Denna artikel presenterar en optimerad jäst östrogen skärm för att kvantifiera ligander i personliga hygienprodukter (PCP) som binder östrogen receptorer alpha (ERα) och/eller beta (ERβ). Metoden innehåller två kolorimetriska substrat alternativ, en sex-dagars kylda inkubation för användning i grundutbildningen och statistiska verktyg för dataanalys.
Den jäst östrogen skärmen (Ja) används för att upptäcka östrogena ligander i miljöprover och har tillämpats i stort sett i studier av endokrina störningar. Östrogena ligander inkluderar både naturliga och konstgjorda ”Environmental östrogener” (EEs) Funna i många konsumentvaror inklusive personliga hygienprodukter (PCP), plast, bekämpningsmedel och livsmedel. Europeiska sysselsättningsstrategin störa hormon signalering i människor och andra djur, potentiellt minskad fertilitet och ökad sjukdomsrisk. Trots betydelsen av europeiska sysselsättningsstrategin och andra endokrina störningar kemikalier (hormonstörande ämnen) för folkhälsan ingår endokrina störningar inte normalt i grundutbildningen läroplaner. Denna brist är delvis på grund av relevanta laboratorieverksamhet som illustrerar principerna involverad samtidigt vara tillgänglig för studenter. Denna artikel presenterar en optimerad Ja för att kvantifiera ligander i kroppsvårdsprodukter som binder östrogen receptorer alpha (ERα) och/eller beta (ERβ). Metoden innehåller en av de två kolorimetriska substratesna (ortho– nitrofenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG) eller klorfenol röd-β-D-galactopyranoside (CPRG)) som klyvs av β-galaktosidas, en 6-dagars kylda inkubation steg till underlätta användning i grundutbildningsprogram laboratorium kurser, ett automatiserat program för Lindholm beräkningar och R-kod för den associera 4-parameter logistisk regressionsanalysen. Protokollet har utformats för att tillåta studenter att utveckla och genomföra experiment där skärmen de produkter de själva väljer för östrogen härmar. I processen, de lär sig om endokrina störningar, cellodling, receptorbindning, enzymaktivitet, genteknik, statistik och försöksplanering. Samtidigt, de också öva grundläggande och allmänt tillämpliga laboratorium färdigheter, såsom: beräkna koncentrationer; göra-lösningar; visar steril teknik; seriellt späda normer. att konstruera och interpolera standard kurvor; att identifiera variabler och kontroller. samla, ordna och analysera data. konstruera och tolka grafer; och använder vanlig laboratorieutrustning såsom Mikropipetter och spektrofotometrar. Således, genomföra denna analys uppmuntrar eleverna att engagera i undersökande lärande samtidigt undersöka framväxande frågor i miljövetenskap och hälsa.
Den jäst östrogen skärmen (Ja) används ofta för att kvantifiera ligander som efterliknar estradiol (E2 eller 17β-Östradiol) i en mängd olika matriser, inklusive vatten, växt vävnader, konsumtionsvaror och livsmedel1,2,3, 4. Sammantaget som dessa ligander kallas ”Environmental östrogener (EEs)”. Ja utvecklades ursprungligen som en låg kostnad, in vitro- alternativ till i vivo tester som den gnagare uterotrophic assay5,6 och regnbåge utfodring assay7. Syftet med dessa tester är att avgöra om en produkt innehåller kemikalier som stimulerar eller blockera östrogen-beroende mekanismer. Påvisande av EEs är kritisk, eftersom de kan störa normal endogena östrogen signalering, särskilt under fosterutvecklingen. Denna störning äventyrar hälsa genom att öka risken för fetma, infertilitet, cancer och kognitiva förlust8.
Trots betydelsen av europeiska sysselsättningsstrategin och andra hormonstörande ämnen för folkhälsan ingår endokrina störningar inte vanligen i grundutbildningen läroplaner. Denna brist är delvis på grund av en brist på aktiviteter som illustrerar principerna involverad samtidigt vara tillgänglig för studenter. Dessutom flera varianter av protokollet Ja finns9,10,11,12,13, och denna mångfald gör assay optimering tidskrävande för laboratoriet samordnare inte särskilt utbildade i de relevanta teknikerna. Slutligen, ja analyser är vanligtvis avslutad över 1 lång dag eller 2 dagar med en O/N inkubation. Denna tidpunkt är inte kompatibel med formatet för grundutbildning laboratorium jagar, som normalt träffas en gång / vecka för flera h.
