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Biology

Détection des Ligands oestrogéniques dans les produits de soins personnels à l’aide d’une levure oestrogène écran optimisé pour le laboratoire d’enseignement de premier cycle

doi: 10.3791/55754 Published: January 1, 2018

Summary

Cet article présente un écran optimisé d’oestrogène pour quantifier les ligands dans les produits de soins personnels (PCP) qui lient l’alpha de récepteurs d’oestrogène (ERα) ou bêta (REβ). La méthode intègre deux options de substrat colorimétrique, une incubation réfrigérée de six jours pour une utilisation en cours de premier cycle et des outils statistiques pour l’analyse des données.

Abstract

L’écran levure de l’oestrogène (oui) est utilisé pour détecter des ligands oestrogéniques dans des échantillons environnementaux et a été largement appliqué dans l’étude de la perturbation endocrinienne. Ligands estrogenic incluent tant naturelles qu’artificielles « oestrogènes environnementaux » (See) trouvé dans de nombreux biens de consommation, y compris les produits de soins personnels (PCP), les plastiques, les pesticides et les aliments. ÉÉÉ perturber hormone signalisation chez les humains et autres animaux, potentiellement réduire la fertilité et augmenter le risque de maladie. Malgré l’importance des EEs et d’autres perturbateurs endocriniens (CPSE) pour la santé publique, la perturbation du système endocrinien n’est pas généralement incluse dans les programmes de premier cycle. Cette lacune est en partie à cause du manque d’activités de laboratoire concerné qui illustrent les principes impliquée tout en étant accessible aux étudiants de premier cycle. Oui, cet article présente un optimisé pour quantifier les ligands dans les produits de soins personnels qui unissent alpha de récepteurs d’oestrogène (ERα) ou bêta (REβ). La méthode intègre un des deux substrats colorimétriques (ortho- nitrophényl-β-D-galactopyranoside (ONPG) ou chlorophénol rouge-β-D-galactopyranoside (GPRC)) qui sont clivés par la β-galactosidase, une incubation de 6 jours réfrigérée étape à faciliter l’utilisation en cours de premier cycle de laboratoire, une application automatisée pour calculs LacZ et R code d’analyse associée à 4 paramètres de régression logistique. Le protocole a été conçu pour permettre aux étudiants de premier cycle élaborer et mener des expériences dans lesquelles ils écran produits de leur choix pour les oestrogènes mimétiques. Dans le processus, ils apprennent la perturbation endocrinienne, culture cellulaire, liaison aux récepteurs, l’activité enzymatique, génie génétique, statistiques et expérimental. Simultanément, ils pratiquent aussi des compétences fondamentales et largement applicable de laboratoire, tels que : calcul des concentrations ; produire des solutions ; démonstration technique stérile ; dilution en série de normes ; construction et interpolation des courbes standard ; identifier les variables et les contrôles ; recueillir, organiser et analyser les données ; construction et interprétation des graphiques ; et à l’aide d’équipement de laboratoire commun comme micropipettes et des spectrophotomètres. Ainsi, mise en œuvre de ce dosage encourage les élèves à s’engager dans l’apprentissage fondé sur la recherche tout en explorant les questions émergentes en sciences de l’environnement et la santé.

Introduction

L’écran levure de l’oestrogène (oui) est largement utilisé pour quantifier les ligands qui imitent l’estradiol (E2 ou 17β-estradiol) dans une variété de matrices, y compris l’eau, tissus végétaux, les produits de consommation et aliments1,2,3, 4. Collectivement, ces ligands sont appelés « Oestrogènes environnementaux (See). » L’oui a été initialement conçu comme un faible coût, en vitro alternative aux essais in vivo , comme le rongeur utérotrophique dosage5,6 et la truite arc-en-ciel alimentation dosage7. Le but de ces essais est de déterminer si un produit contienne des produits chimiques qui stimulent ou bloquent les mécanismes de œstrogène-dépendantes. Détection de See est cruciale, car ils peuvent interférer avec de l’oestrogène endogène normale, signalisation, particulièrement au cours du développement fœtal. Cette ingérence compromet la santé en augmentant le risque d’obésité, stérilité, le cancer et perte cognitive8.

Malgré l’importance des EEs et d’autres perturbateurs endocriniens pour la santé publique, perturbation endocrinienne n’est pas généralement incluse dans les programmes de premier cycle. Cette lacune est en partie en raison d’une pénurie d’activités qui illustrent les principes impliquée tout en étant accessible aux étudiants de premier cycle. En outre, plusieurs variantes du protocole oui il existe9,10,11,12,13, et cette diversité fait test optimisation beaucoup de temps pour coordonnateurs de laboratoire ne sont pas spécifiquement formés aux techniques pertinentes. Enfin, oui épreuves sont généralement complétées plus de 1 journée ou 2 jours consécutifs avec une incubation de O/N. Ce calendrier n’est pas compatible avec le format des cours de premier cycle de laboratoire, répondant généralement une fois / semaine pendant plusieurs heures.

