Summary
이 프로토콜은 장기적인 ex vivo 배양과 Drosophila imaginal disc의 라이브 영상에 대한 상세한 방법을 설명합니다. 눈 디스크의 10 시간의 라이브 영상에서 광 수용체의 분화 및 구강 내 회전을 보여줍니다. 이 프로토콜은 간단하며 값 비싼 설정이 필요하지 않습니다.
Abstract
라이브 영상은 지속적으로 실시간으로 동적 인 세포 및 발달 과정을 추적 할 수있는 기능을 제공합니다. 초파리 애벌레 성충 디스크는 같은 세포 증식, 분화, 성장, 이동, 세포 사멸, 경쟁, 세포 - 세포 신호 및 구획되지 경계 형성에 많은 생물학적 과정을 연구하는 데 사용되었다. 그러나, 장기적으로 체외 문화와 성충 디스크의 라이브 이미징을위한 방법은 많은 노력에도 불구하고, 만족되지 않았습니다. 최근에, 우리는 장기 체외 문화와 최대 18 시간 동안 성충 디스크의 라이브 영상을위한 방법을 개발했다. 배지에서 높은 인슐린 농도를 사용하는 것 외에도, 저 융점 아가로 오스는 촬상 기간 표류 것을 방지하기 위해 디스크를 삽입 하였다. 이 보고서는 예제로 눈 더듬이 디스크를 사용합니다. 감광체 R3 / 4 특정 mδ0.5-GA4 발현 differen 그 감광체를 입증 하였다tiation 및 ommatidial 회전은 10 시간 라이브 영상 기간 동안 관찰 할 수있다. 이것은 간단한 방법을 기술하는 상세한 프로토콜이다.
Introduction
초파리 애벌레 성충 디스크는 생물학적 메커니즘의 다양한 연구에 대한 선호 실험 시스템이었다. 이러한 디스크는 두 상피 층에 의해 구축 SAC 형상 구조 배아 상피에서와 invaginate되고, Peripodial 상피 (PE)과 적절한 디스크 (DP) (1, 2). 성충 디스크 세포가 증식하고 점진적으로 애벌레와 번데기 단계에서 차별화하고 결국 성인 신체 구조로 개발한다. 성충 인해 디스크의 평탄 단순한 2 층 구조로, 그들은 유충 해부시 관찰하기 쉽다. 그러나, 많은 단체의 여러 노력에도 불구하고, 성충 디스크의 장기적인 문화에 대한 현재의 방법은 만족되지 않았습니다. 우리는 최근에 최대 18 시간 동안 여러 성충 디스크의 정상적인 발전을 지속 할 수있는 배양 방법을 개발하고 라이브 영상 3 수 (3)의 높은 농도이다. 방법은 간단하고, 특별한 포기 또는 매체 순환이 필요하지 않습니다.
가장 잘 연구 된 성충 디스크 중 하나는 눈 더듬이 디스크입니다. 초파리의 눈은 약 800 ommatidia, 개안을 구축한다. 각 개안 8 개의 시각 세포 (R1-R8)로 구성된다. 애벌레 눈 디스크에서, 광 수용체 세포 (4, 5)을 전방에서 후방에 눈 디스크를 가로 질러 밭고랑 형태 발생 (MF)의 통과에 따라 차별화. 개안의 감광체 R2 / R5, R3 / R4, R1 / R6, R7 및 R8 (6) 다음에, 시작하여 순차적으로 구별. 등쪽의 ommatidia, 개안 및했습니다눈 디스크 ntral 반쪽 반대 키랄성 7, 8의 결과로, 반대 방향으로 90 ° 회전을 겪는다. 회전 공정은 두 단계로 발생한다 : 먼저, 45 ° 회전에서 시작하고 MF 뒤에 여섯째 ommatidia, 개안 행에서 완성된다; 제 45 ° 회전을 행 16 9, 10에 대해 완료된다. R3 리 / 4 특정 mδ0.5 GA4-11로 표시 ommatidial 회전 사용이 연구는, 배양이 방법을 통해 관찰 될 수있는 정상 세포 분화 및 역학을 설명하며 눈 디스크 이미지를 살.
Protocol
1. 사전 실험 설정
- 5 일간 25 ° C에서 비행 mδ0.5-GAL4에서 핵 녹색 형광 단백질 (GFP)을 표현 계란과 문화를 수집합니다.
