本文介绍了一个优化酵母雌激素屏幕的量化配体的个人护理产品 (杆), 结合雌激素受体α (ERα) 和/或β (er)。该方法采用了两种色度基质选择, 一个六天的冷冻孵化, 用于本科课程, 以及数据分析的统计工具。
酵母雌激素屏幕 (YES) 用于检测环境样品中的雌激素配体, 并在内分泌紊乱的研究中得到广泛应用。雌激素配体包括自然和人为的 “环境雌激素” (EEs), 发现在许多消费品, 包括个人护理产品 (杆), 塑料, 杀虫剂和食品。EEs 扰乱人类和其他动物的荷尔蒙信号, 有可能降低生育率和增加疾病风险。尽管 EEs 和其他内分泌干扰化学品 (物) 对公共卫生的重要性, 但在本科课程中, 内分泌紊乱通常不包括在内。这一缺陷部分是由于缺乏相关的实验室活动, 说明了所涉及的原则, 同时也可供本科生就读。本文提出了一个优化的是量化配体的个人护理产品, 结合雌激素受体α (ERα) 和/或β (er)。该方法采用了两个比色衬底 (邻-硝基苯基β-d-乳糖 (ONPG) 或氯酚红β-d-乳糖 (CPRG)), 由β-乳糖, 6 天的冷冻孵化步骤, 以促进本科生实验室课程的使用, LacZ 计算的自动化应用, 以及相关的4参数逻辑回归分析的 R 代码。该协议的目的是让本科生开发和进行实验, 他们筛选的产品, 他们选择的雌激素模拟。在这个过程中, 他们学习内分泌紊乱, 细胞培养, 受体结合, 酶活性, 基因工程, 统计学, 和实验设计。同时, 他们也实践基本和广泛适用的实验室技能, 如: 计算浓度;制定解决方案;演示无菌技术;串行稀释标准;构造和插值标准曲线;识别变量和控制;收集、组织和分析数据;图的构造和解释;使用普通的实验室设备, 如 micropipettors 和光。因此, 在探索环境科学和健康方面的新问题时, 实施这种方法可以鼓励学生从事探究性学习。
酵母雌激素屏幕 (是的) 被广泛用于量化的配体, 模仿雌二醇 (E2 或17雌二醇) 在各种基质, 包括水, 植物组织, 消费品, 食品和食物1,2,3, 4。这些配体统称为 “环境雌激素 (EEs)”。是的最初开发了作为低费用,在体外选择到在体内测试象啮齿目动物子宫化验5,6和彩虹鳟鱼喂养化验7。这些测试的目的是确定产品是否含有刺激或阻断雌激素依赖性机制的化学物质。检测 EEs 是至关重要的, 因为他们可以干扰正常内源性雌激素信号, 特别是在胎儿发育过程中。这种干扰通过增加肥胖、不孕、癌症和认知损失的风险而危及健康8。
尽管 EEs 和其他物对公共卫生的重要性, 但在本科课程中, 内分泌失调并不常见。这一缺陷部分是由于缺乏活动, 说明了所涉及的原则, 同时也可供本科生就读。另外, YES 协议的几个变体存在9、10、11、12、13, 而这种差异性使分析优化耗时在相关技术方面没有专门培训的实验室协调员。最后, 是的化验通常完成超过1长的一天或2连续天与一个 O/N 孵化。这一时间与本科生实验室课程的格式不兼容, 这通常会在几小时内每周举行一次。
针对这些需求, 这份手稿报告了一个优化的 96-良好的协议, 其中包括个人护理产品 (杆)3的乙醇提取方法和6天的制冷步骤, 以适应每周的实验室会议。绝对乙醇是一种多用途的有机溶剂, 可以溶解各种极性和非极性的溶质。此外, 它适合本科课程, 因为它是现成的, 相对无毒, 负担得起, 并与水互溶;它也容易蒸发, 没有特殊的设备。然而, 乙醇是不理想的提取强烈疏水性内分泌干扰物或许多油和蜡, 后两者是共同的成分在杆. 提取效率差会增加假阴性结果的风险。考虑到这一限制, 调查人员应选择提取程序 (例如、乙醇提取或固相萃取) 来处理样本特征并满足研究目标 (研究与本科生教学)。
这是依赖于重组的酿酒酵母最初创建的 Dr. 查尔斯米勒在杜兰大学。请参见米勒et al.(2010) 为工程质粒的完整地图14。酵母转化为这些质粒组成表达人核 ERα或 er (也称为 ESR1 和 ESR2, 分别) 当生长在含有半乳糖 (ERα) 或葡萄糖或半乳糖 (er) 的培养基中。如果媒介中存在着雌激素化学物质, 它们就会与受体结合, 产生配体受体复合物, 激活β-乳糖 (lacZ) 表达, 与雌激素浓度成正比。然后裂解酵母细胞释放积累的β-乳糖。裂解缓冲液中含有 ONPG 或 CPRG, 由β-乳糖切割, 分别产生黄色或红色产物。通过微板分光光度法测量光度, 可以量化色度产品。颜色变化程度与酵母暴露的雌激素配体的浓度成正比。
基板 (CPRG 或 ONPG) 的选择取决于所测试样品所产生的背景吸收的可能性。例如, 植物提取物通常会增加一个黄色色调的媒体, 人为膨胀的 estrogenicity 措施, 如果 ONPG (量化的 405 nm) 被用作β-乳糖基板。与植物提取物, CPRG (定量在574毫微米) 可能是一个更加适当的比色基体。CPRG 比 ONPG 更贵, 但在1/10 的浓度使用。本文介绍了使用 ONPG 和 CPRG estrogenicities 的 PCP 提取物的数量。
使用 ERα和 er 对环境样品进行定量 estrogenicity 是一种比仅使用其中一种受体更全面的方法。在动物中, 这些受体表现为雌激素和抗配体的差异组织分布、调控活动和结合亲和力15。例如, 植物雌典型地束缚 er 更加强烈2, 而合成化学制品可能显示偏爱为 ERα或 er 或能同样同时束缚两个感受器官15。因此, 结合到一个雌激素受体并不一定预测绑定到另一个。
虽然 EEs 在许多消费品 (如如、杀虫剂、洗涤剂、粘合剂、润滑剂、塑料、食品和药品) 以及植物中发现, 但所提供的数据都是通过选择杆获得的. 杆是引人注目的, 容易可提供, 预算友好, 与环境相关的本科学生。学生可以被邀请把他们最喜欢的杆从家里带到实验室进行测试。他们还可以搜索由环境工作组16开发的皮肤深层数据库, 以生成具有高和低毒性分数的杆的假设驱动比较。这样, 学生可以同时开发先进的实验室技能;从事自我导向、探究性学习;并探讨环境科学与健康方面的新问题。
“是” 是一种低成本的方法, 用于检测环境样品中的雌激素配体, 如水、食物、植物组织或个人护理产品。这里提供的数据比较了2雌激素受体 (ERα和 er), 2 底物 (ONPG 和 CPRG), 和2时间线 (2 d 协议没有冷藏和七天的协议与制冷), 以测量 estrogenicity 在个人护理产品通过是化验。7 d, 冷藏协议使用 CPRG 和酵母表达 ERα和/或 er 最好的量化 EEQs, 同时也与时间限制所强加的本科生实验室课程, 只满足一次/周的几个 h。事实上, 与2维无冷冻检测法相比, 七天的冷冻试验与平板复制的方差减少有关。此外, 标准曲线的线性部分略有扩展, 用于收集使用冷冻法的数据。标准曲线的线性部分定义了分析检测范围, 是标准曲线中唯一可以用来插入样品 EEQs 的部分。