En réponse à ces besoins, ce manuscrit rapporte un protocole optimisé d’oui de 96 puits qui inclut des méthodes d’extraction dans l’éthanol pour les produits de soins personnels (PCP)3 et une étape de réfrigération 6 jours pour accueillir les réunions hebdomadaires de laboratoire. L’éthanol absolu est un solvant organique polyvalent qui peut dissoudre une variété de solutés polaires et non polaires. En outre, il convient au cours de premier cycle parce qu’il est facilement disponible, relativement non toxique, abordable et miscible avec l’eau ; elle s’évapore aussi facilement sans équipement spécial. Cependant, l’éthanol n’est pas idéal pour l’extraction des Disrupteurs endocriniens fortement hydrophobes ou plusieurs huiles et cires, ces deux derniers étant des ingrédients communs PCPs. l’efficacité d’extraction pauvre augmente le risque de fausses résultats négatifs. Avec cette contrainte à l’esprit, les enquêteurs devraient choisir des procédés d’extraction (par exemple, éthanol extraction ou extraction en phase solide) caractéristiques de l’échantillon cette adresse et répondre aux objectifs de l’étude (recherche contre l’enseignement de premier cycle).

L’oui s’appuie sur recombinant Saccharomyces cerevisiae , créé à l’origine par le Dr Charles Miller à l’Université de Tulane. S’il vous plaît voir Miller et al. (2010) pour une carte complète de l' ingénierie plasmide14. Levure transformée avec ces plasmides constitutivement express humaine ERα nucléaire ou REβ (également appelés ESR1 et ESR2, respectivement) lorsqu’il est cultivé dans des milieux contenant du galactose (pour ERα) ou soit de glucose ou de galactose (par REβ). Si les produits chimiques oestrogéniques sont présents dans les médias, ils se lient aux récepteurs, création de complexes ligand-récepteur qui activent l’expression de la β-galactosidase (lacZ) à un niveau proportionnel à la concentration de produits chimiques oestrogéniques. Les cellules de levure sont ensuite lysées pour libérer la β-galactosidase accumulé. Le tampon de lyse contient ONPG ou GPRC, qui sont clivés par la β-galactosidase à déboucher sur des produits jaunes ou rouges, respectivement. Les produits colorimétriques peuvent être quantifiés en mesurant l’absorbance à l’aide d’un spectrophotomètre de plaque. Le degré de changement de couleur est proportionnel à la concentration des ligands oestrogéniques à laquelle la levure a été exposée.

Le choix du substrat (GPRC ou ONPG) dépend de la possibilité d’absorption de fond découlant des échantillons testés. Par exemple, les extraits de plantes ajoutera souvent une teinte jaune aux médias qui gonfle artificiellement mesures oestrogénicité si ONPG (quantifié à 405 nm) est utilisé comme substrat pour la β-galactosidase. Avec extraits, GPRC de plantes (quantifié à 574 nm) peut être un substrat colorimétrique plus approprié. GPRC est plus cher que l’ONPG, mais est utilisée à un dixième de la molarité. Cet article présente des estrogenicities du PCP extraits quantifiées à l’aide d’ONPG tant du GPRC.

Quantifier l’oestrogénicité des échantillons environnementaux au moyen des ERα et REβ est une approche plus complète qu’avec un seul de ces récepteurs. Chez les animaux, ces récepteurs pièce distribution tissulaire différentielle, activités de réglementation et les affinités de liaison des ligands oestrogéniques et anti-oestrogéniques15. Par exemple, à base de plantes phytoestrogènes lient REβ plus fortement2, tandis que les produits chimiques synthétiques peuvent montrer de préférence pour ERα ou REβ ou peuvent lier les deux récepteurs tout aussi bien15. Par conséquent, liaison au récepteur des une oestrogènes ne prédit pas nécessairement contraignant à l’autre.

Bien que les EEs sont trouvés dans de nombreux produits de consommation (p. ex., pesticides, détergents, adhésifs, lubrifiants, plastiques, aliments et produits pharmaceutiques) ainsi que les plantes, les données présentées ont été obtenues à l’aide d’une sélection de produits de soins personnels. produits de soins personnels sont convaincants, facilement disponible, abordable et respectueux de l’environnement pertinents pour les étudiants de premier cycle. Les étudiants peuvent être invités à apporter leurs produits préférés de la maison pour tester en laboratoire. Ils peuvent également rechercher la base de données Skin Deep, développé par l' Environmental Working Group16 pour générer des comparaisons sur des hypothèses de produits de soins personnels avec haut et bas scores de toxicité. De cette façon, étudiants peuvent développer simultanément les compétences avancées de laboratoire ; s’engager dans l’apprentissage autogéré, basée sur l’enquête ; et d’explorer les questions émergentes en sciences de l’environnement et la santé.

