Este artigo apresenta uma tela de estrogênio fermento otimizado para quantificação dos ligands em produtos de cuidados pessoais (PCP) que ligam alfa de receptores de estrógeno (ERα) e/ou beta (ERβ). O método incorpora duas opções de substrato colorimétrico, uma seis dias incubação refrigerada para uso em cursos de graduação e ferramentas estatísticas para análise de dados.
A tela de estrogênio de levedura (Sim) é usado para detectar ligantes estrogênicos em amostras ambientais e tem sido amplamente aplicada em estudos de disrupção endócrina. Estrogênicos ligantes incluem tanto natural como artificial “ambiental estrógenos” (EEs) encontrado em muitos bens de consumo, incluindo alimentos, plásticos, pesticidas e produtos de cuidados pessoais (PCP). EEE perturbar hormônio sinalização em seres humanos e outros animais, potencialmente reduzindo a fertilidade e aumentar o risco de doença. Apesar da importância da EEs e outros endócrino perturbar químicos (CDE) para a saúde pública, endócrina não está normalmente incluída em currículos de graduação. Esta lacuna é em parte devido à falta de atividades de laboratório pertinente que ilustram os princípios envolvida estando também acessível para estudantes de graduação. Este artigo apresenta um otimizado Sim para quantificação dos ligands em produtos de cuidados pessoais que ligam alfa de receptores de estrógeno (ERα) e/ou beta (ERβ). O método incorpora um dos dois substratos colorimétricos (orto– nitrofenil-β-D-galactopyranoside (ONPG) ou clorofenol vermelho-β-D-galactopyranoside (CPRG)) que são clivados por β-galactosidase, uma incubação refrigerada 6 dias passo para facilita a utilização em cursos de graduação do laboratório, uma aplicação automatizada para cálculos de LacZ e código R para a análise de regressão logística de 4 parâmetros associados. O protocolo foi projetado para permitir que os alunos de graduação, desenvolver e conduzir experimentos nos quais eles tela produtos de sua escolha para estrogênio imita. No processo, eles aprendem sobre endócrina, cultura celular, ligação ao receptor, atividade enzimática, engenharia genética, estatística e delineamento experimental. Simultaneamente, também praticam as habilidades fundamentais e amplamente aplicável de laboratório, tais como: cálculo de concentração; fazendo soluções; demonstrando a técnica estéril; diluição em série normas; construir e interpolação curvas padrão; identificação de variáveis e controles; coletar, organizar e analisar dados; construção e interpretação de gráficos; e utilizando equipamentos comuns de laboratório tais como micropipettors e espectrofotômetros. Assim, implementar este ensaio incentiva os alunos a se envolver em aprendizagem baseada em inquérito enquanto explora questões emergentes em ciências ambientais e saúde.
A tela de estrogênio de levedura (Sim) é amplamente utilizado para quantificar ligantes que imitam o estradiol (E2 ou 17 β-estradiol) em uma variedade de matrizes, incluindo água, tecidos vegetais, produtos de consumo e alimentos1,2,3, 4. Coletivamente, esses ligantes são denominados “Estrogênios ambientais (EEs).” O sim foi originalmente desenvolvido como um baixo custo, em vitro alternativa para testes in vivo como o roedor uterotrophic ensaio5,6 e a truta de arco-íris alimentação ensaio7. O objectivo destes testes é para determinar se um produto contém substâncias químicas que estimulam ou bloqueiam os mecanismos dependentes de estrogênio. Detecção de EEs é crítica, porque eles podem interferir com o normal estrógeno endógeno, sinalização, particularmente durante o desenvolvimento fetal. Esta interferência compromete a saúde, aumentando o risco de obesidade, infertilidade, câncer e perda cognitiva8.
Apesar da importância da EEE e outras CDE para a saúde pública, endócrina não é comumente incluída nos currículos de graduação. Essa deficiência é em parte devido a uma escassez de actividades que ilustram os princípios envolvida estando também acessível para estudantes de graduação. Além disso, diversas variações do protocolo Sim existem9,10,11,12,13, e essa diversidade faz ensaio otimização demorado para coordenadores de laboratório não especificamente treinados nas técnicas relevantes. Finalmente, sim ensaios são geralmente completou mais de 1 dia ou 2 dias consecutivos, com uma incubação O/N. Neste momento não é compatível com o formato dos cursos de graduação do laboratório, que normalmente satisfazem uma vez / semana por várias horas.
