Summary
Denne protokol beskriver en detaljeret metode til den langsigtede ex vivo kultur og levende billeder af en Drosophila imaginal disk. Det viser fotoreceptordifferentiation og ommatidial rotation inden for 10 timer periode af levende billeddannelse af øjet disken. Protokollen er enkel og kræver ikke dyre opsætning.
Abstract
Live-billedbehandling giver mulighed for løbende at spore dynamiske cellulære og udviklingsprocesser i realtid. Drosophila larval imaginalskiver er blevet anvendt til at undersøge mange biologiske processer, såsom celleproliferation, differentiering, vækst, migration, apoptose, konkurrence, celle-cellesignalering, og kompartmental grænse formation. Imidlertid har metoder til langsigtet ex vivo kultur og levende billeder af de imaginalskiver ikke været tilfredsstillende, trods mange anstrengelser. For nylig har vi udviklet en metode til den langsigtede ex vivo kultur og levende billeder af imaginalskiver i op til 18 timer. Ud over at anvende en høj koncentration af insulin i dyrkningsmediet, blev en lav-smeltende agarose også til at integrere disken for at forhindre det i at glide under billeddannelse periode. Denne rapport benytter øjet-antennal diske som eksempel. Fotoreceptor R3 / 4-specifik mδ0.5-GA4 ekspression blev fulgt for at vise, at fotoreceptorer differenkan observeres dybde og kan og ommatidial rotation i løbet af en 10 timer direkte billedvisning periode. Dette er en detaljeret protokol, der beskriver denne simple metode.
Introduction
Drosophila larval imaginalskiver har været et yndet forsøgssystem til undersøgelse af en lang række biologiske mekanismer. Disse diske invaginere fra den embryoniske epitel og blive sac-lignende strukturer bygget op af to epiteliale lag, Peripodial epitel (PE) og Disc Korrekt (DP) 1, 2. De imaginal disc prolifererer og progressivt differentiere under larve- og puppe stadier og i sidste ende udvikle sig til den voksne krop strukturer. På grund af den flade og enkel tolagsstruktur af imaginalskiver de er lette at observere, når dissekeret fra larver. Men på trods af flere indsats fra mange grupper, de nuværende metoder til langsigtet kultur af de imaginalskiver har ikke været tilfredsstillende. Vi har for nylig udviklet en kultur metode, der kan opretholde den normale udvikling af flere imaginalskiver i op til 18 timer, og som gør det muligt direkte billedvisning 3 3. Fremgangsmåden er enkel, og ingen særlig luftning eller medium cirkulation er påkrævet.
En af de bedst undersøgte imaginalskiver er øjet-antennal disk. Drosophila øje er opbygget af ca. 800 ommatidia. Hver ommatidium består af otte fotoreceptorceller (R1-R8). I larve øje disken, differentiere fotoreceptorceller efter passagen af morphogenetisk Furrow (MF), som fejer hen over øjet disken fra posterior til anterior 4, 5. Fotoreceptorerne i en ommatidium differentiere i rækkefølge, begyndende med R8, efterfulgt af R2 / R5, R3 / R4, R1 / R6 og R7 6. Den ommatidia i ryg og ventral halvdele af øjet skiven gennemgå en 90 ° drejning i modsatte retninger, hvilket resulterer i modsat chiralitet 7, 8. Rotation proces sker i to trin: først en 45 ° drejning begynder på og er afsluttet på det sjette ommatidia række bag MF; den anden 45 ° rotation er afsluttet ved ca. række 16 9, 10. Denne undersøgelse anvendte ommatidial rotation, kendetegnet ved det R3 / 4-specifik mδ0.5-GA4 11, for at demonstrere den normale celledifferentiering og dynamik, der kan observeres gennem denne metode til kultur og leve-image øjet disken.
Protocol
1. Pre-eksperimentel opsætning
- Indsamle en flue æg, der udtrykker det nukleare grønt fluorescerende protein (GFP) under mδ0.5-Gal4 og dyrkning ved 25 ° C i 5 dage.