Protocol

1. la fabrication réactifs

  1. Préparer les médias de glucose et de galactose en mélangeant 6,7 g levure d’azote base, dextrose de 20Go ou galactose, sulfate d’adénine 20 mg (ajouté 10 ml d’une solution aqueuse stock de 200 mg/100 mL), uracile 20 mg (ajouté 10 ml d’une solution aqueuse stock de 200 mg/100 mL) , 60 mg leucine (ajouté dans 6 mL d’une solution aqueuse à 1 g/100 mL stock) et histidine 20 mg (ajouté dans 2 mL d’une solution aqueuse à 1 g/100 mL stock) dans l’eau déionisée pour un volume final de 1 L. stériliser par filtration (filtre de 0,2 µm). Médias peuvent être stockés à 4 ° C pendant plusieurs semaines.
  2. Préparer estradiol (E2) normes de dissolution E2 en poudre dans l’éthanol anhydre et en complétant les travail des concentrations appropriées (227,5 nM & 9,75 nM) dans l’éthanol à 50 %.
    Remarque : Si l’estradiol est acheté dans un flacon de 1 mg, ajouter 1 mL d’éthanol directement dans le flacon pour dissoudre la poudre d’estradiol. Cela donne un stock de 3,67 mM #1.  Diluer 10 μL de stock #1 dans l’éthanol μL 990 pour faire 1 mL de 36,71 stock μM #2.  Ensuite, diluer 10 μL de stock #2 990 μL 50 % d’éthanol pour faire 1 mL de 367.13 stock nM #3.  Pour faire des stocks de travail, diluer stock μL 619.7 #3 380.3 μL 50 % d’éthanol pour faire 1 mL de 227,5 stock de travail nM utilisé pour créer des courbes standard avec de la levure exprimant ERα.  Diluer le stock μL 26.56 #3 973.44 μL 50 % d’éthanol pour faire 1 mL de 9.75 stock de travail nM utilisé pour créer des courbes standard avec de la levure exprimant REβ. Sceller les normes avec parafilm et les conserver à -20 ou -70 ° C.
    ATTENTION : E2 est un cancérogène et toxique pour la reproduction. Il est nocif par inhalation, ingestion, ou absorbé par la peau. E2 peut nuire à l’allaitement des enfants et les fœtus. E2 est très toxique pour la vie aquatique. Utilisez une protection personnelle appropriée (gants, hotte aspirante, un masque à poussière) et évitez l’exposition pendant la grossesse et l’allaitement. Jeter les E2 comme des déchets dangereux et ne libèrent pas dans l’environnement.
  3. Préparer LacZ tampon en mélangeant 8,52 g Na2HPO4, 5,52 g NaH2PO4•H2O, mg 95,21 MgCl2, 745,5 mg KCl, sel de sodium de 2 g N-lauroylsarcosine et soit ONPG (400 mg) ou GPRC (77,7 mg) dans l’eau déionisée pour une finale volume de 1 L. magasin LacZ tampon en aliquotes de 20 mL à-20 ° C.
    Remarque : Une aliquote de 20 mL suffit pour une plaque à 96 puits.
  4. Préparer le carbonate de sodium en mélangeant 105,9 g de carbonate de sodium dans l’eau déionisée pour un volume final de 1 L. magasin à température ambiante.
  5. Préparer 1 M le dithiothréitol (DTT) dans l’eau. Gel de 25 µL d’extraits de la TNT à-20 ° C.
    ATTENTION : La TNT est une peau aiguë et irritant pour les yeux. Équipement approprié de protection individuelle (gants, hotte aspirante, un masque à poussière) permet d’éviter la peau et contact avec les yeux, inhalation et ingestion.
    Remarque : Chaque aliquote est suffisant pour une plaque à 96 puits.

2. préparation des échantillons et des contrôles de l’Extraction

  1. Prélever des échantillons à tester.
    Remarque : Cet article présente des données de quinze produits de soins personnels, y compris le savon, crème capillaire, shampoing, crème solaire, baume pour les lèvres, Fondation, crème à raser, vernis à ongles et lotion.
  2. Mélanger 1 g d’échantillon 10 ml d’éthanol anhydre dans un tube conique de 15 mL. Préparer un témoin négatif d’extraction, composée de 11 mL d’éthanol dans un tube conique de 15 mL. Préparer les répétitions selon les besoins.
    Remarque : Pour le protocole expérimental présenté, trois aliquotes de tous les 15 produits de soins personnels et des solutions de contrôle en triple extraction ont été préparés, ce qui donne un total de 48 échantillons, dont chacun a été analysée en trois exemplaires à l’aide du protocole dans l’article 4. Une seule plaque peut accueillir jusqu'à 23 échantillons en géométrie. L’éthanol anhydre est utilisée dans cette étape car elle s’évapore facilement. Contrôles négatifs d’extraction permet de vérifier que les oestrogènes ne sont pas lessivage dans les échantillons provenant des tubes coniques.
  3. Homogénéiser le contenu du tube pendant 30 min par une combinaison d’agitation manuelle et mélangé au Vortex ou en secouant les tubes sur un multi-tube vortexer.
  4. Centrifuger les tubes coniques à la vitesse maximale autorisée dans une centrifugeuse de seau pour 10 min. décanter le surnageant de chaque tube à travers un tamis de cellule de 40 µm dans un tube conique de 50 mL. Videz le contenu de chaque tube de 50 mL dans un flacon en verre de scintillation.
  5. Les flacons de congé ouvert sous une hotte ventilée pendant une semaine permettre à l’éthanol s’évapore complètement. Vous pouvez également sécher les échantillons sous une hotte ventilée sous atmosphère d’azote ou avec un évaporateur rotatif. Pour éviter la dégradation des composants sensibles légères, protéger séchage des échantillons de la lumière (p. ex., positionnez le tissu opaque au-dessus de la porte de hotte ventilée).
  6. Reconstituer les échantillons à 1,0 mL d’éthanol à 50 % et vortex pour homogénéiser.