Svar på dessa behov rapporterar detta manuskript en optimerad 96 brunnar Ja protokoll som innehåller enprocentig extraktionsmetoder för personliga hygienprodukter (PCP)3 och ett 6-dagars kyl steg att rymma laboratorium veckomöten. Absolut etanol är en mångsidig organiskt lösningsmedel som kan lösa upp en mängd polära och opolära koncentrationsfördelningen. Dessutom är det lämpligt för grundutbildningen eftersom det är lätt tillgängliga, relativt giftfritt, prisvärd och blandbar med vatten. Det avdunstar också enkelt utan speciell utrustning. Men etanol är inte idealiskt för att utvinna starkt hydrofoba hormonstörande eller många oljor och vaxer, de senare två är vanliga ingredienser i PCP. dålig utvinning effektivitet ökar risken för falskt negativa fynd. Med denna begränsning i åtanke, bör utredare välja extraktionsprocessen (t.ex., enprocentig utvinning eller fasta fasen extraktion) denna adress provets karaktär och målen för studien (forskning kontra grundutbildningsprogram instruktion).
Ja är beroende av rekombinant Saccharomyces cerevisiae ursprungligen skapad av Dr. Charles Miller vid Tulane University. Vänligen se Miller et al. (2010) för en komplett karta av bakåtkompilerade plasmid14. Jästen omvandlas med dessa plasmider konstitutivt express mänskliga nukleära ERα eller ERβ (även kallad ESR1 och ESR2, respektive) när den odlas i media som innehåller galaktos (för ERα) eller antingen glukos eller galaktos (för ERβ). Om det förekommer östrogena kemikalier i media, binder de till receptorer, skapa ligand-receptor komplex som aktiverar β-galaktosidas (Lindholm) uttryck på en nivå som är proportionell mot koncentrationen av östrogena kemikalier. Jästceller är sedan lyserat för att släppa den ackumulerade β-galaktosidas. Lyseringsbuffert innehåller antingen ONPG eller CPRG, som klyvs av β-galaktosidas ge gula eller röda produkter, respektive. Kolorimetriska produkter kan kvantifieras genom mätning av absorbans med en mikrobrunn plattan spektrofotometer. Graden av färgförändring är proportionell mot koncentrationen av östrogena ligander som jästen var utsatt.
Valet av substrat (CPRG eller ONPG) beror på potentialen för bakgrundsabsorbansen som härrör från de prover som ska testas. Till exempel växtextrakt kommer ofta lägga en gul nyans till media som artificiellt blåses östrogeniciteten åtgärder om ONPG (kvantifieras vid 405 nm) används som substrat för β-galaktosidas. Med växtextrakt, CPRG (kvantifieras på 574 nm) kan vara en lämpligare kolorimetriska substrat. CPRG är dyrare än ONPG men används på en tiondel av molariteten. Denna artikel presenterar estrogenicities av PCP extrakt kvantifieras med hjälp av både ONPG och CPRG.
Kvantifiera östrogeniciteten av miljöprov med både ERα och ERβ är en mer omfattande metod än att använda endast en av dessa receptorer. Djur uppvisar dessa receptorer differentiell vävnadsdistribution, tillsynsverksamhet och bindande tillhörighet för östrogena och Anti-östrogena ligander15. Till exempel, bind växtbaserad fytoöstrogener vanligtvis ERβ mer starkt2, medan syntetiska kemikalier kan visa preferens för antingen ERα eller ERβ eller kan binda båda receptorer lika väl15. Bindning till en östrogenreceptor därför inte nödvändigtvis förutsäga bindning till den andra.