Em resposta a essas necessidades, este manuscrito relata um protocolo otimizado de Sim 96 poços que inclui métodos de extração de etanol para produtos de higiene pessoal (PCP)3 e uma etapa de refrigeração de 6 dias para acomodar reuniões semanais de laboratório. Etanol absoluto é um solvente orgânico versátil que pode dissolver uma variedade de solutos polares e apolares. Além disso, é apropriado para cursos de graduação, porque é prontamente disponível, relativamente não tóxico, acessível e miscível com a água; também evapora facilmente sem equipamentos especiais. No entanto, o etanol não é ideal para extrair fortemente hidrofóbicos desreguladores endócrinos ou muitos óleos e ceras, os dois últimos sendo ingredientes comuns em PCP. eficiência de extração pobre aumenta o risco de resultados negativos falsos. Com essa restrição em mente, investigadores devem escolher procedimentos de extração (por exemplo, extração etanólica ou extração de fase sólida) esse endereço amostra características e objetivos do estudo (pesquisa contra graduação instrução).
O Sim depende recombinante Saccharomyces cerevisiae , originalmente criado por Dr. Charles Miller, na Universidade de Tulane. Por favor veja Miller et al (2010) para um mapa completo do plasmídeo engenharia14. Fermento transformado com estes plasmídeos constitutivamente expressa humana ERα nuclear ou ERβ (também chamado ESR1 e ESR2, respectivamente) quando cultivadas em meios contendo galactose (para ERα) ou glicose ou galactose (para ERβ). Se produtos químicos estrogênicos estão presentes na mídia, eles se ligam aos receptores, criando complexos ligante-receptor que ativam a expressão de β-galactosidase (lacZ) a um nível proporcional à concentração de químicos estrogênicos. Células de levedura lysed então para liberar a β-galactosidase acumulada. A Lise contém ONPG ou CPRG, que são clivados por β-galactosidase para produzir produtos de amarelos ou vermelhos, respectivamente. Produtos colorimétricos podem ser quantificados, medindo a absorbância usando um Espectrofotômetro de placa de micropoços. O grau de mudança de cor é proporcional à concentração de ligantes estrogênicos, aos quais o fermento foi exposto.
A escolha do substrato (CPRG ou ONPG) varia de acordo com o potencial de absorvância fundo decorrentes as amostras sendo testadas. Por exemplo, extratos de plantas muitas vezes irão adicionar uma tonalidade amarela para a mídia que infla artificialmente medidas estrogenicity se ONPG (quantificado em 405 nm) é usado como substrato para a β-galactosidase. Com extractos vegetais, CPRG (quantificado em 574 nm) pode ser um substrato colorimétrico mais apropriado. CPRG é mais caro que ONPG mas é usado em um décimo a molaridade. Este artigo apresenta estrogenicities de PCP extratos quantificados usando ONPG e CPRG.
Quantificar estrogenicity de amostras ambientais usando ERα e ERβ é uma abordagem mais abrangente do que usando apenas um destes receptores. Em animais, estes receptores apresentam distribuição tecidual diferencial, actividades regulamentares e afinidades de ligação por ligantes estrogênicas e anti-estrogênicas15. Por exemplo, fitoestrogênios à base de plantas tipicamente bind ERβ mais fortemente2, Considerando que os produtos químicos sintéticos podem mostrar preferência por ERα ou ERβ ou podem ligar os dois receptores igualmente bem15. Por conseguinte, ligação ao receptor de estrogênio de uma não necessariamente prever vinculação ao outro.
Embora EEs são encontrados em muitos produtos de consumo (por exemplo, pesticidas, detergentes, adesivos, lubrificantes, plásticos, alimentos e produtos farmacêuticos), assim como as plantas, os dados apresentados foram obtidos usando uma seleção de PCP. PCP é convincentes, prontamente disponível, orçamento-friendly e ambientalmente relevantes para alunos de graduação. Os alunos podem ser convidados a trazer seus favoritos PCP de casa para testar no laboratório. Eles também podem procurar o banco de dados Skin Deep desenvolvido pelo grupo de trabalho ambiental16 para gerar comparações orientado a hipótese de PCP com alta e baixa partituras de toxicidade. Desta forma, os alunos podem simultaneamente desenvolver habilidades de laboratório avançado; envolver-se na aprendizagem auto-dirigida, baseada em inquérito; e explorar questões emergentes em ciências ambientais e saúde.