3. mise en culture et en réalisant des sous-cultures levure14

  1. Maintenir des cultures de levure active (souche recombinante de W303a de S. cerevisiae14) en incubant des levures dans les médias de glucose stérilisée par filtration à 30 ° C. Levure sous-culture chaque semaine dans les milieux frais glucose stérilisée par filtration.
  2. Deux nuits (environ 42 h) avant de préparer les plaques Oui, sous-culture levure en ajoutant 0,1 mL de cultures de levure active à 10 mL de médias de glucose stérilisée par filtration à l’aide d’une technique stérile.  Incuber à 30 ° C pour deux nuits.  Secousse n’est pas nécessaire si les levures sont cultivés comme des cultures peu profondes dans l’Erlenmeyer de 250 mL stérile flacons.
    NOTE : Levure peut également être stocké sur des géloses réfrigéré pendant plusieurs mois. Pour une conservation plus longue durée (années), combiner les cultures O/N avec 15-50 % de glycérol stérile, vortex et gel à-70 ° C. Pour préparer le glycérol stérile, utiliser une seringue pour transférer 300 glycérol µL dans un cryovial et stériliser avec le bouchon desserré. Puis ajoutez 1 200 µL O/N levure culture en utilisant une technique stérile.

4. préparation Oui plaques (le 1er jour du test)

  1. Dans un bécher stérile et en utilisant une technique stérile, diluer la levure de l’étape 3.2 à une densité optique de ±0, 005 0,065 à 610 nm (OD610) dans les médias de galactose stérilisée par filtration.
    1. Confirmer la densité optique de pipetage 120 μL de chaque échantillon de levure en trois exemplaires, ainsi que des ébauches de galactose en triple dans une plaque de polystyrène clair (plaque n’a pas besoin d’être stérile).  Un spectrophotomètre de plaque permet de vérifier que la culture de levure dilué a un net de OD610 de 0,065 ±0, 005 OD610 soustraire lectures des ébauches de galactose de levure OD610 lectures pour déterminer le net OD610 de la levure. Préparer un volume final de levure de mL dilué au moins 30 pour chaque plaque de 96 puits.
      Remarque : Les filtres de spectrophotomètre mesure l’absorbance entre 595 et 610 nm peuvent être utilisés pour cette mesure.
Une approximation rapport v : v 1:6 de levure : médias entraîne généralement une OD610 à proximité de 0,065, alors commencez par ajouter la levure 4,5 mL à 30 mL de milieu et ajouter plus de levure ou de médias comme appropriées pour parvenir à un netOD610 entre 0,060 et 0,070.
  • Utilisant une technique stérile, ajouter cette suspension de levure diluée au puits d’une solution stérile, polypropylène, Microplaque 96 puits selon le schéma (Figure 1). Pendant le pipetage, éloigner la source de levure suspendu par continuellement tourbillonnant le conteneur ou le mélange avec la pipette. Pour cette étape, il est utile d’utiliser une pipette à répétition avec une seringue stérile.
    Remarque : Plaques en polypropylène sont stérilisés par autoclave deux empilées plaques enveloppés dans du papier.  La plaque supérieure sert un couvercle pour la plaque d’échantillon et peut être lavée, re-stérilisés à l’autoclave et réutilisés.
  • Ajouter 120 µL galactose stérilisée par filtration des données à 3 puits supplémentaires (H10 - 12) selon le schéma (Figure 1). Ces puits servent de commandes de médias pour tenir compte de l’absorption par les médias uniquement.
  • Construire la courbe d’étalonnage dans chaque assiette par dilution en série réanalysés des étalons de travail E2 (227,5 nM pour ERα, 9,75 nM pour REβ) dans les puits contenant la suspension de levure (A1 - G3) selon le schéma (Figure 1).  Commencez par en ajoutant 5 µL de normes E2 au puits A1 à A3. Mélanger le contenu de microtitration en pipettant également et puis en série Diluer cette suspension en déplaçant 205 µL par puits A1 - 3 dans les puits B1 - 3. Répéter le mélange et le transfert de 205 µL dans le rang G.
    Remarque : Lorsque la dilution en série est terminée, jeter 205 μL par puits G1 - 3. À la fin de cette étape, tous les puits standards devraient contenir 120 μL. La dilution en série permettra d’obtenir les concentrations finales de E2 énumérées au tableau 1. Pour les étapes de la dilution en série, il est utile d’utiliser une pipette multicanaux avec embouts stériles.
  • Ajouter 5 µL de véhicule (50 % d’éthanol) aux puits de contrôle de véhicule contenant la suspension de levure (H1 - 3) selon le schéma (Figure 1).
    Remarque : Les puits de contrôle véhicule servent à mesurer l’absorbance de fond associé avec les médias et les cellules de levure. En outre, des effets promotion cytotoxicité ou croissance d’essai peut être décelée en comparant les valeurs de610 OD de tester puits avec celles des puits de contrôle de véhicule.
  • Ajouter 5 réanalysés µL des échantillons et des contrôles négatifs d’extraction dans les puits contenant la suspension de levure selon le schéma (Figure 1).
    Remarque : Prenez note dont les échantillons ou les témoins négatifs d’extraction sont ajoutés à chaque puits.  Pour suivre les puits ont des échantillons et qui ne sont pas, commencez par une boîte frais de conseils et utilisez les conseils de mêmes endroits dans la zone que les emplacements des puits de la plaque correspondantes. Une plaque à 96 puits peut accueillir jusqu'à 23 échantillons en trois exemplaires.
  • Mélanger le contenu de l’échantillon, contrôle d’extraction et les puits de contrôle de véhicule par pipetage. Ajuster les volumes de ces puits à 120 µL en enlevant 205 µL de chacune, comme indiqué dans la légende de la Figure 1.
  • Joint de la plaque d’immatriculation avec un film adhésif, stérile et poreux. Étiquettes de marquage et incuber pendant 17 heures à 30 ° C. La plaque ne doit pas être secoué pendant l’incubation
  • 5. le traitement Oui plaques (le 2e jour du test)

