Summary
Este protocolo describe un método detallado para el cultivo a largo plazo ex vivo y de formación de imágenes en vivo de un disco imaginal Drosophila. Esto demuestra la diferenciación de los fotorreceptores y la rotación ommatidial dentro del período de 10 horas de imágenes en vivo del ojo de disco. El protocolo es simple y no requiere instalación costosa.
Abstract
Imágenes en vivo ofrece la posibilidad de rastrear continuamente los procesos celulares y de desarrollo dinámicos en tiempo real. Drosophila discos imaginales de larvas se han utilizado para estudiar muchos procesos biológicos, tales como la proliferación celular, la diferenciación, el crecimiento, la migración, la apoptosis, la competencia, la señalización célula-célula, y la formación de límite compartimental. Sin embargo, los métodos para el cultivo a largo plazo ex vivo e imágenes en vivo de los discos imaginales no han sido satisfactorios, a pesar de muchos esfuerzos. Recientemente, hemos desarrollado un método para el cultivo a largo plazo ex vivo e imágenes en vivo de los discos imaginales para un máximo de 18 h. Además de utilizar una alta concentración de insulina en el medio de cultivo, una agarosa de bajo punto de fusión también se utilizó para incrustar el disco para evitar que la deriva durante el período de formación de imágenes. Este informe utiliza los discos ojo-antenal como un ejemplo. expresión mδ0.5-GA4 / 4-específica de fotorreceptores R3 se siguió para demostrar que fotorreceptor differenciación y rotación ommatidial pueden ser observados durante un período de formación de imágenes en vivo 10 h. Este es un protocolo detallado que describe este método simple.
Introduction
Los discos imaginales de Drosophila larvas han sido un sistema experimental favorecido para el estudio de una amplia variedad de mecanismos biológicos. Estos discos se invaginan desde el epitelio embrionario y se convierten en estructuras en forma de saco como construido por dos capas epiteliales, peripodial Epitelio (PE) y el disco adecuada (DP) 1, 2. Las células del disco imaginal proliferan y se diferencian progresivamente durante las etapas de larva y pupa y eventualmente se convierten en las estructuras del cuerpo adulto. Debido a la estructura de dos capas plana y simple de los discos imaginales, que son fáciles de observar cuando disecados de larvas. Sin embargo, a pesar de varios esfuerzos de muchos grupos, los métodos actuales para el cultivo a largo plazo de los discos imaginales no han sido satisfactorios. Recientemente hemos desarrollado un método de cultivo que pueda sostener el desarrollo normal de múltiples discos imaginales para un máximo de 18 horas y que permite obtener imágenes en vivo 3 3. El método es simple, y no se requiere aireación especial o circulación del medio.
Uno de los discos imaginales mejor estudiados es el ojo de disco-antenal. El ojo de Drosophila se construye de aproximadamente 800 ommatidia. Cada ommatidium se compone de ocho células fotorreceptoras (R1-R8). En el disco ojo larval, las células fotorreceptoras diferenciar siguiendo el paso de la morfogenética Surco (MF), que barre a través del disco ojo de posterior a anterior 4, 5. Los fotorreceptores en un ommatidium diferencian en secuencia, comenzando con R8, seguido por R2 / R5, R3 / R4, R1 / R6, y R7 6. El ommatidia en el dorsal y VEmitades ntral del disco ojo se someten a una rotación de 90 ° en direcciones opuestas, lo que resulta en quiralidad opuesta 7, 8. El proceso de rotación se produce en dos etapas: primero, una rotación de 45 ° comienza en y se completa en el sexto ommatidia fila detrás de la MF; la segunda rotación de 45 ° se completa en alrededor de fila 16 9, 10. Este estudio utilizó rotación ommatidial, marcado por el R3 / 4-específica mδ0.5-GA4 11, para demostrar la diferenciación celular normal y la dinámica que puede ser observado a través de este método a la cultura y vivir-imagen del disco ojo.
Protocol
Configuración 1. Pre-experimental
- Recoger un huevo de mosca que expresa la proteína verde fluorescente nuclear (GFP) bajo mδ0.5-Gal4 y de cultivo a 25 ° C durante 5 días.
