Summary
Denne protokollen beskriver en detaljert fremgangsmåte for langtids ex vivo kultur og direkte avbildning av et Drosophila imaginal plate. Det viser fotoreseptoren differensiering og ommatidial rotasjon inne i 10 timers periode for direkte avbildning av øyet platen. Protokollen er enkel og krever ikke dyrt oppsett.
Abstract
Live-avbildning gir mulighet til kontinuerlig å spore dynamiske cellulære og utviklingsprosesser i sanntid. Drosophila larve imaginal plater er blitt anvendt for å undersøke mange biologiske prosesser, slik som celleproliferasjon, differensiering, vekst, migrering, apoptose, konkurranse, celle-cellesignalering, og compartment grensedannelse. Men metoder for langsiktig ex vivo kultur og levende avbildning av imaginal plater har ikke vært tilfredsstillende, til tross for mange forsøk. Nylig er det utviklet en metode for langtids ex vivo kultur og direkte avbildning av imaginal plater i opp til 18 timer. I tillegg til å bruke en høy insulinkonsentrasjon i dyrkningsmediet, ble en lavtsmeltende agarose også brukes til å legge platen for å hindre den i å drive løpet av avbildningsperioden. I denne rapporten benytter øye-antennal plater som et eksempel. Fotoreseptorlidelser R3 / 4-spesifikk mδ0.5-Ga4 ekspresjon ble fulgt for å vise at fotoreseptoren differenfor handling og ommatidial rotasjon kan observeres i løpet av en 10 timers periode levende avbildning. Dette er en detaljert protokoll beskriver denne enkle metode.
Introduction
Drosophila-larve imaginal skiver har vært et favorisert eksperimentelt system for undersøkelse av en rekke forskjellige biologiske mekanismer. Disse platene invaginate fra den embryoniske epitel og blir sekkelignende strukturer bygget opp av to lag epitelceller, Peripodial epitel (PE) og platen Proper (DP) 1, 2. De imaginal skive prolifererer og differensierer progressivt i løpet av larvestadier og pupal og etter hvert legger seg inn i voksen kroppsstruktur. På grunn av den flate og enkel to-lags struktur av imaginal plater, er de lette å observere når dissekert fra larver. Men til tross for flere forsøk fra mange grupper, dagens metoder for langsiktig kultur av imaginal plater har ikke vært tilfredsstillende. Vi har nylig utviklet en kultur metode som kan opprettholde normal utvikling av flere imaginal plater i opptil 18 timer, og som gjør at levende avbildning 3 tre. Metoden er enkel, og ingen spesiell lufting eller medium sirkulasjon er nødvendig.
En av de mest studerte imaginal plater er øyet-antennal plate. Drosophila øyet er bygd opp av ca 800 ommatidia. Hver ommatidium består av åtte fotoreseptorcellene (R1-R8). I larve øyet platen, differensiere fotoreseptorcellene etter passering av morfogenetiske fure (MF), som feier over øyet platen fra bakre til fremre 4, 5. Fotoreseptorene i en ommatidium skille i sekvens, som begynner med R8, etterfulgt av R2 / R5, R3 / R4, R1 / R6, R7 og 6. Den ommatidia i rygg og ventral halvdeler av øyet skiven gjennomgår en 90 ° rotasjon i motsatte retninger, noe som resulterer i motsatt kiralitet 7, 8. Rotasjonen prosessen skjer i to trinn: for det første, begynner en 45 ° rotasjon til og fullføres ved den sjette ommatidia rad bak MF; den andre 45 ° dreining er fullført ved omtrent rad 16 9, 10. Denne studien brukt ommatidial rotasjon, preget av R3 / 4-spesifikk mδ0.5-Ga4 11, for å demonstrere den normale celledifferensiering og dynamikk som kan observeres gjennom denne metoden til kulturen og leve-bilde øyet platen.
Protocol
1. Pre-eksperimentelt oppsett
- Samle en flue egg som uttrykker atom grønt fluorescerende protein (GFP) under mδ0.5-Gal4 og kulturen ved 25 ° C i 5 dager.