    1. Après le 17 h d’incubation à 30 ° C, enlever les plaques de l’incubateur. Si les plaques seront traitées immédiatement, passer au point 5.1.1. Si les plaques seront traitées à une date ultérieure, passer au point 5.1.2.
      1. Utiliser une pipette multicanaux pour mélanger le contenu de chaque ligne des puits et puis transférer 50 µL de suspension de levure du chaque puits vers le correspondant bien d’une microplaque 96 puits, claire, polystyrène.
        Remarque : Les plaques de polystyrène n’ont pas besoin d’être stériles mais doivent avoir un couvercle. Utilisez nouveaux embouts pour chaque ligne de puits pour éviter de cross-contamination de puits, bien que si pipetage travers réanalysés avec une pipette multicanaux 8-astuce, conseils seulement besoin d’être changés entre les ensembles en triple.
        1. Étiquette de la nouvelle. Passez à l’étape 5.2.
      2. Pour stocker les plaques avant le traitement, les envelopper dans une pellicule plastique. Réfrigérer enveloppé de plaques à 4 ° C pour 6 d. par la suite, enlever les plaques du réfrigérateur, Déroulez les et transvaser le contenu de tous les puits en pipettant également, comme au point 5.1.1. Passez à l’étape 5.2.
    2. Ajouter 20 µL de 1 M TNT à 20 mL de tampon de LacZ décongelé, à température ambiante pour une concentration finale de 1 millimètre DTT. LacZ mélange tampon bien. Si vous utilisez une pipette multicanaux, diluer dans un réservoir de réactif.
      ATTENTION : Porter des gants et travailler avec TNT sous une hotte, si possible
    3. Utilisez soit une pipette multicanaux ou répétant pipette, ajouter 200 µL de tampon de LacZ contenant du TNT et ONPG ou GPRC dans toutes les loges de la plaque de polystyrène et immédiatement mesurer et noter le OD610 de tous les puits à l’aide d’un spectrophotomètre de plaque. Répéter au besoin pour plaques supplémentaires.
      Remarque : Les lectures de610 OD sont utilisés dans le dénominateur du calcul LacZ (étape 6.1). Pour cette raison, obtenir les lectures immédiatement après pipetage et avant les cellules s’installent ou sont lysées par LacZ tampon. Si OD610 valeurs des puits d’échantillon sont sensiblement supérieur ou inférieur à valeurs610 OD pour les puits de contrôle de véhicule, les extraits d’échantillons sont favorisant la croissance ou cytotoxiques à levure, respectivement. Le gène LacZ calcul permettra de corriger de petites différences dans la densité des cellules à travers des puits, mais si les différences dépassent 30 % dans les deux sens, puis diluer l’échantillon de lait reconstitué (de l’étape 2.6) dans l’éthanol 50 % supplémentaires et retester l’échantillon en retournant à l’étape 3.2 12.
    4. Recouvrir les plaques avec un couvercle. Incuber les boîtes contenant des levures qu’expresse ERα14 à 30 ° C pendant 40 min (pour ONPG) ou 3 h (pour le GPRC). Incuber les boîtes contenant des levures qu’expresse de REβ14 à 30 ° C pendant 70 min (pour ONPG) ou 4 h (pour le GPRC).
      Remarque : Lorsque vous travaillez avec le GPRC, temps d’incubation sont souples ; incubation pendant 2-4 h donne des résultats appropriés avec les deux récepteurs, avec des incubations plus longtemps, augmentant la sensibilité.
    5. Après incubation des plaques, utilisez une pipette multicanaux ou multipipette extensible pour ajouter 100 µL de carbonate de sodium dans chaque puits. Carbonate de sodium augmente le pH et stoppe la réaction de la β-galactosidase.
    6. Mesurer et consigner la OD405 (pour ONPG) ou OD574 (pour GPRC) de tous les puits à l’aide d’un spectrophotomètre de plaque.

    6.Calcul des valeurs de LacZ

    Remarque : Les valeurs LacZ quantifier le degré de changement de couleur pour chaque échantillon et offrent une méthode normalisée de comparer des valeurs entre les dosages séparés en tenant compte de plusieurs variables (p. ex., densité optique de levure, densité optique de médias et l’incubation fois si Cela diffère entre les puits sur la même plaque)12.