O sim é um método de baixo custo usado para detectar ligantes estrogênicos em amostras ambientais, tais como água, comida, tecidos vegetais ou produtos de cuidados pessoais. Dados apresentados aqui comparar 2 receptores de estrógeno (ERα e ERβ), 2 substratos (ONPG e CPRG) e 2 cronogramas (2 d protocolo sem refrigeração) e protocolo de sete dias com refrigeração para medir estrogenicity em produtos de cuidados pessoais através do ensaio de Sim. A 7D, protocolo refrigerado usando CPRG e levedura expressando ERα e/ou ERβ melhor quantifica EEQs enquanto também compatível com as restrições de tempo impostas pelos cursos de graduação do laboratório que atendem apenas uma vez / semana por várias horas. Na verdade, comparado com o ensaio 2 d sem refrigeração, o ensaio de sete dias refrigerado foi associado com variância reduzida através de repetições de placa. Além disso, a parte linear da curva padrão foi ligeiramente ampliada para dados coletados usando o ensaio de refrigerados. A porção linear da curva padrão define a escala da deteção do ensaio e é a única parte da curva padrão que pode ser usada para interpolar EEQs amostra.
Em todos, mas uma das amostras testadas, EEQs medidos usando CPRG eram inferiores aos quantificado com ONPG. Com um maior coeficiente de extinção e baixa Km e Vmax, CPRG é dez vezes mais sensível que ONPG17. Assim, CPRG pode ser usado em concentrações inferiores e pode ser usado para detectar a menor quantidade de β-galactosidase. Por estas razões, CPRG é geralmente preferível ONPG18,19. No entanto, maior sensibilidade de substrato não explica os valores mais baixos de EEQ detectado com CPRG. Os valores mais elevados de EEQ detectados com ONPG poderiam ser devido à interferência de matriz com o ensaio, como foi observado por outros autores2,18. Pigmentos amarelos de extratos de produtos de cuidados pessoais podem inflar valores EEQ detectados com ONPG. Outros têm contornado esse problema, incluindo controles de pigmento em seu projeto experimental2, uma abordagem que dobra o número de placas em um experimento. Quando a interferência de matriz pode ser problemática, CPRG pode ser um substrato preferível para o ensaio de Sim, porém é mais caro e exige tempos de incubação mais do que de ONPG. Além disso, a mudança de cor induzida pela clivagem de substrato por β-galactosidase é mais dramática com CPRG, tornando mais fácil para os alunos a Visualizar resultados.
Miller et al . (2010), quem projetou o fermento utilizado no presente protocolo, observou aquele fermento expressando ERβ foram 30 x mais sensíveis ao 17 β-estradiol que fermento expressando ERα, uma conclusão fundamentada por nossos dados14. Além de nuances possíveis na construção do plasmídeo, Miller et al . (2010) não poderia explicar essa diferença de sensibilidade14. Uma diferença entre as duas construções de plasmídeo é que a expressão ERα é regulada pela galactose, enquanto expressão de ERβ é regulada por glicose ou galactose. O fermento utilizado no ensaio de Sim são cultivadas em meios de glicose e só dado galactose, quando eles são diluídos no início do ensaio. Portanto, levedura expressando ERβ pode acumular maior número de cópias das proteínas do receptor antes do início do ensaio, conferindo assim maior sensibilidade para ligantes estrogênicos.