Även om EEs finns i många konsumentprodukter (t.ex., bekämpningsmedel, rengöringsmedel, lim, smörjmedel, plast, livsmedel och läkemedel) liksom växter, presenterade uppgifter erhölls med ett urval av PCP. PCP är övertygande, lätt tillgängliga, budgetvänligt och miljömässigt relevanta för studenter. Studenter kan inbjudas att ta deras favorit PCP hemifrån att testa i laboratoriet. De kan också söka i huden djup databasen som utvecklats av Environmental Working Group16 för att generera hypotes-driven jämförelser av PCP med hög och låg toxicitet noter. På detta sätt kan studenter samtidigt utveckla avancerade laboratorium färdigheter; självstyrd, undersökande lärande; och utforska nya problem i miljövetenskap och hälsa.
Ja är en låg kostnad metod som används för att upptäcka östrogena ligander i miljöprov, såsom vatten, mat, växt vävnader eller personliga hygienprodukter. Data presenteras här jämför 2 östrogenreceptorer (ERα och ERβ), 2 substrat (ONPG och CPRG) och 2 tidslinjer (2 d utan kylning) och sju dagars protokollet med kyl för att mäta östrogeniciteten i personlig vårdprodukter via Ja analysen. 7 d, kylda protokoll använder CPRG och jäst att uttrycka ERα och/eller ERβ bäst kvantifierar EEQs medan också kompatibel med tidsbrist beslutas av grundutbildning laboratorium-kurser som uppfyller endast en gång / vecka för flera h. I själva verket var jämfört med 2 d analysen utan kylning, sju dagar kyld analysen associerade med minskad varians över plattan replikat. Dessutom utökades något den linjära delen av standardkurvan för data som samlas in med kylda analys. Den linjära delen av standardkurvan definierar assay detektionsområdet och är den enda delen av standardkurvan som kan användas för att interpolera provet EEQs.
I alla utom en av de testa proverna var EEQs mätt med CPRG lägre än de kvantifierade med ONPG. Med en högre extinktionskoefficient och lägre Km och Vmaxär CPRG tio gånger känsligare än ONPG17. Således, CPRG kan användas vid lägre koncentrationer och kan användas för att detektera lägre mängder β-galaktosidas. Av dessa skäl är CPRG generellt att föredra över ONPG18,19. Större substrat känslighet förklarar dock inte de lägre EEQ värdena upptäcks med CPRG. Högre EEQ värden upptäcks med ONPG kan bero på matrix störningar med analys, som påpekas av andra författare2,18. Gula pigment från personlig vård produkt extrakt kunde blåsa EEQ värden upptäcks med ONPG. Andra har kringgått problemet genom pigment kontroller i deras experimentell design2, ett synsätt som fördubblar antalet plattor i ett experiment. När matrix störningar kan vara problematiskt, kan CPRG vara att föredra substrat för Ja analysen, även om det är dyrare och kräver längre inkubationstider än ONPG. Dessutom är den färgförändring som induceras genom klyvning av substrat av β-galaktosidas mer dramatisk med CPRG, vilket gör det lättare för eleverna att visualisera resultat.
Miller et al. (2010), som konstruerade den jäst som används i detta protokoll, noterade att jäst som uttrycker ERβ var 30 x mer känsliga för 17β-Östradiol än jäst uttrycker ERα, ett konstaterande som styrks av våra data14. Bortsett från eventuella nyanser i plasmiden konstruktion, Miller et al. (2010) kunde inte förklara denna skillnad i känslighet14. En skillnad mellan de två plasmid konstruktioner är att ERα uttryck är reglerat av galaktos, ERβ uttryck regleras av antingen glukos eller galaktos. Jästen används i Ja analysen är odlade i glukos media och endast ges galaktos när de späds ut i början av analysen. Jäst som uttrycker ERβ kan därför ackumuleras högre kopia antalet receptor protein före starten av analysen, vilket ger högre ljuskänslighet östrogena ligander.