- Mikrobølge 0,7 g av lavtsmeltende agarose i 10 ml 1 x fosfatbufret saltløsning (PBS) til agarose er fullstendig oppløst. Hold 0,7% lavtsmeltende gel i en 37 ° C inkubator inntil bruk.
- Sterilisere alt utstyr, inkludert tang, sakser, 42 mm x 0,17 mm dekkglass, en 9-brønn glassplate sted, og en magnetisk kultur kammer, med 70% etanol i mer enn 12 timer.
- Forbered kulturmediet 3: Schneider Drosophila-medium supplert med 2% føtalt bovint serum (FBS), 0,5% penicillin-streptomycin og 1,25 mg / ml insulin. For å unngå forurensning, fremstille medium i en cellekultur hette. Lagre det fremstilte kulturmedium ved 4 ° C og anvendt i løpet av en måned.
- Rengjør disseksjon plattformen og eksperimentator's hender med 70% etanol før start av disseksjon.
2. Plate Disseksjon
- Air tørke alt utstyr fra 70% etanol.
- Velg et tredje stadium larve fra en flue hetteglass. For å unngå forurensning fra fly ampullen, vask larven i 1 x PBS 3x for å fjerne avfallet.
- Dissekere renset larven i 1 ml kulturmedium (ved RT) i 9-brønn glass sted plate under et mikroskop disseksjon.
- Gripe larven med en pinsett ved omkring en tredjedel av veien fra den bakre ende og en annen tang ved munningen kroken. Trekk de to tang i motsatte retninger for å frigjøre de indre vev.
- Fjern spyttkjertler, fett kroppen, og skjellaget fra øyet-hjerne-komplekset er festet til munningen kroken. Hvis det ventrale nervesystemet er fortsatt festet, klippe det vekk med saks.
- Bruk en pinsett for å gripe munn krok og en pinsett for å fjerne et stykke vev som connects hjernen og øye-plater i den dorsale delen.
MERK: Hvis dette vevet ikke er fjernet, vil de to oppsikts antennal plater være nær hverandre og hjernen. Øyet plater vil da ikke ligge flatt på dekk fordi dette vev, hjernen, og øye-antennal platen vil danne en trekant. - Rotere hele komplekset til en ventral-oppadgående stilling. Fjern det filament som forbinder kroken eller skive til hjernen.
MERK: Hvis filament ikke er fjernet, vil øye-antennal plate delt i to stykke når munnen kroken fjernes.- Fjern munnen kroken. Pass på å ikke skade øyet plate under prosessen.
MERK: øye platen er nå fritt i mediet, og bare er festet til hjernen av den optiske stilken.
- Fjern munnen kroken. Pass på å ikke skade øyet plate under prosessen.
3. Montering
- Lufttørr og montere komponentene i kammeret med en 42 mm x 0,17 mm dekkglass. Fest et dobbelt lag av O-ringer til midten av dekkglass for å holde the agarose.
- Montere kammeret med dekkglass. Sett på 42 mm x 0,17 mm dekkglass på scenen akseptor. Plasser silisium O-ringen på dekkglass. Plasser basen. Låse tetningen skap og plassere dekselet (figur 1).
- overføre forsiktig dissekert øye-hjerne-komplekset til sentrum av O-ring ved bruk av en 20 ul mikropipette med en 10-200 ul spiss.
- Fjern mesteparten av mediet og tilsett 12 ul av 0,7% lavtsmeltende agarose (ved 37 ° C) til prøven.
MERK: posisjon av øyet platen kan endres med pinsett før størkningen av agarose. Agarosen vil størkne i løpet av 5 min.- Tilsett 1 ml av kulturmedium ved romtemperatur til sentrum av O-ringen; hver O-ring kan laste opp til 4 prøver. Kontroller at agarose er limt til O-ringen for å unngå avdrift av prøven.
MERK: Ingen lufting eller sirkulasjon av mediet er nødvendig.