- Mikroovn 0,7 g lavt smeltende agarose i 10 ml 1x phosphatpufret saltvand (PBS), indtil agarosen er fuldstændigt opløst. Holde 0,7% lavtsmeltende gel i en 37 ° C inkubator indtil anvendelse.
- Sterilisere alt udstyr, herunder pincet, sakse, 42 mm x 0,17 mm dækglas, en 9-brønd glas glasplade, og en magnetisk kultur kammer, med 70% ethanol i mere end 12 timer.
- Forbered dyrkningsmediet 3: Schneiders Drosophila medium suppleret med 2% kalvefosterserum (FBS), 0,5% penicillin-streptomycin og 1,25 mg / ml insulin. For at undgå kontaminering forberedes mediet i en cellekultur hætte. Opbevare det fremstillede dyrkningsmedium ved 4 ° C og anvendt inden for en måned.
- Rengør dissektion platform og forsøgslederen's hænder med 70% ethanol før start dissektion.
2. CD'en Dissektion
- Lufttørre alt udstyr fra 70% ethanol.
- Vælg en tredje stadie larve fra en flue hætteglas. At undgå forurening fra fluen hætteglasset, vaske larve i 1x PBS 3x at fjerne affaldet.
- Dissekere den rensede larve i 1 ml dyrkningsmedium (ved stuetemperatur) i 9-brønd glas glasplade under et dissektionsmikroskop.
- Tage fat i larve med en tang på omkring en tredjedel af vejen fra den bageste ende og en anden tang ved mundingen krog. Træk de to tænger i modsatte retninger for at frigive de indre væv.
- Fjern spytkirtlerne, fedt kroppen og kutikula fra øjet-hjerne-komplekset bundet til munden krog. Hvis den ventrale nerve ledningen stadig er fastgjort, skære det væk med en saks.
- Brug en pincet til at forstå munden krog og en tang til at fjerne et stykke af væv, der connects hjerne og øjne diske i den dorsale del.
BEMÆRK: Hvis dette væv ikke bliver fjernet, vil de to eye-antennal diske være tæt på hinanden og hjernen. Øjet diske vil da ikke ligge fladt på dækglasset fordi dette væv, hjernen, og øjet-antennal skive vil danne en trekant. - Rotere hele komplekset til en ventral-opadgående position. Fjern filamentet, der forbinder krogen eller skive til hjernen.
BEMÆRK: Hvis glødetråden ikke fjernes, vil øjet-antennal disk delt i to stykke når munden krog fjernes.- Fjern munden krog. Pas på ikke at beskadige øjet disken i løbet af processen.
BEMÆRK: Øjet disken er nu fri på mellemlang og kun forbundet til hjernen ved den optiske stilk.
- Fjern munden krog. Pas på ikke at beskadige øjet disken i løbet af processen.
3. Montering
- Lufttør og samle komponenterne i kammeret med en 42 mm x 0,17 mm dækglas. Vedhæfte et dobbelt lag af O-ringe til midten af dækglasset for at holde the agarose.
- Samle kammeret med dækglas. Sætte 42 mm x 0,17 mm dækglas på scenen acceptor. Placer silicium O-ringen på dækglasset. Placer basen. Lås forsegling locker og placere afdækningen (figur 1).
- overføre omhyggeligt dissekeret øje-hjerne-kompleks til midten af O-ring under anvendelse af en 20 pi mikropipette med en 10-200 pi spids.
- Fjernelse af det meste af mediet og tilsæt 12 pi 0,7% lavtsmeltende agarose (ved 37 ° C) til prøven.
BEMÆRK: Positionen af øjet disken kan ændres med pincet før størkningen af agarosen. Agarosen vil størkne inden for 5 min.- Tilsæt 1 ml dyrkningsmedium ved stuetemperatur til midten af O-ringen; hver O-ring kan lægge op til 4 prøver. Sørg for, at agarose er limet til O-ringen for at undgå den drivende af prøven.