Lägre känslighet för ERα-uttryckande jäst kan förklara den högsta andelen icke-påvisande av östrogeniciteten i prover mätt med ERα jämfört med ERβ. För att öka sannolikheten kommer att provet EEQs att upptäckas, användare kunde anställa olika extraktionsmedel och metoder eller lägga till högre volymer av provet i jästen. Om högre provvolymer används bör koncentrationerna av E2 standarder justeras så att samma volym av standarder och prover kan användas i analysen. En begränsning av att lägga till fler prov är att jäst kan tolerera endast 6-10% etanol, med bättre tolerans vid inkubation temperaturer på 30 vs 35 ° C20. För att styra för effekter av etanol på jäst, bör utredare lägga till tre exemplar ”svampinfektion bara” brunnar i plattan layouten och bekräfta att den OD610 av dessa ”svampinfektion bara” brunnar är jämförbar med den OD610 av fordonet kontrollbrunnar omedelbart efter tillsats av Lindholm buffert. Alternativt kan prover löst i etanol läggas till torr mikrobrunn tallrikar och etanolen avdunstat innan jästen tillsätts. Dimetylsulfoxid (DMSO) används också som ett prov lösningsmedel i Ja-analyser, men slutliga arbetande koncentration DMSO med jäst bör begränsas till 1%12.
Ja analysen är ett kraftfullt screeningverktyg för att identifiera östrogeniciteten i miljöprover. Specifikt, upptäcker Ja ligander som binder nukleära östrogenreceptorer som samverkar med östrogen svar element direkt gen uttryck14. Ja har dock också viktiga begränsningar. Ja identifierar inte EEs som arbetar genom icke-nukleära mekanismer såsom membran östrogenreceptorer eller mekanismer som innebär ytterligare inslag såsom Activator Protein 1 (AP-1) transkriptionsfaktorer. Dessutom eftersom jäst inte har samma metaboliska kapacitet som däggdjursceller, kan inte Ja upptäcka ligander som kräver metabolisk aktivering vara östrogena.
Ja analysen inte kan dessutom lätt skilja mellan östrogena och Anti-östrogena ligander i komplexa prover. Istället mäter det netto östrogeniciteten, vilket är summan effekten av östrogena och Anti-östrogena ligander. För att kvantifiera koncentration av ER antagonister eller utvärdera den hämmande effekten av blandningar, kan analysen ändras genom ruvning jäst med både den standard agonist (17β-estradiol) och ett utbud av prov prov koncentrationer12. Denna process bestämmer om antagonister i proverna kan minska agonist-inducerad reporter aktivitet och ger en användbar skärm för att identifiera närvaron av ER antagonister i prover.
Det protokoll som presenteras här rymmer en mängd olika typer av prov, även om vissa prover kan kräva ändringar av utvinning och prov förberedelsestegen. Exempelvis EEQs varierade kraftigt bland replikerar av vissa personliga hygienprodukter. Mer rörlig proverna tenderade att innehålla oljedroppar eller var annars inte helt homogen, vilket indikerar att ett mer lipofila lösningsmedel såsom dietyleter skulle vara till hjälp. Alternativt, oljor och vax i kroppsvårdsprodukter kunde uteslutas genom att extrahera prover med 50% etanol i stället för 100% etanol.En 50% etanol utvinning kommer också fånga mer vattenlösliga östrogena ligander (t.ex., vissa pigment). Men 50% etanol förångas långsammare än 100% etanol och därmed förlänga utvinning tid. Dessutom var några prover (såsom tvålar) cytotoxiska för jäst, vilket resulterar i minskad cell densiteten mätningar (OD610). Fox et al. (2008) föreslår att sådana prover bör spädas ut och testas om cell densiteten skillnader överstiger 30% jämfört med fordon kontroll brunnar12.
Om ja analysen används för analytiska forskningsändamål, kan utspädning kurvor av provet pooler testas för att preemptively fastställa lämpliga volymer av extraktet läggas till jäst i steg 4,5. Alternativt, extrakt kan provas samtidigt på flera volymer (t.ex., 5 µL och 20 µL extract tillsätts jäst i steg 4,5) eller utspädningar som spänner över flera storleksordningar (t.ex., 0.2 µL, 2 µL och 20 µL). ”Lämpligt” volymer av extrakt är de som identifierar östrogeniciteten genom att matcha Lindholm värden längs den linjära delen av standardkurvan. Optimering förhindrar problem som orsakas av att lägga för mycket eller för lite prov till jästen, såsom cytotoxicitet, falska negativa eller östrogeniciteten som överskrider standardkurvan. Som nämnts ovan, bör volymerna av prover och E2 standarder justeras när olika mängder ligand används sådana att jäst är utsatta för en konsekvent volym och koncentration av etanol eller andra fordon över plattan.