在所有的试验样品中, 用 CPRG 测定的 EEQs 低于 ONPG。具有较高的消光系数和较低的 Km和 Vmax, CPRG 的灵敏度比 ONPG17高十倍。因此, CPRG 可用于较低浓度, 可用于检测较低量的β-乳糖。由于这些原因, CPRG 通常优先于 ONPG18,19。但是, 更高的基板灵敏度并不能解释用 CPRG 检测到的较低的 EEQ 值。ONPG 检测到的较高的 EEQ 值可能是由于与该检测的矩阵干扰, 如其他作者2,18所述。来自个人护理产品提取物的黄色颜料可以膨胀 EEQ 检测到的 ONPG。其他人则通过在实验设计2中包括颜料控制来规避这个问题, 这种方法使实验中的车牌数增加一倍。当基质干扰可能是有问题的, CPRG 可能是一个更好的基质的是化验, 虽然它是更昂贵, 需要更长的潜伏期比 ONPG。此外, β-乳糖对基底的劈裂引起的颜色变化更剧烈, CPRG, 使学生更容易可视化结果。
米勒et al.(2010), 谁设计了这个协议中使用的酵母, 指出, 酵母表达 er 是30x 更敏感的 17-雌二醇比酵母表达 ERα, 一个发现证实由我们的数据14。除了在质粒建设的潜在细微差别, 米勒et al.(2010) 无法解释14的灵敏度差异。两种质粒结构之间的一个区别是 ERα表达是由半乳糖调节的, 而 er 表达则由葡萄糖或半乳糖调节。在 “YES” 检测中使用的酵母在葡萄糖培养基中培养, 只有在试验开始稀释时才给予半乳糖。因此, 表达 er 的酵母可能在开始检测之前积累更高的受体蛋白拷贝数, 从而赋予雌激素配体更高的敏感性。
ERα表达酵母的低灵敏度可以解释 ERα与 er 相比, estrogenicity 在样品中的 non-detection 率较高。为了增加样品 EEQs 检测的可能性, 用户可以使用不同的萃取溶剂和方法, 或者在酵母中加入更高的样品量。如果使用较高的取样量, 则应调整 E2 标准的浓度, 以便在化验中使用相同数量的标准和样品。添加更多样本的一个限制是酵母只能耐受 6-10% 乙醇, 在孵化温度为 30 Vs. 35 ° c20时具有更好的耐受性。为了控制乙醇对酵母的影响, 调查人员应在平板布局中添加三份 “仅酵母” 井, 并确认这些 “仅酵母” 井的 od610可与车辆控制井的 od610相媲美。在添加 LacZ 缓冲区后。另外, 在乙醇中溶解的样品可以添加到干微板中, 乙醇在加入酵母之前蒸发掉。砜 (亚甲基亚砜) 也被用作样品中的溶剂, 但最终的工作浓度与酵母应限于 1%12。
“YES” 检测是一种用于检测环境样品中 estrogenicity 的强力筛选工具。具体来说, 是检测配体, 结合与雌激素反应元素的核雌激素受体与直接基因表达14。但是, “是” 也有重要的限制。YES 不检测通过非核机制工作的 EEs, 如膜雌激素受体或涉及其他元素的机制, 如激活蛋白 1 (AP-1) 转录因子。此外, 由于酵母与哺乳动物细胞的新陈代谢能力不一样, 是不能检测到需要代谢活化的配体是雌激素。
此外, 是化验不能轻易区分雌激素和抗配体在复杂的样品。相反, 它测量net estrogenicity, 这是雌激素和抗配体的总和效应。为了量化 ER 拮抗剂的浓度或评价混合物的抑菌活性, 该方法可以通过孵育酵母, 同时使用标准的促效酶 (17-雌二醇) 和一系列的测试样本浓度12进行修改。这个过程决定了, 如果在样品中的拮抗剂可以减少激动因素诱发的记者活动, 并提供一个有用的屏幕, 以确定在样品中 ER 拮抗剂的存在。
此处提供的协议可以容纳多种示例类型, 但有些示例可能需要对提取和示例准备步骤进行修改。例如, EEQs 在一些个人护理产品的复制中差别很大。更易变的样品倾向于包含油滴或否则不是完全地均匀的, 表明一个更加亲油性的溶剂例如二乙醚将是有用的。另外, 在个人护理产品中的油和蜡可以被排除在提取样品与50% 乙醇而不是100% 乙醇。50% 乙醇提取物也将捕获更多的水溶性雌激素配体 (例如, 一些颜料)。然而, 50% 的乙醇蒸发速度比100% 乙醇慢, 因此可以延长萃取时间。此外, 一些样品 (如肥皂) 是细胞毒性酵母, 导致减少细胞密度测量 (OD610)。狐狸et al.(2008) 建议, 如果细胞密度差异超过 30%, 与车辆控制井12相比, 应稀释和重新测试此类样品。
如果是用于分析研究目的, 样品池稀释曲线可以测试先发制人确定在步骤4.5 中添加到酵母中的适当数量的提取物。另外, 提取物可以同时在多个卷 (例如, 5 µL 和20µL 提取物添加到酵母在步骤 4.5) 或稀释, 跨越数量级 (如如, 0.2 µL, 2 µL, 和20µL)。”适当” 的提取量是那些识别 estrogenicity 通过匹配 LacZ 值沿线性部分的标准曲线。优化可以防止在酵母中添加过多或过少的样品, 如细胞毒性、假阴性或超过标准曲线的 estrogenicity。如上所述, 在使用不同数量的配体时, 应调整样品和 E2 标准的体积, 使酵母接触到一致的体积和浓度的乙醇或其他车辆的整个板块。
尽管有潜在的假阴性, 是的检测已被确定为3层的内分泌干扰物测试工具 Schug 的et al.(2013), 谁开发了一个全面的分层协议内分泌干扰 (TiPED)21。在本科教育中, 该方法对与内分泌紊乱、细胞培养、受体结合、酶活性、基因工程、统计学和实验设计相关的教学概念有价值。使用该检测方法的学生还要实践基本和广泛适用的实验室技能, 如串行稀释标准;提取样品;制定解决方案;构造和插值标准曲线;计算浓度;制定解决方案;演示无菌技术;培养细胞;识别变量和控制;收集、组织和分析数据;图的构造和解释;使用普通的实验室设备, 如 micropipettors 和光。
The authors have nothing to disclose.
该项目由路易斯安那州理工大学和弗曼大学的启动资金和 AMR 公司分别资助。额外资金由2015教职员进步津贴提供给 AMR 和从南部的伴生的学院, 一个路易斯安那州 EPSCoR Pfund 授予从国家科学基金会和路易斯安那州董事会, 和旅行奖从南方大学。我们感谢 Dr. 大卫尤班克斯 (弗曼) 的帮助, 统计分析和 Mr. 在拍摄过程中 “帮我们一把”。
Equipment | |||
