) |
Insulin solution human | Sigma-Aldrich | I9278 | |
2-deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich | D6134 | |
Albumin bovine | euromedex | 04-100-812-E | |
fatty acid-free BSA | Roche | 10,775,835,001 | |
palmitate | Sigma-Aldrich | P0500 | |
Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)] | PerkinElmer | NET328A001MC | Specific Activity: 5-10Ci (185-370GBq)/mmol, 1mCi (37MBq |
Cytochalasin B | Sigma-Aldrich | c2743 | |
PICO PRIAS VIAL 6ml | PerkinElmer | 6000192 | |
ultima gold MW CA | PerkinElmer | 6013159 | scintillation liquid |
bêta counter | PerkinElmer | 2900TR |