- Microondas 0,7 g de bajo punto de fusión de agarosa en 10 ml de solución salina tamponada con fosfato 1X (PBS) hasta que la agarosa se disuelva completamente. Mantener el gel bajo punto de fusión 0,7% en una incubadora a 37 ° hasta su uso.
- Esterilizar todo el equipo, incluyendo fórceps, tijeras, 42 mm cubreobjetos x 0,17 mm, una placa de punto de vidrio 9-bien, y una cámara de cultivo magnético, con 70% de etanol durante más de 12 h.
- Preparar el medio de cultivo 3: medio Drosophila de Schneider suplementado con 2% de suero bovino fetal (FBS), 0,5% de penicilina-estreptomicina y 1,25 mg / ml de insulina. Para evitar la contaminación, preparar el medio en una campana de cultivo de células. Almacenar el medio de cultivo preparado a 4 ° C y se utiliza dentro de un mes.
- Limpiar la plataforma de disección y el experimentador's manos con etanol al 70% antes de comenzar la disección.
Disección 2. Disco
- Aire seco en todo el equipo de 70% de etanol.
- Seleccione una larva de tercer estadio de un vial mosca. Para evitar la contaminación del vial mosca, lavar la larva en 1x PBS 3x para eliminar los residuos.
- Diseccionar la larva limpiado en 1 ml de medio de cultivo (a temperatura ambiente) en la placa de punto de vidrio 9-bien bajo un microscopio de disección.
- Agarre la larva con un par de pinzas en alrededor de un tercio de la distancia desde el extremo posterior y otros fórceps en el gancho de la boca. Tire de las dos pinzas en direcciones opuestas para liberar los tejidos internos.
- Retire las glándulas salivales, la grasa corporal, y la cutícula del complejo ojo-cerebro en el gancho de la boca. Si el cordón nervioso ventral está todavía conectado, se corta con tijeras.
- Utilice un par de pinzas para agarrar el gancho de la boca y un par de fórceps para retirar una pieza de tejido que connects los cerebros y discos de los ojos en la parte dorsal.
NOTA: Si no se elimina este tejido, los dos discos de ojo-antenal estarán cerca uno del otro y el cerebro. Los discos de los ojos entonces no estar planos sobre el cubreobjetos porque este tejido, el cerebro, y el disco de ojo-antenal formarán un triángulo. - Girar todo el complejo a una posición ventral hacia arriba. Retire el filamento que conecta el gancho o el disco al cerebro.
NOTA: Si no se elimina el filamento, el disco ojo-antenal se dividirá en dos piezas cuando se retira el gancho de la boca.- Retire el gancho de la boca. Tenga cuidado de no dañar el ojo de disco durante el proceso.
NOTA: El disco ojo es ahora libre en el medio y sólo conectado a cerebro por el tallo óptico.
- Retire el gancho de la boca. Tenga cuidado de no dañar el ojo de disco durante el proceso.
3. montaje
- Aire seco y montar los componentes de la cámara con un 42 mm x 0,17 mm cubreobjetos. Adjuntar una doble capa de juntas tóricas para el centro de la hoja de la cubierta para mantener ºe agarosa.
- Montar la cámara con cubreobjetos. Ponga la 42 mm x 0,17 mm cubreobjetos sobre el aceptor etapa. Coloque la junta tórica de silicio sobre la hoja de la cubierta. Coloque la base. Bloquear el armario de sellado y colocar la cubierta (Figura 1).
- transferir cuidadosamente el complejo ojo-cerebro diseccionado al centro de la junta tórica usando una micropipeta 20! l con una punta de 10-200 l.
- Eliminar la mayor parte del medio y añadir 12 l de 0,7% de agarosa de bajo punto de fusión (a 37 ° C) a la muestra.
NOTA: La posición del ojo de disco puede ser cambiada con unas pinzas antes de la solidificación de la agarosa. La agarosa se solidificará dentro de 5 min.- Añadir 1 ml de medio de cultivo a temperatura ambiente al centro de la junta tórica; cada junta tórica puede cargar hasta 4 muestras. Asegúrese de que la agarosa se pega a la junta tórica para evitar la deriva de la muestra.