- 마이크로파 아가 1X 인산 완충 생리 식염수 10 mL를 아가로 오스가 완전히 용해 될 때까지 (PBS)에 저 융점의 0.7 g. 37 ° C의 배양기에서 사용할 때까지 0.7 % 저 융점 겔 유지.
- 12 시간 이상 동안 70 % 에탄올 핀셋, 가위 42 mm X 0.17 mm의 커버 슬립, 9 웰 유리 스폿 판 및 자기 배양 챔버를 포함한 모든 장비, 소독.
- 2 % 태아 소 혈청 (FBS), 0.5 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 및 1.25 ㎎ / ㎖의 인슐린 보충 슈나이더의 초파리 배지 : 배양액 (3)을 준비한다. 오염을 방지하기 위해, 세포 배양 후드 매체를 준비합니다. 4 ° C에서 준비된 배지를 저장하고 한 달 내에 사용.
- 해부 플랫폼과 실험을 '청소해부를 시작하기 전에의 70 % 에탄올 손을.
2. 디스크 해부
- 공기는 70 % 에탄올에서 모든 장비를 건조.
- 비행 병에서 세 번째 령 유충을 선택합니다. 플라이 병의 오염을 방지하기 위해, 폐기물을 제거하는 1X PBS 배의 유충을 씻는다.
- 해부 현미경 9 웰 유리 스폿 접시 (RT시) 배지 1 ㎖에서 세정 유충 해부.
- 약 후방 단부로부터 제 3 방법 입 후크 또 다른 겸자 집게에 한 쌍의 유충을 잡고. 내부 조직을 분리 반대 방향으로 두 개의 집게를 당긴다.
- 입 후크에 부착 된 눈 - 뇌 단지에서 침샘, 지방 본문 및 표피를 제거합니다. 복부 신경 코드가 여전히 연결되어있는 경우, 가위를 버려야.
- 공동 조직의 조각을 제거하기 위해 입 후크와 포셉 한 쌍을 파악 포셉 한 쌍을 사용하여지느러미 부분의 머리와 눈 디스크 nnects.
참고 :이 조직이 제거되지 않으면, 두 눈 더듬이 디스크는 서로 뇌에 가까운 것입니다. 이 조직, 뇌 및 눈 더듬이 디스크가 삼각형을 형성하기 때문에 눈 디스크는 다음의 coverslip에 평평하게 거짓말을하지 않습니다. - 복부 - 상승 위치로 완전히 착물을 돌린다. 뇌에 후크 또는 디스크를 연결하는 필라멘트를 제거합니다.
참고 : 필라멘트가 제거되지 않으면 입 후크가 제거 될 때, 눈-더듬이 디스크가 두 조각으로 분할됩니다.- 입 후크를 제거합니다. 과정에서 눈 디스크를 손상되지 않도록주의하십시오.
참고 : 아이 디스크가 현재 매체에서 무료 만 광학 줄기에 의해 뇌에 연결되어 있습니다.
- 입 후크를 제거합니다. 과정에서 눈 디스크를 손상되지 않도록주의하십시오.
3. 장착
- 공기 건조와 42 mm X 0.17 mm의 커버 슬립으로 챔버의 부품을 조립한다. 제를 유지하는 커버 슬립의 중심 O 링의 이중층을 연결전자 아가로 오스.
- coverslip에와 챔버를 조립합니다. 무대 수용체에 42 mm X 0.17 mm coverslip에 넣습니다. 커버 슬립에 실리콘 O 링을 배치. 베이스를 놓습니다. 밀봉 잠금 로커 커버 (도 1)를 배치했다.
- 조심스럽게 10-200 μL 팁에 20 μL의 마이크로 피펫을 이용하여 O 링의 중심에 눈 해부 뇌 복잡한 옮긴다.
- 매체의 대부분을 제거하고, 샘플 (37 ° C에서) 0.7 % 저 융점 아가로 오스 12 μL를 추가한다.
참고 : 눈 디스크의 위치는 아가로 오스의 응고되기 전에 집게로 변경 될 수 있습니다. 아가는 5 분 내에 응고된다.- O 링의 중심을 실온에서 1 ㎖의 배지에 추가; 각 O 링 (4 개)의 샘플까지 넣을 수있다. 아가로 오스는 샘플의 표류를 방지하기 위해 O 링에 접착되어 있는지 확인합니다.