BEMÆRK: Ingen luftning eller cirkulation af mediet er nødvendig.
- Tilsæt 1 ml dyrkningsmedium ved stuetemperatur til midten af O-ringen; hver O-ring kan lægge op til 4 prøver. Sørg for, at agarose er limet til O-ringen for at undgå den drivende af prøven.
4. konfokal mikroskopi
- Placer kammeret på scenen af et inverteret konfokal mikroskop i 30 minutter for at ækvilibrere temperaturen. Dette kan forhindre Z-aksen afdrift under billeddannelse.
- Før langsigtet billeddannelse, kontrollere, om vævet er intakt ved differentiel interferens kontrast mikroskopi.
- For at undgå fototoksicitet, bruger en laser magt under 2 mW. Brug en 40X objektiv til billeddannelse.
- Erhverve 62 um Z-stack billeder i 12 minutter ved en optisk interval på 1 um. Erhverve 40 cykler scanninger over en alt 10 timer. Sikre, at hver cyklus indeholder 12 min på billeddannelse og 3 min af hvilende.
Representative Results
I dette eksempel blev R3 / R4 fotoreceptorer mærket med mδ0.5-GA4 at overvåge fotoreceptordifferentiation. mδ0.5-GA4 driver stærk ekspression i R4 og svagere ekspression i R3 11, hvilket gør det til en fremragende R3 og R4 samt til fremgangsmåden ifølge ommatidial rotation. I Movie 1 blev R3 og R4 mærket med GFP. Ved begyndelsen af den 10 timer levende imaging session, der var 8 rækker ommatidial klynger (figur 2A og film 1) og 14 rækker af ommatidial klynger ved udgangen (figur 2B). Hastigheden for ommatidial differentiering var 1,67 timer per række, hvilket er tæt på hastigheden af 1,5-2 h / række i in vivo skiver 7, 8, 9, 10, 11,s = "xref"> 12, 13, 14. Baseret på de relative positioner af R3 og R4, ommatidial rotation opstod i ex vivo dyrkede disk under billeddannelse (figur 2A 'A '', B', og B ''). En enkelt R3 / R4 klynge blev mærket med en hvid kugle i den første ramme i Movie 2. I begyndelsen, vises R3 / R4 akse være vinkelret på ækvator (figur 2C og Movie 2). Det ser således ud til at rotere 15 °, 30 °, og 45 ° i 3 (figur 2C), 6 (figur 2C ''), og 9 (figur 2C '' ') t. Disse data tyder på, at denne metode kan opretholde fotoreceptordifferentiation under 10 timer direkte billedvisning.
FiguAd 1: Skematisk diagram af Afdeling forsamling. Skematisk diagram af kammerets samling: (1) Sæt den dobbeltlags O-ring-bundet dækglas på scenen acceptor. (2) Placer silicium O-ringen på dækglasset. (3) Anbring basen. (4) Lås forsegling skab. (5) Læg prøven i midten af O-ringen og placere dækslet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Levende Imaging af R3 / R4 Differentiering og rotation. R3 / R4 mærket med mδ0.5-Gal4 udtrykkende nuklear-formen GFP i løbet af 10 timer af levende billeddannelse. Alle tallene blev erobret fra Movie 1. (A) Billede taget i begyndelsen. (
Film 1:Rce.jove.com/files/ftp_upload/55748/Movie_1.avi "target =" _ blank "> Venligst klik her for at downloade denne film.
Discussion
I denne undersøgelse, giver vi en detaljeret protokol for en langsigtet direkte billedvisning eksperiment på Drosophila imaginalskiver. Vi har brugt meget tid på at øve omhyggelig dissektion for at undgå disc skader og for at give mulighed for fastgørelse af skiven tæt på dækglas. Vi forsøgte Poly-L-lysin (PLL) og lav-smeltende agarose at holde væv; i sidste ende, den lavtsmeltende agarose viste en bedre evne til at holde vævet. Selv om kun øjet disken blev anvendt i denne at påvise normale forekomst af fotoreceptordifferentiation og ommatidial rotation under den 10 timer direkte billedvisning periode, kan denne fremgangsmåde også anvendes til i det mindste en anden skive, vingen disken, som påvist i en tidligere undersøgelse 3. Desuden dyrkningsmediet forberedelse og levende billedbehandling setup er enkle og ikke kræver luftning eller medium cirkulation.