A baixa sensibilidade de levedura ERα-expressando pode explicar as maiores taxas de não-detecção de estrogenicity em amostras medidos com ERα comparado com ERβ. Para aumentar a probabilidade de que a amostra EEQs será detectado, usuários poderiam empregar métodos e solventes de extracção diferentes ou adicionar mais elevados volumes de amostra para o fermento. Se maiores volumes de amostra são usados, as concentrações dos padrões E2 devem ser ajustadas de tal que o mesmo volume de amostras e padrões pode ser usado no ensaio. Uma limitação da adição de amostra mais é que o fermento pode tolerar apenas 6-10% de etanol, com melhor tolerância a temperaturas de incubação de 30 vs 35 ° C20. Para controlar para os efeitos do álcool na levedura, os investigadores devem adicionar triplicado “fermento apenas” poços para o layout da placa e confirmar que o OD610 desses poços “fermento apenas” é comparável do OD610 dos poços de controle do veículo imediatamente após a adição de buffer de LacZ. Alternativamente, as amostras em etanol podem ser adicionadas a placas de micropoços seco e o etanol evaporado fora antes de levedura são adicionados. Dimetilsulfóxido (DMSO) é também usado como um solvente da amostra em Sim ensaios, mas a concentração de trabalho final de DMSO com fermento deve ser limitada a 1%12.
O ensaio de Sim é uma ferramenta poderosa de triagem para detecção de estrogenicity em amostras ambientais. Especificamente, o Sim detecta ligandos que se ligam a receptores de estrogênio nuclear que interagir com elementos de resposta de estrogênio para direcionar a expressão de gene14. No entanto, o sim também tem limitações importantes. O sim não detecta EEs que funcionam através de mecanismos não-nucleares, tais como receptores de estrogênio de membrana ou mecanismos que envolvem elementos adicionais tais como fatores de transcrição de ativador da proteína 1 (AP-1). Além disso, porque o fermento não têm a mesma capacidade metabólica como células de mamíferos, o sim não consegue detectar ligantes que requerem ativação metabólica para ser estrogênicos.
Além disso, o ensaio é prontamente não pode diferenciar entre estrogênicas e anti-estrogênicas ligantes em amostras complexas. Em vez disso, mede estrogenicity líquido , que é o efeito de soma de ligantes estrogênicas e anti-estrogênicas. Para quantificar a concentração dos antagonistas de ER ou avaliar a atividade inibitória de misturas, o ensaio pode ser modificado por incubando a levedura com o agonista padrão (17 β-estradiol) e um intervalo de teste de amostra concentrações12. Este processo determina se antagonistas nas amostras podem diminuir a atividade de repórter induzida pelo agonista e fornece uma tela útil para identificar a presença de antagonistas de ER em amostras.
O protocolo apresentado aqui pode acomodar uma variedade de tipos de amostra, embora algumas amostras podem exigir modificações para as etapas de preparação de extração e amostra. Por exemplo, EEQs variadas amplamente entre repetições de alguns produtos de cuidados pessoais. As amostras mais variáveis tendem a conter gotículas de óleo, ou caso contrário não eram inteiramente homogêneas, indicando que um solvente mais lipofílico como éter dietílico seria útil. Alternativamente, óleos e cera em produtos de cuidados pessoais podem ser excluídas por extrair amostras com 50% de etanol em vez de 100% de etanol.Uma extração de etanol 50% também irá capturar mais ligantes estrogênicos solúvel em água (por exemplo, alguns pigmentos). No entanto, 50% etanol evapora mais lentamente do que o etanol 100% e assim pode estender o tempo de extração. Além disso, algumas amostras (tais como sabões) foram citotóxicas para levedura, resultando em medições de densidade celular reduzida (OD610). Fox et al . (2008) sugerem que tais amostras devem ser diluídas e retestadas se as diferenças de densidade celular excederem 30% em relação ao veículo controle poços12.
Se o ensaio de Sim é usado para fins de investigação analítica, curvas de diluição das piscinas de amostra podem ser testadas para determinar preventivamente volumes adequados de extrato para ser adicionado a levedura na etapa 4.5. Alternativamente, extractos podem ser testados simultaneamente em vários volumes (por exemplo, 5 µ l e 20 µ l extrato adicionado ao fermento na etapa 4.5) ou diluições que abrangem ordens de magnitude (por exemplo, 0,2 µ l, 2 µ l e 20 µ l). “Apropriados” volumes do extrato são aquelas que identificam estrogenicity combinando LacZ valores ao longo da parte linear da curva padrão. Otimização evita problemas causados pela adição de amostra demasiado ou demasiado pouco para o fermento, como citotoxicidade, falso-negativos ou estrogenicity que excede a curva padrão. Como mencionado acima, os volumes de amostras e padrões de E2 devem ser ajustados quando diferentes quantidades de ligante são utilizadas tal que fermento estão expostos a um volume consistente e concentração de etanol ou outro veículo através da placa.