    1. Calculer la moyen des valeurs de610 OD en triple pour les puits de contrôle de médias (galactose) (H10-12) et calculer les moyens de l’OD en triple405 ou valeurs574 OD pour les commandes du véhicule (50 % d’éthanol) (H1-3). Utilisez ces moyens et le temps d’incubation (t) en heures pour la plaque à changer de couleur (étape 5.5) pour calculer les valeurs de LacZ (correspondant au degré de changement de couleur dans chaque puits) pour tous les standards et échantillon de puits à l’aide des équations suivantes :
      Equation 1
      Equation 2
      1. Sinon, utilisez l’application automatisée à l’appendice 1 pour calculer les valeurs de LacZ pour les échantillons et étalons.
        Remarque : Le schéma utilisé par l’application doit être identique pour le schéma présenté dans la Figure 1. Si certains puits échantillon n’étaient pas utilisés, conserver des mesures d’absorbance des puits vides comme détenteurs de place dans le dataset d’absorbance est collé dans l’application de LacZ appendice 1 .  Cela préserve la disposition spatiale de la plaque dans la demande et s’assure que les puits de contrôle des médias sont dans leur emplacement de votre choix.  En outre, l’application ne s’exécutera pas si il y a des cellules vides.
    2. Calculer les moyens de triple LacZ valeurs pour chaque norme E2 et les échantillons. Rapport des valeurs moyennes de LacZ comme µL-1h-1. Journal-transform les concentrations de chaque norme E2 et générer une feuille de calcul mise en forme dans le fichier template.csv (appendice 2).

    7. interpolation échantillon Estradiol équivalents (EEQs) à l’aide de 4 paramètres régression logistique

    Remarque : EEQs concernent les valeurs d’échantillon LacZ (changement de couleur) aux valeurs de la courbe standard créé avec E2 LacZ. EEQs ainsi déterminer combien échantillon est nécessaire pour obtenir la même réponse de changement de couleur comme une concentration connue de E2.

    1. Pour calculer les EEQs pour les échantillons d’essai, tout d’abord tracer la courbe d’étalonnage. Adapter les valeurs moyennes de LacZ pour normes E2 (axe y) et les logarithme E2 concentrations correspondantes (axe x) pour un modèle de régression logistique de quatre paramètres.
    2. Le modèle permet d’interpoler les EEQs pour les valeurs d’essai échantillon LacZ. Effectuer des calculs de régression logistique de EEQs à l’aide de logiciels statistiques énoncées à l’appendice 2.

    8. normalisation des EEQs (ng/mL) à la masse de l’échantillon de la PCP

    1. Pour relier EEQs à la quantité d’échantillon de PCP ajouté à chacun bien dans étape 4.5, multipliez l’EEQ (ng/mL) par le volume total plaqué dans les puits échantillon (325 µL) et puis à diviser par le volume de l’échantillon extrait ajouté à chaque puits (5 µL).
      Remarque : Ces valeurs représentent l’EEQ / mL de l’échantillon prélevé. Si les échantillons ont été préparés à l’aide de 1 g de PCP, ces valeurs représentent également l’EEQ par gramme de PCP (ng/g). Exprimé de cette façon, les valeurs de l’EEQ (ng/g) peuvent être comparés à travers des valeurs différentes de produits de soins personnels. EEQ (ng/g) pour les produits de soins personnels testés dans cette étude sont présentés dans le tableau 2, et les exemples de données recueillies tout au long de l’ensemble du protocole sont inclus dans Annexe 3.

    Representative Results

    Les estrogenicities des échantillons en triple de 15 produits de soins personnels ont été évalués en utilisant ce protocole Oui. Tel que noté par Miller et al. (2010), les tests avec de la levure exprimant REβ étaient plus qu’un ordre de grandeur plus sensible que les essais avec de la levure exprimant ERα (Figure 2)14. Par conséquent, une activité oestrogénique détecta plus souvent avec de la levure exprimant le REβ (tableau 2). Huit produits de soins personnels ont manifesté une activité oestrogénique avec REβ et 5 produits de soins personnels ont manifesté une activité oestrogénique avec ERα. Crème cheveux, crème solaire, lotion et échantillons de baume pour les lèvres étaient oestrogéniques avec deux récepteurs, tandis que Fondation, crème à raser et vernis à ongles étaient uniquement oestrogéniques avec REβ aux concentrations testées. Sept autres produits de soins personnels (4 shampoings, 2 savons et 1 baume) n’étaient pas oestrogéniques avec soit du récepteur aux concentrations testées.

    En plus des différences de sensibilité des récepteurs, EEQs pour chaque échantillon diffèrent selon le substrat colorimétrique (ONPG ou GPRC) utilisé dans l’essai (tableau 2). Dans tous, mais un seul échantillon, EEQs déterminées à l’aide d’ONPG étaient supérieurs à ceux déterminés à l’aide du GPRC. En outre, variation entre les répétitions d’extraction était plus faible pour EEQs mesurés avec REβ et GPRC et déterminé plus haut pour EEQs avec ERα et ONPG (tableau 2).

    En plus de comparer les substrats colorimétriques, 1 but de la présente étude était de tester l’incubation durées qui sont compatibles avec l’horaire d’un cours de premier cycle de laboratoire. Le test YES typique requiert qu'une incubation 17 h suivi immédiatement par une incubation dans un tampon LacZ pour 40 min - 4 h, un calendrier qui est impossible à mettre en œuvre dans un laboratoire d’enseignement contraint par une seule séance hebdomadaire. Pour faciliter l’utilisation de ce test dans l’enseignement, l’essai a été modifiée par l’introduction d’une période de réfrigération 6D (étape 5.1.2) après l’incubation de 17 h. Les courbes standard de plaques réfrigérées étaient comparables à celles des plaques non réfrigérés (Figures 2 & 3), sauf que les erreurs types des paramètres estimés à l’aide de modèles de régression logistique de quatre paramètres étaient tous plus petite pour plaques réfrigérées que pour les plaques de nonrefrigerated (tableau 3). Ainsi, plaques pendant 6 j de réfrigération réduit les erreurs et améliore la précision des estimations de l’EEQ.