주 : 매체의 어떠한 포기 또는 순환이 필요하지 않습니다.
- O 링의 중심을 실온에서 1 ㎖의 배지에 추가; 각 O 링 (4 개)의 샘플까지 넣을 수있다. 아가로 오스는 샘플의 표류를 방지하기 위해 O 링에 접착되어 있는지 확인합니다.
4. 공 초점 현미경
- 온도 평형을 30 분 동안 반전 공 초점 현미경의 스테이지에 배치 챔버. 이 이미징 동안 Z 축 드리프트를 방지 할 수 있습니다.
- 장기 라이브 영상 전에 조직 미분 간섭 대비 현미경에 의한 손상 여부를 확인.
- 광독성을 방지하기 위해, 2 mW의 아래에 레이저 파워를 사용합니다. 영상에 대한 40X 목표를 사용합니다.
- 1 ㎛의 광학 간격으로 12 분에서 62 μm의 Z 스택 이미지를 획득. 10 시간 동안 총 40 회 스캔 획득. 각 사이클은 12 분의 영상 및 3 분의 휴식을 포함하는지 확인.
Representative Results
이 예에서, R3 / R4의 감광체는 감광체의 분화를 모니터링 mδ0.5-GA4로 표지 하였다. mδ0.5-GA4뿐만 아니라 ommatidial 회전 처리를 들면, R3 및 R4에 대한 우수한 마커하게 R3 R4 11에서 강한 발현 약한 발현을 구동한다. 영화 1에서, R3 및 R4는 GFP로 표지 하였다. 10 시간 실시간 이미징 세션이 시작될 때, ommatidial 클러스터 (도 2a 및 영화 1)와 단부 (도 2B)에서 ommatidial 클러스터의 14 행 8 열의 있었다. ommatidial 분화의 비율은, 생체 디스크 7, 8, 9, 10, 11 1.5 H / 행의 비율에 가까운 행당 1.67 시간이었다s = "xref"> 12 , 13 , 14 . R3과 R4의 상대적 위치에 기초하여 생체 영상화 ( 그림 2A ', A' ', B'및 B '' ) 동안 생체 외 배양 된 원판에서 육체 회전이 일어났다. 단일 R3 / R4 클러스터는 영화 2 의 첫 번째 프레임에 흰색 구형으로 표시되었습니다. 처음에는 R3 / R4 축이 적도에 직각 인 것처럼 보입니다 ( 그림 2C 및 동영상 2 ). 그런 다음 3 ( 그림 2C ' ), 6 ( 그림 2C' ' ) 및 9 ( 그림 2C' '' ) h에서 각각 15 °, 30 ° 및 45 ° 회전합니다. 이 데이터는이 방법이 10 시간 생체 영상 도중 광 수용체 분화를 유지할 수 있음을 시사합니다.
피구1 재 : 상공 회의소 총회의 회로도. 실 조립체의 개략도이다 : (1) 단계에서 수용체 이중층 O 링 부착 된 커버 슬립을 넣어. (2) 커버 슬립에 실리콘 O 링을 배치. (3) 상기베이스를 놓는다. (4) 밀봉 로커 잠금. (5)가 O 링의 중심에 시료를 넣고 덮개를 배치했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : R3 / R4 차별화 및 회전의 라이브 영상. R3 / R4 라이브 영상의 10 시간 동안의 핵 형태의 GFP를 표현 mδ0.5-GAL4으로 표시. 모든 수치는 영화 1에서 붙 잡았다. 처음에 촬영 (A) 이미지. (
영화 1 :rce.jove.com/files/ftp_upload/55748/Movie_1.avi "target ="_ blank "> 검색이 영화를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
영화 1 : 이 영화를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
이 연구에서는 Drosophila imaginal disc에 대한 장기 생체 영상 실험을위한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 우리는 디스크 손상을 피하고 커버 슬립에 디스크를 부착 할 수 있도록 많은 시간을 보냈습니다. 조직을 유지하기 위해 Poly-L-Lysine (PLL)과 저 융점 아가로 오스를 시도했습니다. 결국, 저 융점 아가로 오스는 조직을 유지하는 능력이 더 좋았다. 이 방법은 10 시간의 생체 영상주기 동안 광 수용체의 분화 및 구강 내 회전이 정상적으로 발생 함을 보여주기 위해 눈 디스크 만 사용되었지만이 방법은 다른 하나의 디스크 인 날개 디스크에도 적용 할 수 있습니다. 이전 연구 3 . 또한, 배양 배지 준비 및 라이브 이미징 설정은 간단하며 폭기 또는 매질 순환을 필요로하지 않습니다.