Apesar do potencial para falsos negativos, o ensaio de Sim foi identificado como uma ferramenta de teste de nível 3 para os desreguladores endócrinos por Schug et al (2013), que desenvolveu um abrangente protocolo hierárquico para disrupção endócrina (TiPED)21. Para o ensino de graduação, o ensaio é valioso para o ensino de conceitos relacionados à disrupção endócrina, cultura celular, ligação ao receptor, atividade enzimática, engenharia genética, estatística e delineamento experimental. Os alunos que usam o ensaio também praticam habilidades fundamentais e amplamente aplicável laboratório tais como diluir serialmente padrões; extração de amostras; fazendo soluções; construir e interpolação curvas padrão; cálculo de concentração; fazendo soluções; demonstrando a técnica estéril; cultivo de células; identificação de variáveis e controles; coletar, organizar e analisar dados; construção e interpretação de gráficos; e utilizando equipamentos comuns de laboratório tais como micropipettors e espectrofotômetros.
The authors have nothing to disclose.
Este projecto foi financiado pelo arranque financiamento TME e AMR de Louisiana Tech University e Universidade de Furman, respectivamente. Financiamento adicional foi fornecido por uma concessão de avanço de faculdade de 2015 para AMR e TME de The faculdades associadas do Sul, um subsídio de Louisiana EPSCoR Pfund para TME da National Science Foundation e o Conselho de regentes de Louisiana e um prêmio de viagem ao TME do Universidade do Sul. Agradecemos a Dr. David Eubanks (Furman) para obter assistência com análises estatísticas e Sr. Christopher Moore por “nos dar uma mão” durante as filmagens.
Equipment | |||
Vortex Mixer (for single or multiple tubes) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 02-215-365 | Any mixer will suffice. |
Bucket centrifuge | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 75-063-839 | Any bucket centrifuge will suffice if it is capable of centrifuging conical tubes at 4000 rpm. |
Bunsen burner | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 17-012-823 | Any Bunsen burner will suffice, or an alcohol burner (Fisher Scientific 04-245-1) can be used instead. |
Incubator | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 50125590H | Any incubator will suffice if it is capable of maintaining 30 °C. |
Microplate reader | BioTek (www.biotek.com) | EPOCH2 | A different brand of plate reader will suffice if it can measure absorbance at wavelengths of 405, 574, and 610 nm. |
Gen5 microplate reader and imager software | BioTek (www.biotek.com) | GEN5 | Software required depends on make and model of plate reader; GEN5 software is intended for use with BioTek plate reader. |
Refrigerator | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 05LREEFSA | Any refrigerator will suffice if it is capable of maintaining 4 °C. |
Pipettor or PipetAid compatible with 1-10 ml serological pipets | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 13-681-15E | Any pipettors will suffice if they are compatible with 1- and 10-ml serological pipets. |
P10 micropipettor | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | F144562G | Any micropipettor will suffice if it is capable of dispensing 5 µl. |
P200 micropipettor | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | F144565G | Any micropipettor will suffice if it is capable of dispensing up to 200 µl. |
P300 multichannel pipettor | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | FBE1200300 | Any multichannel pipettor will suffice if it is capable of dispensing 50 to 205 µl. |
Repeating pipettor | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | F164001G | Must be able to deliver 100-320 µl; this pipettor is optional because a multichannel pipettor can be used instead. |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Supplies | |||
Sterile 15-ml conical tubes with caps | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 05-539-801 | |
Glass scintillation vials | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 03-337-4 | |
Polystyrene 96-well, flat-bottom microplates with lid (non-sterile) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 12565501 | |
Polypropylene 96-well, flat-bottom microplates without lid | Cole-Parmer (www.coleparmer.com) | EW-01728-81 | |
100 ml glass beakers | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 02-539H | Any glass beakers will suffice if they are autoclavable. |
250 ml glass Erlenmeyer flasks | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | FB500250 | Any glass Erlenmeyer flasks will suffice if they are autoclavable. |
Sterile, adhesive, porous film | VWR (www.vwr.com) | 60941-086 | |
Metal forceps | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 12-000-157 | Any metal forceps will suffice. |
Reagent reservoir | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 07-200-127 | |
Filtration units (0.2 µm) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 09-761-52 | |
Squirt bottle (for ethanol) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 02-897-10 | Any laboratory squirt bottles will suffice. |