- Tilsett 1 ml av kulturmedium ved romtemperatur til sentrum av O-ringen; hver O-ring kan laste opp til 4 prøver. Kontroller at agarose er limt til O-ringen for å unngå avdrift av prøven.
4. konfokalmikroskopi
- Plasser kammeret på scenen av en omvendt konfokalt mikroskop i 30 minutter for å ekvilibrere temperaturen. Dette kan forhindre Z-aksen drift under avbildning.
- Før langvarig direkte avbildning, sjekke om vevet er intakt ved differensiell interferenskontrastmikroskopi.
- For å unngå den fototoksisitet, bruker en lasereffekten under 2 mW. Bruke et 40X objektiv for avbildning.
- Erverve 62 um Z-stabelen bilder i 12 minutter ved en optisk intervall på 1 um. Erverve 40 sykluser av skanner over en total på 10 timer. Sikre at hver syklus inneholder 12 min for avbildning og 3 minutts hvile.
Representative Results
I dette eksempel ble R3 / R4 fotoreseptorer merket med mδ0.5-Ga4 å overvåke fotoreseptoren differensiering. mδ0.5-Ga4 stasjoner sterk ekspresjon i R4 og svakere uttrykk i R3 11, noe som gjør det til et utmerket markør for R3 og R4 så vel som for fremgangsmåten ifølge ommatidial rotasjon. I film 1, ble R3 og R4 er merket med GFP. Ved begynnelsen av den 10 h-levende avbildning økt, ble det gjort 8 rader av ommatidial klynger (Figur 2A og filmen 1) og 14 rekker av ommatidial klynger på enden (figur 2B). Frekvensen av ommatidial differensiering var 1,67 h per rad, som er nær en hastighet på 1,5 til 2 t / rad i in vivo-plater 7, 8, 9, 10, 11,s = "ekstern referanse"> 12, 13, 14. Basert på de relative posisjoner av R3 og R4, forekom ommatidial rotasjon i ex vivo-dyrket plate under direkte avbildning (figur 2A 'A '', B', og B ''). En enkelt R3 / R4 klynge var merket med en hvit kule i den første ramme av filmen 2. I begynnelsen, vises R3 / R4 akse for å være vinkelrett på ekvator (figur 2C og Film 2). Deretter vises det til å rotere 15 °, 30 ° og 45 ° i 3 (figur 2C '), 6 (figur 2C ''), og 9 (figur 2C ''') h, henholdsvis. Disse dataene tyder på at denne fremgangsmåten kan opprettholde fotoreseptor differensiering i løpet av 10 timer levende avbildning.
FiguRe 1: Skjematisk diagram over kammermontering. Skjematisk diagram over kammermontering: ( 1 ) Legg på dobbeltlags O-ringmontert deksel på scenens akseptor. ( 2 ) Legg silikon O-ringen på dekselet. ( 3 ) Plasser basen. ( 4 ) Lås forseglingslåsen. ( 5 ) Legg prøven i midten av O-ringen og plasser dekselet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Live Imaging av R3 / R4 Differensiering og Rotasjon. R3 / R4 merket med mδ0.5-Gal4 som uttrykker nukleær form GFP i løpet av 10 timer levende bildebehandling. Alle tallene ble tatt fra film 1 . ( A ) Bilde tatt i begynnelsen. (
Film 1:rce.jove.com/files/ftp_upload/55748/Movie_1.avi" target = '_ blank'> Klikk her for å laste ned denne filmen.
Discussion
I denne studien gir vi en detaljert protokoll for en langsiktig levende avbildning eksperiment på Drosophila imaginal plater. Vi brukte mye tid på å trene forsiktig disseksjon for å unngå disk skade og for å tillate festing av platen nær Dekk. Vi forsøkte Poly-L-lysin (PLL) og lavtsmeltende agarose for å holde vevet; til slutt, den lavtsmeltende agarose viste en bedre evne til å holde vevet. Selv om det bare øyet skive ble brukt i denne artikkelen for å demonstrere den normale forekomst av fotoreseptoren differensiering og ommatidial rotasjon i løpet av 10 timer direkte avbildning periode, kan denne fremgangsmåte også anvendes på minst en annen plate, vingen plate, som demonstrert i en tidligere studie tre. Videre kulturmediet preparatet og direkte avbildning oppsett er enkel og krever ikke lufting eller medium sirkulasjon.