    Figure 1
    Figure 1. Plaque de microtitration Layout et Dilution Standard courbe de préparation pour le test YES. Normes de E2 (wells gris clair), échantillons et négatif extraction contrôles (puits blancs) et de véhicule (H1 - 3) et de médias de galactose (H10 - 12) (puits gris foncés) les contrôles étaient tous testés en triple exemplaire. Une courbe d’étalonnage E2 (puits gris clair) a été construite par l’ensemencement de 320 µL de levure dans le puits A1 à A3 et 120 µL de levure dans les puits B1 par G3. Puis, 5 µL de E2 (227,5 nM pour la levure qui expriment ERα ; 9,75 nM pour la levure qui expriment REβ) ont été ajoutés à la levure dans le puits A1 à A3. La levure + E2 suspension a été diluée en série en transférant 205 µL de chaque puits vers le puits au-dessous de lui, ce qui donne les concentrations finales de E2 énumérées au tableau 1. Notez que, à la fin du processus de dilution en série, 205 µL doivent être éliminés des puits G1 à G3 afin d’obtenir un volume final de 120 µL à chaque puits. Échantillon et les puits de contrôle négatif d’extraction ont été préparés en ajoutant 5 µL de chaque extrait (dissous dans l’éthanol à 50 %) à 320 µL de levure. Puits de contrôle de véhicule (H1 - 3) ont été préparés en ajoutant 5 µL d’éthanol à 50 % à 320 µL de levure. Tous les puits d’échantillonnage et de contrôle ont été mélangés en pipettant également, et 205 µL ont été enlevé et jeté pour ajuster les volumes bien à 120 µL de chaque. Enfin, les commandes multimédia ont été préparés en ensemençant 120 µL de médias de galactose dans puits H10 - 12.  Pour utiliser la calculatrice LacZ en annexe 1 et à l’application R décrite à l' appendice 2, l’E2 courbe standard et les commandes multimédia véhicule et galactose doivent être plaqués comme indiqué.  Échantillons et les contrôles négatifs d’extraction peuvent être plaqués dans l’un des puits blancs aussi longtemps que l’ordre de l’électrodéposition est remarqué.  S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

    Figure 2
    Figure 2. Courbes de niveau pour les plaques Oui générés via 4 paramètres régression logistique. Deux substrats (ONPG & GPRC) ont été testés à l’aide de levures exprimant un des deux humains récepteurs d’oestrogène (ERα ou REβ) les deux sans (A) et (B) une réfrigération 6D période après l’incubation de 17 h avec exemple de 17β-estradiol et extraits. Toutes les normes de l’E2 et les médias et véhicule contrôles ont été testés en triple exemplaire. Points suivants représentent les moyens de triple LacZ valeurs, où les valeurs de LacZ reflètent le degré de changement de couleur, induit par la β-galactosidase. Paramètres de modèle de régression logistique sont répertoriés dans le tableau 3. ONPG = ortho- nitrophényl-β-D-galactopyranoside ; GPRC = chlorophénol rouge-β-D-galactopyranoside. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

    Figure 3
    Figure 3. Exemples de plaques Oui développés. Deux substrats (ONPG & GPRC) ont été testés à l’aide de levures exprimant les récepteurs des œstrogènes humains (ERα ou REβ), soit sans (gauche) ou par période (à droite) une puissance frigorifique de six jours après l’incubation de 17 h avec 17β-estradiol ou échantillon extrait. Toutes les normes de E2, les médias et les véhicule contrôles ont été testés en géométrie. Plaques ont été organisés avec la plus forte concentration de E2 dans la rangée supérieure de chaque plaque et contrôles (50 % éthanol + levure sur le support de galactose et de gauche à droite) dans la rangée du bas de chaque plaque conformément à la Figure 1. ONPG = ortho- nitrophényl-β-D-galactopyranoside ; GPRC = chlorophénol rouge-β-D-galactopyranoside.S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

    Numéro de la norme [E2] pour la levure ERα (pM) [E2] pour la levure REβ (MP)
    1 3500 150
    2 2208 94,6
    3 1393 59,7
    4 878 37,6
    5 554 23,7
    6 349 15
    7 220 9 h 45

    Le tableau 1. Concentrations de E2 Normes définitives pour l’oui.
    E2 en poudre a été dissous dans l’éthanol anhydre et puis dilution de travail stocks concentrations de 227,5 nM (pour la levure qui expriment ERα) et 9,75 nM (pour la levure qui expriment REβ) dans l’éthanol à 50 %.Les stocks de travail ont été ensuite ajoutés à la microplaque contenant des levures dans les médias de galactose et dilués en série aux concentrations indiquées dans le tableau.