NOTA: No se aireación o circulación del medio es necesario.
- Añadir 1 ml de medio de cultivo a temperatura ambiente al centro de la junta tórica; cada junta tórica puede cargar hasta 4 muestras. Asegúrese de que la agarosa se pega a la junta tórica para evitar la deriva de la muestra.
4. Microscopía Confocal
- Coloque la cámara sobre la platina de un microscopio confocal invertido durante 30 minutos para equilibrar la temperatura. Esto puede evitar que la deriva del eje Z durante la formación de imágenes.
- Antes de imágenes en vivo a largo plazo, puede comprobar si el tejido está intacto por diferencial microscopía de contraste de interferencia.
- Para evitar la fototoxicidad, utilice una fuente de láser por debajo de 2 mW. Utilice un objetivo de 40X para la imagen.
- Adquirir 62 micras imágenes Z en pila en 12 min en un intervalo óptico de 1 m. Adquirir 40 ciclos de exploraciones en un total de 10 h. Asegúrese de que cada ciclo contiene 12 min de formación de imágenes y 3 min de reposo.
Representative Results
En este ejemplo, los fotorreceptores R3 / R4 se marcaron con mδ0.5-GA4 para monitorizar la diferenciación de los fotorreceptores. mδ0.5-GA4 impulsa fuerte expresión en R4 y la expresión más débil en R3 11, por lo que es un excelente marcador para R3 y R4, así como para el proceso de rotación ommatidial. En la película 1, R3 y R4 se marcaron con GFP. Al comienzo de la 10 h sesión de formación de imágenes en vivo, había 8 filas de grupos ommatidial (Figura 2A y de película 1) y 14 filas de grupos ommatidial en el extremo (Figura 2B). La tasa de diferenciación ommatidial fue de 1,67 h por fila, que está cerca de la velocidad de 1,5-2 h / fila de discos en vivo 7, 8, 9, 10, 11,s = "xref"> 12, 13, 14. Sobre la base de las posiciones relativas de R3 y R4, rotación ommatidial ocurrió en el disco ex vivo se cultivaron durante de imágenes en vivo (Figura 2A 'A '', B', y B ''). Un clúster sola R3 / R4 se marcó con una esfera blanca en el primer fotograma de la película 2. En el principio, el eje R3 / R4 parece ser perpendicular al ecuador (Figura 2C y Película 2). A continuación, parece girar 15 °, 30 °, y 45 ° en 3 (Figura 2C '), 6 (Figura 2C ''), y 9 (Figura 2C ''') h, respectivamente. Estos datos sugieren que este método puede sostener la diferenciación de los fotorreceptores durante la proyección de imagen en directo 10 h.
Figure 1: Diagrama esquemático de conjunto de la cámara. Diagrama esquemático del conjunto de la cámara: (1) Coloque el cubreobjetos unido-O-ring de doble capa en el aceptor etapa. (2) Colocar la junta tórica de silicio sobre la hoja de la cubierta. (3) Colocar la base. (4) Bloquear el armario de sellado. (5) Cargar la muestra en el centro de la junta tórica y coloque la cubierta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: imágenes en vivo de R3 / R4 Diferenciación y Rotación. R3 / R4 marcado con mδ0.5-Gal4 expresando-forma nuclear GFP durante 10 h de formación de imágenes en vivo. Todas las figuras se capturaron a partir de la película 1. (A) La imagen captada por el principio. (
Película 1:rce.jove.com/files/ftp_upload/55748/Movie_1.avi" target = '_ blank'> Haga clic aquí para descargar esta película.
Película 1: Haga clic aquí para descargar esta película.