Vortex Mixer (for single or multiple tubes) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 02-215-365 | Any mixer will suffice. |
Bucket centrifuge | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 75-063-839 | Any bucket centrifuge will suffice if it is capable of centrifuging conical tubes at 4000 rpm. |
Bunsen burner | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 17-012-823 | Any Bunsen burner will suffice, or an alcohol burner (Fisher Scientific 04-245-1) can be used instead. |
Incubator | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 50125590H | Any incubator will suffice if it is capable of maintaining 30 °C. |
Microplate reader | BioTek (www.biotek.com) | EPOCH2 | A different brand of plate reader will suffice if it can measure absorbance at wavelengths of 405, 574, and 610 nm. |
Gen5 microplate reader and imager software | BioTek (www.biotek.com) | GEN5 | Software required depends on make and model of plate reader; GEN5 software is intended for use with BioTek plate reader. |
Refrigerator | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 05LREEFSA | Any refrigerator will suffice if it is capable of maintaining 4 °C. |
Pipettor or PipetAid compatible with 1-10 ml serological pipets | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 13-681-15E | Any pipettors will suffice if they are compatible with 1- and 10-ml serological pipets. |
P10 micropipettor | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | F144562G | Any micropipettor will suffice if it is capable of dispensing 5 µl. |
P200 micropipettor | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | F144565G | Any micropipettor will suffice if it is capable of dispensing up to 200 µl. |
P300 multichannel pipettor | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | FBE1200300 | Any multichannel pipettor will suffice if it is capable of dispensing 50 to 205 µl. |
Repeating pipettor | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | F164001G | Must be able to deliver 100-320 µl; this pipettor is optional because a multichannel pipettor can be used instead. |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Supplies | |||
Sterile 15-ml conical tubes with caps | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 05-539-801 | |
Glass scintillation vials | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 03-337-4 | |
Polystyrene 96-well, flat-bottom microplates with lid (non-sterile) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 12565501 | |
Polypropylene 96-well, flat-bottom microplates without lid | Cole-Parmer (www.coleparmer.com) | EW-01728-81 | |
100 ml glass beakers | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 02-539H | Any glass beakers will suffice if they are autoclavable. |
250 ml glass Erlenmeyer flasks | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | FB500250 | Any glass Erlenmeyer flasks will suffice if they are autoclavable. |