Kontinuerlig direkte avbildning kan gi en klar tidsmessig sekvens av biologisk events. I vår tidligere rapport fra gliaceller differensiering og migrasjon i øyet platen, forutsatt at vi direkte bevis på at innpakning gliaceller skille fra eksisterende gliaceller etter å migrere til fremre av øyet skive tre. Long-term ex vivo kultur tillater den spesifikke laseraktiverte merking av celler, slik som den foto omdannelse av KAEDE fluorescerende protein, for å følge deres atferd 3. Den kan også romme testing av kjemikalier som tilsettes direkte til dyrkningsmediet; således kan den anvendes som et medikament screenings plattform. Siden noen dynamisk prosess forekomme i løpet av minutter eller sekunder, blir høy tidsoppløsning er nødvendig. For å øke tidsoppløsningen, lys-mikroskopi ark 15, 16 eller en roterende disk mikroskopi 17 kan være et godt alternativ.
Den nåværende kultur tilstand er ikke perfekt. Den støtter ikke platen vekst. Cell pRulliferering støttes kun i opptil 12 timer 3 . Etter 12 timer i ex vivo- kultur begynner frekvensen av fotoreceptor-differensiering å redusere 3 . Dette kan skyldes mangel på visse næringsstoffer eller hormoner. Siden den store forskjellen i dette kulturmediet er den høye konsentrasjonen av insulin, kan pattedyrinsulinet delvis etterlikne funksjonen til endogene insulinlignende peptider. Tilsetningen av flyekstrakte, insekts blodsukker trehalose og forskjellige konsentrasjoner av moltingshormonet 20-hydroksy-eksson, var ikke fordelaktige 3 . Men 12-18 h kulturperioden er nok til å studere mange utviklingsprosesser. Alternative kultiveringsmetoder for dyrking av larve-imaginale plater er blitt sammenlignet 3 , og vår kultur- og bildebehandlingstilstand gir det lengste tidsvinduet og mest klarhet for levende bildebehandling. Selv om plater innenfor levende larver og pupper kan avbildes direkte18, 19, 20, 21, 22, oppløsning og tidsvinduet for observasjonene er begrenset. Sen larve og pupal plater, kan dyrkes i lang tid 23, 24, men skivene gjennomgå betydelige morfogenese. For å dra nytte av de flate, 2D larve plater, er vår dyrking og avbildningsmetode den beste løsningen så langt.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi er takknemlige for Chun-lan Hsu og Yu-Chi Yang for å forberede flymat og vedlikeholde flybestandene, og til Su-Ping Lee og IMB Imaging Core for deres hjelp med konfokalmikroskopien. Denne studien ble støttet av tilskudd til YHS (NSC 101-2321-B-001-004, NSC 100-2321-B-001-012, NSC 102-2321-B-001-002, MOST 103-2311-B-001 -035 -MY3) fra Nasjonalt vitenskapsråd og departementet for vitenskap og teknologi i Republikken Kina.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low-melting agarose | AMRESCO | 0815-25G | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | AMRESCO | 0780-2PK | |
| 42 mm x 0.17 mm cover slips | PST | G401-42 | |
| Schneider’s Drosophila medium | Thermo | 21720-024 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F9665 | |
| Penicillin-streptomycin | GIBCO | 759 | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Culture chamber | PECON | POC-R2 Cell Cultivation System | |
| 40X objective | C-Apochromat 40X/1.2W Korr objective | ||
| Fly strain:nls.GFP | Bloominggton | 4775 |
References
- Cohen, S. M. Imaginal disc development. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez-Arias, A. 2, Cold Spring Harbor. NY. 747-842 (1993).