Autoclavable storage bottles | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 06-414-1D | Any autoclavable glass storage bottles will suffice. |
10 ml glass serological pipets (sterile) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 13-678-27F | Any glass serological pipets will suffice. |
1 ml glass serological pipets (sterile) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 13-678-27C | Any glass serological pipets will suffice. |
P10 micropipettor tips | USA Scientific (www.usascientific.com) | 1120-3810 | Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above. |
P200 micropipettor tips | USA Scientific (www.usascientific.com) | 1120-8810 | Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above. |
P300 micropipettor tips | USA Scientific (www.usascientific.com) | 1120-9810 | Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above. |
Syringe tips for repeating pipettor | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | F164150G | Only required if a repeating pipettor is used. |
Sterile petri dishes | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | FB0875712 | Any sterile petri dishes will suffice. |
Parafilm | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | S37440 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Yeast | |||
Saccharomyces cerevisiae strains that lack the TRP1 gene product (e.g. W303a) | American Type Culture Company (ATCC) (www.ATCC.org) | MYA-151 | Recombinant yeast are also available upon request from the authors. |
Receptor/reporter plasmid for ERα | Addgene (www.addgene.org) | pRR-ERalpha-5Z (Plasmid #23061) | |
Receptor/reporter plasmid for ERβ | Addgene (www.addgene.org) | pRR-ERbeta-5Z (Plasmid #23062) | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chemicals | |||
Difco agar | BD (www.bd.com) | 214530 | |
Dithiothreitol | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | D0632 | CAUTION: Dithiothreitol is an acute skin and eye irritant. Use appropriate personal protection equipment (gloves, fume hood, dust mask) to avoid skin and eye contact, inhalation and ingestion. |
Ortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | N1127 | |
Chlorophenol red-β-D-galactopyranoside | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | 10884308001 | |
Yeast nitrogen base | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | Y0626 | |
Glucose | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | G8270 | |
Galactose | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | G5388 | |
Adenine sulfate | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | A9126 | |
Uracil | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | U0750 | |
Leucine | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | L8000 | |
Histidine | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | H8000 | |
17 β-Estradiol | Sigma (www.sigmaaldrich.com) MP Biomedicals | E8875-250 mg 0219456401 – 1 mg | CAUTION: Estradiol is a suspected carcinogen and reproductive toxicant. It is harmful if inhaled, swallowed, or absorbed through skin. Estradiol may cause harm to breast-fed children and fetuses. Estradiol is very toxic to aquatic life. Use appropriate personal protection (gloves, fume hood, dust mask) and avoid exposure during pregnancy and lactation. Estradiol should be disposed of as hazardous waste and not released to the environment. |
100% ethanol | Pharmco-Aaper (www.pharmcoaaper.com) | 111000200 | |
Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | S9638 | |
Sodium phosphate dibasic (anhydrous) | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | S0876 | |
Magnesium chloride | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | M8266 | |
Potassium chloride | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | P9333 | |
Sarkosyl (N-lauroylsarcosine sodium salt) | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | L5125 | |
Sodium carbonate | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | S7795 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
Excel spreadsheet software | Microsoft | Excel is convenient spreadsheet software for managing data outputs and generating .csv files for R analysis. | |
Java software (required for Appendix 1 application) | Oracle Corporation | To calculate LacZ values using the application in Appendix 1, first download free Java software (https://www.java.com/en/download/), then open the LacZ application in Appendix 1. LacZ results created by the application can be copied by pressing "control (ctrl) + c" on PC keyboards, or "command + c" on Mac keyboards. | |
JMP statistical software version 13.0.0 | SAS Institute | Appendix 2 includes directions on using JMP to fit LacZ data to a four-parameter logistic regression curve. The curve is used to interpolate test sample estradiol equivalents (EEQs), relative to the estradiol standard curve. | |
R statistical computing and graphics software | R Foundation | Free R software can be downloaded from https://www.r-project.org/. Directions and code for using R to fit LacZ data to a four-parameter logistic regression curve are given in Appendix 2. |