Discussion
En este estudio, proporcionar un protocolo detallado para un experimento de imágenes en vivo a largo plazo en los discos imaginales de Drosophila. Pasamos mucho tiempo practicando la disección cuidadosa para evitar el daño del disco y para permitir la fijación del disco cerca de los cubreobjetos. Tratamos de poli-L-lisina (PLL) y bajo punto de fusión de agarosa para mantener el tejido; al final, la agarosa de bajo punto de fusión mostró una mejor capacidad para mantener el tejido. Aunque se usó sólo el ojo disco en el presente documento para demostrar la ocurrencia normal de la diferenciación de los fotorreceptores y la rotación ommatidial durante el período de formación de imágenes en vivo 10 h, este método también se puede aplicar a al menos otro disco, el disco del ala, como se demuestra en una 3 estudio previo. Por otra parte, la preparación de medio de cultivo y la configuración de imágenes en vivo son simples y no requieren aireación o circulación del medio.
imágenes en vivo continua puede proporcionar una clara secuencia temporal de la víspera biológicaNTS. En nuestro informe anterior de la diferenciación de células gliales y la migración en el ojo de disco, hemos proporcionado una prueba directa de que la glía envolver diferencian de glía existente después de migrar a la parte anterior del ojo disco 3. Cultivo a largo plazo ex vivo permite el etiquetado por láser activado específica de células, como la foto-conversión de la proteína fluorescente KAEDE, a seguir sus comportamientos 3. También puede acomodar el ensayo de productos químicos que se añaden directamente al medio de cultivo; Por lo tanto, se puede utilizar como una plataforma de cribado de fármacos. Dado que algunos proceso dinámico se produce en cuestión de minutos o segundos, se requiere una alta resolución temporal. Para mejorar la resolución temporal, microscopía de lámina de luz 15, 16 o girando la microscopía disco 17 puede ser una buena opción.
La condición de la cultura actual no es perfecto. No es compatible con el crecimiento del disco. p celularroliferation sólo se admite para un máximo de 12 h 3. Después de 12 h en cultivo ex vivo, la tasa de diferenciación de los fotorreceptores comienza a disminuir 3. Esto puede ser debido a la falta de ciertos nutrientes u hormonas. Dado que la principal diferencia en este medio de cultivo es la alta concentración de la insulina, la insulina de mamífero puede ser parcialmente imitando la función de los péptidos endógenos similares a la insulina. La adición de extracto de mosca, el insecto trehalosa azúcar en la sangre, y diversas concentraciones de la hormona de la muda 20 hidroxiecdisona, no fueron beneficiosos 3. Sin embargo, el periodo de cultivo de 12-18 h es suficiente para estudiar muchos procesos de desarrollo. Métodos de cultivo alternativos para el cultivo de discos imaginales larvas se han comparado 3, y nuestra condición de cultivo y de imagen proporciona la ventana de tiempo más largo y claridad para imágenes en vivo. Aunque los discos dentro de larvas vivas y pupas se pueden visualizar directamente18, 19, 20, 21, 22, la ventana de resolución y el tiempo para las observaciones son limitados. Late larvas y pupas discos pueden cultivarse durante mucho tiempo 23, 24, pero los discos se someten a la morfogénesis significativo. Para aprovechar las ventajas de los discos de larvas planas, 2D, nuestro método de cultivo y la imagen es la mejor solución hasta el momento.
Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Estamos muy agradecidos a Chun-lan Hsu y Yu-Chi Yang para la preparación de la comida marcha y el mantenimiento de las poblaciones de moscas, y para Su-Ping Lee y el IMB Imaging Core por su ayuda con la microscopía confocal. Este estudio fue apoyado por becas a YHS (NSC 101-2321-B-001 -004, NSC 100-2321-B-001 -012, NSC 102 a 2321-B-001 -002, MOST 103 a 2311-B-001 -035 -MY3) del Consejo Nacional de Ciencia y el Ministerio de Ciencia y Tecnología de la República de China.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low-melting agarose | AMRESCO | 0815-25G | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | AMRESCO | 0780-2PK | |
| 42 mm x 0.17 mm cover slips | PST | G401-42 | |
| Schneider’s Drosophila medium | Thermo | 21720-024 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F9665 | |
| Penicillin-streptomycin | GIBCO | 759 | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Culture chamber | PECON | POC-R2 Cell Cultivation System | |
| 40X objective | C-Apochromat 40X/1.2W Korr objective | ||
| Fly strain:nls.GFP | Bloominggton | 4775 |
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