- Auerbach, C. The development of the legs, wings and halteres in wild type and some mutant strains of Drosophila melanogaster. Proc. R. Soc. Edinb. B. 58, 787-815 (1936).
- Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. Long-term Ex Vivo Culture and Live Imaging of Drosophila Larval Imaginal Discs. PLoS One. 11 (9), e0163744 (2016).
- Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice. Dev Biol. 53 (2), 217-240 (1976).
- Wolff, T., Ready, D. F. The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave. Development. 113 (3), 841-850 (1991).
- Tomlinson, A., Ready, D. F. Neuronal differentiation in Drosophila ommatidium. Dev Biol. 120 (2), 366-376 (1987).
- Wolff, T., Ready, D. F. The Development of Drosophila Melanogaster. , Cold Spring Harbor Press. 1277-1316 (1993).
- Adler, P. N. Planar signaling and morphogenesis in Drosophila. Dev Cell. 2 (5), 525-535 (2002).
- Choi, K. W., Benzer, S. Migration of glia along photoreceptor axons in the developing Drosophila eye. Neuron. 12 (2), 423-431 (1994).
- Strutt, D. I., Mlodzik, M. Ommatidial polarity in the Drosophila eye is determined by the direction of furrow progression and local interactions. Development. 121 (12), 4247-4256 (1995).
- Gaengel, K., Mlodzik, M. Egfr signaling regulates ommatidial rotation and cell motility in the Drosophila eye via MAPK/Pnt signaling and the Ras effector Canoe/AF6. Development. 130 (22), 5413-5423 (2003).
- Li, C., Meinertzhagen, I. A. Conditions for the primary culture of eye imaginal discs from Drosophila melanogaster. J Neurobiol. 28 (3), 363-380 (1995).
- Carthew, R. W. Pattern formation in the Drosophila eye. Curr Opin Genet Dev. 17 (4), 309-313 (2007).
- Treisman, J. E. Retinal differentiation in Drosophila. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (4), 545-557 (2013).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene,, Wittbrodt, F., J,, Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Keller, P. J., Stelzer, E. H. Quantitative in vivo imaging of entire embryos with Digital Scanned Laser Light Sheet Fluorescence Microscopy. Curr Opin Neurobiol. 18 (6), 624-632 (2008).
- Winter, P. W., Shroff, H. Faster fluorescence microscopy: advances in high speed biological imaging. Curr Opin Chem Biol. 20, 46-53 (2014).
- Bosveld, F., et al. Mechanical Control of Morphogenesis by Fat/Dachsous/Four-Jointed Planar Cell Polarity Pathway. Science. 336 (6082), 724-727 (2012).
- Ghannad-Rezaie, M., Wang, X., Mishra, B., Collins, C., Chronis, N. Microfluidic Chips for In Vivo Imaging of Cellular Responses to Neural Injury in Drosophila Larvae. Plos One. 7 (1), (2012).
- Heemskerk, I., Lecuit, T., LeGoff, L. Dynamic clonal analysis based on chronic in vivo imaging allows multiscale quantification of growth in the Drosophila wing disc. Development. 141 (11), 2339-2348 (2014).
- Taylor, J., Adler, P. N. Cell rearrangement and cell division during the tissue level morphogenesis of evaginating Drosophila imaginal discs. Dev Biol. 313 (2), 739-751 (2008).
- Ward, R. E., Reid, P., Bashirullah, A., D'Avino, P. P., Thummel, C. S. GFP in living animals reveals dynamic developmental responses to ecdysone during drosophila metamorphosis. Dev Biol. 256 (2), 389-402 (2003).
- Gibbs, S. M., Truman, J. W. Nitric oxide and cyclic GMP regulate retinal patterning in the optic lobe of Drosophila. Neuron. 20 (1), 83-93 (1998).
- Fristrom, J. W., Logan, W. R., Murphy, C. Synthetic and Minimal Culture Requirements for Evagination of Imaginal of Drosophila-Melanogaster in-Vitro. Dev Biol. 33 (2), 441-456 (1973).