Sterile, adhesive, porous film | VWR (www.vwr.com) | 60941-086 | |
Metal forceps | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 12-000-157 | Any metal forceps will suffice. |
Reagent reservoir | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 07-200-127 | |
Filtration units (0.2 µm) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 09-761-52 | |
Squirt bottle (for ethanol) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 02-897-10 | Any laboratory squirt bottles will suffice. |
Autoclavable storage bottles | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 06-414-1D | Any autoclavable glass storage bottles will suffice. |
10 ml glass serological pipets (sterile) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 13-678-27F | Any glass serological pipets will suffice. |
1 ml glass serological pipets (sterile) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 13-678-27C | Any glass serological pipets will suffice. |
P10 micropipettor tips | USA Scientific (www.usascientific.com) | 1120-3810 | Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above. |
P200 micropipettor tips | USA Scientific (www.usascientific.com) | 1120-8810 | Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above. |
P300 micropipettor tips | USA Scientific (www.usascientific.com) | 1120-9810 | Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above. |
Syringe tips for repeating pipettor | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | F164150G | Only required if a repeating pipettor is used. |
Sterile petri dishes | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | FB0875712 | Any sterile petri dishes will suffice. |
Parafilm | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | S37440 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Yeast | |||
Saccharomyces cerevisiae strains that lack the TRP1 gene product (e.g. W303a) | American Type Culture Company (ATCC) (www.ATCC.org) | MYA-151 | Recombinant yeast are also available upon request from the authors. |
Receptor/reporter plasmid for ERα | Addgene (www.addgene.org) | pRR-ERalpha-5Z (Plasmid #23061) | |
Receptor/reporter plasmid for ERβ | Addgene (www.addgene.org) | pRR-ERbeta-5Z (Plasmid #23062) | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chemicals | |||
Difco agar | BD (www.bd.com) | 214530 | |
Dithiothreitol | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | D0632 | CAUTION: Dithiothreitol is an acute skin and eye irritant. Use appropriate personal protection equipment (gloves, fume hood, dust mask) to avoid skin and eye contact, inhalation and ingestion. |
Ortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | N1127 | |
Chlorophenol red-β-D-galactopyranoside | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | 10884308001 | |