Trots risken för falskt negativ, har ja analysen identifierats som en Tier 3 testverktyg för hormonstörande ämnen av Schug m.fl. (2013), som utvecklade en omfattande nivåindelade protokoll för endokrina störningar (TiPED)21. För grundutbildningen är analysen värdefulla för undervisning begrepp relaterade till endokrina störningar, cellodling, receptorbindning, enzymaktivitet, genteknik, statistik och försöksplanering. Studenter som använder analysen också öva grundläggande och allmänt tillämpliga laboratorium färdigheter såsom seriellt späda normer. utvinna prover; göra-lösningar; att konstruera och interpolera standard kurvor; beräkning av koncentrationer. göra-lösningar; visar steril teknik; odling av celler; att identifiera variabler och kontroller. samla, ordna och analysera data. konstruera och tolka grafer; och använder vanlig laboratorieutrustning såsom Mikropipetter och spektrofotometrar.
The authors have nothing to disclose.
Detta projekt har finansierats av start-up finansiering till TME och AMR från Louisiana Tech University och Furman University, respektive. Ytterligare finansiering tillhandahölls av 2015 fakulteten avancemang bidrag till AMR och TME från den associerade högskolor i söder, Louisiana EPSCoR Pfund bidrag till TME från National Science Foundation och Louisiana styrelsen av regenterna och en travel award till TME från den Universitet i söder. Vi tackar Dr. David Eubanks (Furman) för hjälp med statistiska analyser och Mr Christopher Moore för ”ge oss en hand” under inspelningen.
Equipment | |||
Vortex Mixer (for single or multiple tubes) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 02-215-365 | Any mixer will suffice. |
Bucket centrifuge | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 75-063-839 | Any bucket centrifuge will suffice if it is capable of centrifuging conical tubes at 4000 rpm. |
Bunsen burner | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 17-012-823 | Any Bunsen burner will suffice, or an alcohol burner (Fisher Scientific 04-245-1) can be used instead. |
Incubator | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 50125590H | Any incubator will suffice if it is capable of maintaining 30 °C. |
Microplate reader | BioTek (www.biotek.com) | EPOCH2 | A different brand of plate reader will suffice if it can measure absorbance at wavelengths of 405, 574, and 610 nm. |
Gen5 microplate reader and imager software | BioTek (www.biotek.com) | GEN5 | Software required depends on make and model of plate reader; GEN5 software is intended for use with BioTek plate reader. |
Refrigerator | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 05LREEFSA | Any refrigerator will suffice if it is capable of maintaining 4 °C. |
Pipettor or PipetAid compatible with 1-10 ml serological pipets | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 13-681-15E | Any pipettors will suffice if they are compatible with 1- and 10-ml serological pipets. |
P10 micropipettor | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | F144562G | Any micropipettor will suffice if it is capable of dispensing 5 µl. |
P200 micropipettor | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | F144565G | Any micropipettor will suffice if it is capable of dispensing up to 200 µl. |
P300 multichannel pipettor | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | FBE1200300 | Any multichannel pipettor will suffice if it is capable of dispensing 50 to 205 µl. |
Repeating pipettor | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | F164001G | Must be able to deliver 100-320 µl; this pipettor is optional because a multichannel pipettor can be used instead. |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Supplies | |||
Sterile 15-ml conical tubes with caps | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 05-539-801 | |
Glass scintillation vials | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 03-337-4 | |
Polystyrene 96-well, flat-bottom microplates with lid (non-sterile) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 12565501 | |
Polypropylene 96-well, flat-bottom microplates without lid | Cole-Parmer (www.coleparmer.com) | EW-01728-81 | |
100 ml glass beakers | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 02-539H | Any glass beakers will suffice if they are autoclavable. |
250 ml glass Erlenmeyer flasks | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | FB500250 | Any glass Erlenmeyer flasks will suffice if they are autoclavable. |
Sterile, adhesive, porous film | VWR (www.vwr.com) | 60941-086 | |
Metal forceps | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 12-000-157 | Any metal forceps will suffice. |
Reagent reservoir | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 07-200-127 | |
Filtration units (0.2 µm) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 09-761-52 | |
Squirt bottle (for ethanol) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 02-897-10 | Any laboratory squirt bottles will suffice. |