지속적인 라이브 이미징은 생물학적 전날의 명확한 시간 순서를 제공 할 수 있습니다국세청. 눈 디스크에 아교 세포의 분화 및 마이그레이션의 우리의 이전 보고서에서, 우리는 포장 아교이 눈 디스크 3의 전방으로 마이그레이션 한 후 기존의 아교 세포에서 분화 것을 직접 증거를 제공했다. 장기 생체 문화는 자신의 행동을 삼을 따르지 같은 카에데 형광 단백질의 광 변환과 같은 세포의 특정 레이저 활성화 라벨 수 있습니다. 또한, 배양 배지에 직접 첨가되는 화학 물질의 테스트를 수용 할 수있다; 따라서,이 약물 스크리닝 플랫폼으로 사용될 수있다. 일부 동적 프로세스 분 또는 초에서 발생하기 때문에, 높은 시간 분해능이 요구된다. 시간적 해상도 광 시트 현미경 (15, 16) 또는 회전 디스크 현미경 (17)을 강화하기 좋은 선택 일 수있다.
현재 문화 상태가 완벽하지 않습니다. 그것은 디스크 성장을 지원하지 않습니다. 셀 Proliferation은 최대 12 시간 3 지원됩니다. 생체 외 배양 12 시간 후, 감광체의 분화의 비율을 3 감소하기 시작한다. 이것은 특정 영양소 나 호르몬의 부족으로 인해 수 있습니다. 이 배지에서 큰 차이가 인슐린의 높은 농도 때문에, 포유 동물 인슐린 내인성 인슐린 유사 펩타이드의 기능을 모방 한 부분 일 수있다. 플라이 추출물, 곤충 혈당 트레할로스 및 탈피 호르몬 20 hydroxyecdysone 다양한 농도의 첨가, 3 유용하지 않았다. 그러나, 12 ~ 18 시간 배양 기간은 많은 발달 과정을 연구하기에 충분하다. 애벌레 성충 디스크를 배양 대체 배양 방법 3을 비교되었고, 우리의 배양 및 이미징 조건은 라이브 영상에 대한 가장 긴 시간 창 및 대부분의 선명도를 제공합니다. 라이브 유충 및 번데기에서 디스크를 직접 영상화 할 수 있지만18, 19, 20, 21, 22, 관측 분해능과 시간 창 제한된다. 늦은 애벌레와 번데기 디스크는 오랜 시간이 23, 24에 대한 배양 있지만 디스크는 중요한 형태 형성을받을 수 있습니다. 평면, 2D 애벌레 디스크를 활용하기 위해, 우리의 배양 및 이미징 방법은 지금까지 최고의 솔루션입니다.
Disclosures
저자는 경쟁적인 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
우리는 플라이 주식을 플라이 음식을 준비하고 유지하기위한 천-란 수와 유 치 양에게 감사하며, 스와 핑 리와 공 초점 현미경과의 도움을 IMB 이미징 코어에. 본 연구는 101-2321-B-001 -004, NSC-100-2321 -012 B-001, B-102-2321 NSC-001 -002, MOST 103-2311-B-001 YHS (NSC에 보조금 지원 국립 과학위원회와 중국의 공화국 과학 기술부에서 -035 -MY3).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low-melting agarose | AMRESCO | 0815-25G | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | AMRESCO | 0780-2PK | |
| 42 mm x 0.17 mm cover slips | PST | G401-42 | |
| Schneider’s Drosophila medium | Thermo | 21720-024 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F9665 | |
| Penicillin-streptomycin | GIBCO | 759 | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Culture chamber | PECON | POC-R2 Cell Cultivation System | |
| 40X objective | C-Apochromat 40X/1.2W Korr objective | ||
| Fly strain:nls.GFP | Bloominggton | 4775 |
References
- Cohen, S. M. Imaginal disc development. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez-Arias, A. 2, Cold Spring Harbor. NY. 747-842 (1993).