Yeast nitrogen base | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | Y0626 | |
Glucose | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | G8270 | |
Galactose | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | G5388 | |
Adenine sulfate | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | A9126 | |
Uracil | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | U0750 | |
Leucine | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | L8000 | |
Histidine | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | H8000 | |
17 β-Estradiol | Sigma (www.sigmaaldrich.com) MP Biomedicals | E8875-250 mg 0219456401 – 1 mg | CAUTION: Estradiol is a suspected carcinogen and reproductive toxicant. It is harmful if inhaled, swallowed, or absorbed through skin. Estradiol may cause harm to breast-fed children and fetuses. Estradiol is very toxic to aquatic life. Use appropriate personal protection (gloves, fume hood, dust mask) and avoid exposure during pregnancy and lactation. Estradiol should be disposed of as hazardous waste and not released to the environment. |
100% ethanol | Pharmco-Aaper (www.pharmcoaaper.com) | 111000200 | |
Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | S9638 | |
Sodium phosphate dibasic (anhydrous) | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | S0876 | |
Magnesium chloride | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | M8266 | |
Potassium chloride | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | P9333 | |
Sarkosyl (N-lauroylsarcosine sodium salt) | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | L5125 | |
Sodium carbonate | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | S7795 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
Excel spreadsheet software | Microsoft | Excel is convenient spreadsheet software for managing data outputs and generating .csv files for R analysis. | |
Java software (required for Appendix 1 application) | Oracle Corporation | To calculate LacZ values using the application in Appendix 1, first download free Java software (https://www.java.com/en/download/), then open the LacZ application in Appendix 1. LacZ results created by the application can be copied by pressing "control (ctrl) + c" on PC keyboards, or "command + c" on Mac keyboards. | |
JMP statistical software version 13.0.0 | SAS Institute | Appendix 2 includes directions on using JMP to fit LacZ data to a four-parameter logistic regression curve. The curve is used to interpolate test sample estradiol equivalents (EEQs), relative to the estradiol standard curve. | |
R statistical computing and graphics software | R Foundation | Free R software can be downloaded from https://www.r-project.org/. Directions and code for using R to fit LacZ data to a four-parameter logistic regression curve are given in Appendix 2. |