Autoclavable storage bottles | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 06-414-1D | Any autoclavable glass storage bottles will suffice. |
10 ml glass serological pipets (sterile) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 13-678-27F | Any glass serological pipets will suffice. |
1 ml glass serological pipets (sterile) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 13-678-27C | Any glass serological pipets will suffice. |
P10 micropipettor tips | USA Scientific (www.usascientific.com) | 1120-3810 | Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above. |
P200 micropipettor tips | USA Scientific (www.usascientific.com) | 1120-8810 | Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above. |
P300 micropipettor tips | USA Scientific (www.usascientific.com) | 1120-9810 | Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above. |
Syringe tips for repeating pipettor | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | F164150G | Only required if a repeating pipettor is used. |
Sterile petri dishes | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | FB0875712 | Any sterile petri dishes will suffice. |
Parafilm | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | S37440 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Yeast | |||
Saccharomyces cerevisiae strains that lack the TRP1 gene product (e.g. W303a) | American Type Culture Company (ATCC) (www.ATCC.org) | MYA-151 | Recombinant yeast are also available upon request from the authors. |
Receptor/reporter plasmid for ERα | Addgene (www.addgene.org) | pRR-ERalpha-5Z (Plasmid #23061) | |
Receptor/reporter plasmid for ERβ | Addgene (www.addgene.org) | pRR-ERbeta-5Z (Plasmid #23062) | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chemicals | |||
Difco agar | BD (www.bd.com) | 214530 | |
Dithiothreitol | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | D0632 | CAUTION: Dithiothreitol is an acute skin and eye irritant. Use appropriate personal protection equipment (gloves, fume hood, dust mask) to avoid skin and eye contact, inhalation and ingestion. |
Ortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | N1127 | |
Chlorophenol red-β-D-galactopyranoside | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | 10884308001 | |
Yeast nitrogen base | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | Y0626 | |
Glucose | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | G8270 | |
Galactose | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | G5388 | |
Adenine sulfate | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | A9126 | |
Uracil | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | U0750 | |
Leucine | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | L8000 | |
Histidine | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | H8000 | |
17 β-Estradiol | Sigma (www.sigmaaldrich.com) MP Biomedicals | E8875-250 mg 0219456401 – 1 mg | CAUTION: Estradiol is a suspected carcinogen and reproductive toxicant. It is harmful if inhaled, swallowed, or absorbed through skin. Estradiol may cause harm to breast-fed children and fetuses. Estradiol is very toxic to aquatic life. Use appropriate personal protection (gloves, fume hood, dust mask) and avoid exposure during pregnancy and lactation. Estradiol should be disposed of as hazardous waste and not released to the environment. |
100% ethanol | Pharmco-Aaper (www.pharmcoaaper.com) | 111000200 | |
Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | S9638 | |
Sodium phosphate dibasic (anhydrous) | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | S0876 | |
Magnesium chloride | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | M8266 | |
Potassium chloride | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | P9333 | |
Sarkosyl (N-lauroylsarcosine sodium salt) | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | L5125 | |
Sodium carbonate | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | S7795 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
Excel spreadsheet software | Microsoft | Excel is convenient spreadsheet software for managing data outputs and generating .csv files for R analysis. | |
Java software (required for Appendix 1 application) | Oracle Corporation | To calculate LacZ values using the application in Appendix 1, first download free Java software (https://www.java.com/en/download/), then open the LacZ application in Appendix 1. LacZ results created by the application can be copied by pressing "control (ctrl) + c" on PC keyboards, or "command + c" on Mac keyboards. | |
JMP statistical software version 13.0.0 | SAS Institute | Appendix 2 includes directions on using JMP to fit LacZ data to a four-parameter logistic regression curve. The curve is used to interpolate test sample estradiol equivalents (EEQs), relative to the estradiol standard curve. | |
R statistical computing and graphics software | R Foundation | Free R software can be downloaded from https://www.r-project.org/. Directions and code for using R to fit LacZ data to a four-parameter logistic regression curve are given in Appendix 2. |