- Auerbach, C. The development of the legs, wings and halteres in wild type and some mutant strains of Drosophila melanogaster. Proc. R. Soc. Edinb. B. 58, 787-815 (1936).
- Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. Long-term Ex Vivo Culture and Live Imaging of Drosophila Larval Imaginal Discs. PLoS One. 11 (9), e0163744 (2016).
- Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice. Dev Biol. 53 (2), 217-240 (1976).
- Wolff, T., Ready, D. F. The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave. Development. 113 (3), 841-850 (1991).
- Tomlinson, A., Ready, D. F. Neuronal differentiation in Drosophila ommatidium. Dev Biol. 120 (2), 366-376 (1987).
- Wolff, T., Ready, D. F. The Development of Drosophila Melanogaster. , Cold Spring Harbor Press. 1277-1316 (1993).
- Adler, P. N. Planar signaling and morphogenesis in Drosophila. Dev Cell. 2 (5), 525-535 (2002).
- Choi, K. W., Benzer, S. Migration of glia along photoreceptor axons in the developing Drosophila eye. Neuron. 12 (2), 423-431 (1994).
- Strutt, D. I., Mlodzik, M. Ommatidial polarity in the Drosophila eye is determined by the direction of furrow progression and local interactions. Development. 121 (12), 4247-4256 (1995).
- Gaengel, K., Mlodzik, M. Egfr signaling regulates ommatidial rotation and cell motility in the Drosophila eye via MAPK/Pnt signaling and the Ras effector Canoe/AF6. Development. 130 (22), 5413-5423 (2003).
- Li, C., Meinertzhagen, I. A. Conditions for the primary culture of eye imaginal discs from Drosophila melanogaster. J Neurobiol. 28 (3), 363-380 (1995).
- Carthew, R. W. Pattern formation in the Drosophila eye. Curr Opin Genet Dev. 17 (4), 309-313 (2007).
- Treisman, J. E. Retinal differentiation in Drosophila. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (4), 545-557 (2013).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene,, Wittbrodt, F., J,, Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Keller, P. J., Stelzer, E. H. Quantitative in vivo imaging of entire embryos with Digital Scanned Laser Light Sheet Fluorescence Microscopy. Curr Opin Neurobiol. 18 (6), 624-632 (2008).
- Winter, P. W., Shroff, H. Faster fluorescence microscopy: advances in high speed biological imaging. Curr Opin Chem Biol. 20, 46-53 (2014).
- Bosveld, F., et al. Mechanical Control of Morphogenesis by Fat/Dachsous/Four-Jointed Planar Cell Polarity Pathway. Science. 336 (6082), 724-727 (2012).
- Ghannad-Rezaie, M., Wang, X., Mishra, B., Collins, C., Chronis, N. Microfluidic Chips for In Vivo Imaging of Cellular Responses to Neural Injury in Drosophila Larvae. Plos One. 7 (1), (2012).
- Heemskerk, I., Lecuit, T., LeGoff, L. Dynamic clonal analysis based on chronic in vivo imaging allows multiscale quantification of growth in the Drosophila wing disc. Development. 141 (11), 2339-2348 (2014).
- Taylor, J., Adler, P. N. Cell rearrangement and cell division during the tissue level morphogenesis of evaginating Drosophila imaginal discs. Dev Biol. 313 (2), 739-751 (2008).
- Ward, R. E., Reid, P., Bashirullah, A., D'Avino, P. P., Thummel, C. S. GFP in living animals reveals dynamic developmental responses to ecdysone during drosophila metamorphosis. Dev Biol. 256 (2), 389-402 (2003).
- Gibbs, S. M., Truman, J. W. Nitric oxide and cyclic GMP regulate retinal patterning in the optic lobe of Drosophila. Neuron. 20 (1), 83-93 (1998).
- Fristrom, J. W., Logan, W. R., Murphy, C. Synthetic and Minimal Culture Requirements for Evagination of Imaginal of Drosophila-Melanogaster in-Vitro. Dev Biol. 33 (2), 441-456 (1973).