Kontinuerlig billeddannelse kan give en klar tidsmæssig sekvens af biologisk eveNTS. I vores tidligere rapport af glia differentiering og migration i øjet skive, forudsat vi direkte bevis på, at indpakning glia skelne fra eksisterende glia efter overgangen til den forreste af øjet skive 3. Langsigtet ex vivo kultur muliggør den specifikke laser-aktiverede mærkning af celler, såsom foto-omdannelse af KAEDE fluorescerende protein, at følge deres adfærd 3. Det kan også rumme testning af kemikalier, der tilsættes direkte til dyrkningsmediet; således kan det anvendes som et lægemiddel screening platform. Da nogle dynamisk proces forekomme inden for minutter eller sekunder, høj tidsopløsning påkrævet. For at forbedre den tidsmæssige opløsning, lys ark mikroskopi 15, 16 eller spinning disc mikroskopi 17 kan være en god mulighed.
Den nuværende kultur betingelse er ikke perfekt. Den understøtter ikke disk vækst. Cell pSpaltning understøttes kun i op til 12 timer 3 . Efter 12 timer i ex vivo- kultur begynder hastigheden af fotoreceptor differentiering at falde 3 . Dette kan skyldes manglen på visse næringsstoffer eller hormoner. Da den største forskel i dette dyrkningsmedium er den høje koncentration af insulin, kan pattedyrinsulinet delvis efterligne funktionen af endogene insulinlignende peptider. Tilsætningen af flyveekstrakt, insektblodsukker trehalosen og forskellige koncentrationer af molthormonet 20-hydroxyecdyson var ikke gavnlige 3 . Dog er 12-18 h kulturperioden tilstrækkelig til at studere mange udviklingsprocesser. Alternative kultiveringsmetoder til dyrkning af larve-imaginale diske er blevet sammenlignet 3 , og vores dyrknings- og billedbetingelse giver det længste tidsvindue og mest klarhed for levende billeddannelse. Selvom diske i levende larver og pupper kan billedbeskyttes direkte18, 19, 20, 21, 22, opløsning og tidsvindue for observationer er begrænset. Sent larver og puppe diske kan dyrkes i lang tid 23, 24, men diskene undergår signifikant morfogenese. At drage fordel af de flade, 2D larve diske, vores dyrkning og billedbehandling metode er den bedste løsning indtil videre.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for Chun-lan Hsu og Yu-Chi Yang for at udarbejde fluen mad og opretholde fluen lagre, og til Su-Ping Lee og IMB Imaging Core for deres hjælp med konfokal mikroskopi. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud til YHS (NSC 101-2321-B-001 -004, NSC 100-2321-B-001 -012, NSC 102-2321-B-001 -002, MEST 103-2311-B-001 -035 -MY3) fra National Science Rådet og Ministeriet for Videnskab og Teknologi i Kina.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low-melting agarose | AMRESCO | 0815-25G | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | AMRESCO | 0780-2PK | |
| 42 mm x 0.17 mm cover slips | PST | G401-42 | |
| Schneider’s Drosophila medium | Thermo | 21720-024 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F9665 | |
| Penicillin-streptomycin | GIBCO | 759 | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Culture chamber | PECON | POC-R2 Cell Cultivation System | |
| 40X objective | C-Apochromat 40X/1.2W Korr objective | ||
| Fly strain:nls.GFP | Bloominggton | 4775 |
References
- Cohen, S. M. Imaginal disc development. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez-Arias, A. 2, Cold Spring Harbor. NY. 747-842 (1993).
- Auerbach, C. The development of the legs, wings and halteres in wild type and some mutant strains of Drosophila melanogaster. Proc. R. Soc. Edinb. B. 58, 787-815 (1936).
- Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. Long-term Ex Vivo Culture and Live Imaging of Drosophila Larval Imaginal Discs. PLoS One. 11 (9), e0163744 (2016).
- Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice. Dev Biol. 53 (2), 217-240 (1976).
- Wolff, T., Ready, D. F. The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave. Development. 113 (3), 841-850 (1991).
- Tomlinson, A., Ready, D. F. Neuronal differentiation in Drosophila ommatidium. Dev Biol. 120 (2), 366-376 (1987).
- Wolff, T., Ready, D. F. The Development of Drosophila Melanogaster. , Cold Spring Harbor Press. 1277-1316 (1993).
- Adler, P. N. Planar signaling and morphogenesis in Drosophila. Dev Cell. 2 (5), 525-535 (2002).
- Choi, K. W., Benzer, S. Migration of glia along photoreceptor axons in the developing Drosophila eye. Neuron. 12 (2), 423-431 (1994).
- Strutt, D. I., Mlodzik, M. Ommatidial polarity in the Drosophila eye is determined by the direction of furrow progression and local interactions. Development. 121 (12), 4247-4256 (1995).
- Gaengel, K., Mlodzik, M. Egfr signaling regulates ommatidial rotation and cell motility in the Drosophila eye via MAPK/Pnt signaling and the Ras effector Canoe/AF6. Development. 130 (22), 5413-5423 (2003).
- Li, C., Meinertzhagen, I. A. Conditions for the primary culture of eye imaginal discs from Drosophila melanogaster. J Neurobiol. 28 (3), 363-380 (1995).
- Carthew, R. W. Pattern formation in the Drosophila eye. Curr Opin Genet Dev. 17 (4), 309-313 (2007).
- Treisman, J. E. Retinal differentiation in Drosophila. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (4), 545-557 (2013).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene,, Wittbrodt, F., J,, Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Keller, P. J., Stelzer, E. H. Quantitative in vivo imaging of entire embryos with Digital Scanned Laser Light Sheet Fluorescence Microscopy. Curr Opin Neurobiol. 18 (6), 624-632 (2008).
- Winter, P. W., Shroff, H. Faster fluorescence microscopy: advances in high speed biological imaging. Curr Opin Chem Biol. 20, 46-53 (2014).
- Bosveld, F., et al. Mechanical Control of Morphogenesis by Fat/Dachsous/Four-Jointed Planar Cell Polarity Pathway. Science. 336 (6082), 724-727 (2012).
- Ghannad-Rezaie, M., Wang, X., Mishra, B., Collins, C., Chronis, N. Microfluidic Chips for In Vivo Imaging of Cellular Responses to Neural Injury in Drosophila Larvae. Plos One. 7 (1), (2012).
- Heemskerk, I., Lecuit, T., LeGoff, L. Dynamic clonal analysis based on chronic in vivo imaging allows multiscale quantification of growth in the Drosophila wing disc. Development. 141 (11), 2339-2348 (2014).
- Taylor, J., Adler, P. N. Cell rearrangement and cell division during the tissue level morphogenesis of evaginating Drosophila imaginal discs. Dev Biol. 313 (2), 739-751 (2008).
- Ward, R. E., Reid, P., Bashirullah, A., D'Avino, P. P., Thummel, C. S. GFP in living animals reveals dynamic developmental responses to ecdysone during drosophila metamorphosis. Dev Biol. 256 (2), 389-402 (2003).
- Gibbs, S. M., Truman, J. W. Nitric oxide and cyclic GMP regulate retinal patterning in the optic lobe of Drosophila. Neuron. 20 (1), 83-93 (1998).
- Fristrom, J. W., Logan, W. R., Murphy, C. Synthetic and Minimal Culture Requirements for Evagination of Imaginal of Drosophila-Melanogaster in-Vitro. Dev Biol. 33 (2), 441-456 (1973).