    Échantillons testés Conditions d’essais Oestrogéniques équivalents (EEQs) des produits de soins personnels
    PCP # Type d’échantillon Récepteur Substrat 1 l’EEQ (ng/g) 2 l’EEQ (ng/g) 3 l’EEQ (ng/g) Signifie l’EEQ (ng/g)
    1 Crème capillaire ERΑ ONPG ND 0,379 ND < 0,379
    1 Crème capillaire ERΑ GPRC ND ND ND ND
    1 Crème capillaire REΒ ONPG 0.528 0,338 0,363 0.410
    1 Crème capillaire REΒ GPRC ND 0,215 ND < 0,215
    4 Protection solaire ERΑ ONPG 6.803 1,390 ND < totalisant 4,097
    4 Protection solaire ERΑ GPRC ND ND ND ND
    4 Protection solaire REΒ ONPG 1.321 0.838 0,818 0,992
    4 Protection solaire REΒ GPRC 0,651 0,591 0,725 0,656
    7 Fondation ERΑ ONPG ND ND ND ND
    7 Fondation ERΑ GPRC ND ND ND ND
    7 Fondation REΒ ONPG ND 0,158 ND < 0,158
    7 Fondation REΒ GPRC ND ND ND ND
    9 Crème à raser ERΑ ONPG ND ND ND ND
    9 Crème à raser ERΑ GPRC ND ND ND ND
    9 Crème à raser REΒ ONPG ND 0,256 0,295 < 0,276
    9 Crème à raser REΒ GPRC 0,507 0,392 0.560 0,486
    10 Vernis à ongles ERΑ ONPG ND ND ND ND
    10 Vernis à ongles ERΑ GPRC ND ND ND ND
    10 Vernis à ongles REΒ ONPG 0.916 0,503 0,554 0,658
    10 Vernis à ongles REΒ GPRC 0.532 0,628 0.594 0,585
    11 Lotion ERΑ ONPG ND ND 2.327 < 2.327
    11 Lotion ERΑ GPRC ND ND ND ND
    11 Lotion REΒ ONPG Dépasse la plage 2.599 1.845 > 2,222
    11 Lotion REΒ GPRC -- 1,986 1.236 1.611
    13 Protection solaire ERΑ ONPG 14.069 11.494 10.189 11.917
    13 Protection solaire ERΑ GPRC 4.773 5.790 5,850 5,471
    13 Protection solaire REΒ ONPG Dépasse la plage 2,580 Dépasse la plage > 2,580
    13 Protection solaire REΒ GPRC 0,292 0,240 ND < 0,266
    15 Baume pour les lèvres ERΑ ONPG ND ND 0,431 < 0,431
    15 Baume pour les lèvres ERΑ GPRC ND ND ND ND
    15 Baume pour les lèvres REΒ ONPG 1.202 1,060 0,887 1,050
    15 Baume pour les lèvres REΒ GPRC 0,820 0.871 0.851 0,847

    Le tableau 2. EEQs de produits de soins personnels avec EEQs non nul. Trois aliquotes de 15 produits de soins personnels et trois contrôles d’extraction ont été homogénéisés dans l’éthanol anhydre, évaporés et reconstituées en éthanol à 50 % pour un total de 48 échantillons, dont chacun a été analysée en trois exemplaires en utilisant le test YES. Huit produits de soins personnels avaient au moins 1 non nulle l’EEQ, tandis que 7 produits de soins personnels ne se trouvaient pas être oestrogéniques aux concentrations testées. L’EEQ 1, EEQ 2 et 3 de l’EEQ voir les trois aliquotes de chaque PCP, chacun testés en triple exemplaire sur une plaque séparée. Valeurs de l’EEQ 1, EEQ 2 et 3 de l’EEQ sont les moyens de la géométrie de chaque aliquote. Levure utilisée dans l’essai exprimée 1 des 2 isoformes des récepteurs des œstrogènes humains (ERα ou REβ). Deux substrats colorimétriques, ONPG et GPRC, ont été testées en utilisant le protocole non réfrigérés. EEQs sont déterminées au moyen des régressions logistiques quatre paramètres (avec R2 valeurs ≥ 0,98) des valeurs de LacZ dans chacune des 7 concentrations d’E2. ND = sous la limite de détection du test.--= réplique perdue.

    Conditions d’essais Paramètres du modèle
    Récepteur Substrat Arrestation à 4 ° C pendant 6 j Modèle R2 Taux de croissance (LacZ unités/ng/ml) Point d’inflexion (ng/mL) Asymptote inférieure (unités LacZ) Asymptote supérieure (unités LacZ)
    ERΑ ONPG > 0.99 ±1.633 8.548 -0.512 ±0.025 -1.623 ±4.408 ±6.31 128.11
    ERΑ ONPG OUI > 0.99 7.618 ±0.758 -0.587 ±0.014 -8.378 ±2.223 ±2.528 99.53
    ERΑ GPRC > 0.99 8,256 ±2.182 -0.610 ±0.033 ±3.333 0.853 ±3.473 62.52
    ERΑ GPRC OUI > 0.99 5.068 ±0.616 -0.523 ±0.022 -3.147 ±1.946 68,06 ±3.069
    REΒ ONPG > 0.99 ±2.004 1.041 -0.898 ±4.410 -32.98 ±86.62 248,6 ±778.9
    REΒ ONPG OUI > 0.99 ±1.289 4.327 -1.736 ±0.087 ±3.087 4.654 66.37 ±10.75
    REΒ GPRC = 0,99 ±1.764 5.673 -1.914 ±0.052 ±1.679 3.925 28.05 ±2.334
    REΒ GPRC OUI > 0.99 ±1.142 4.412 -1.894 ±0.051 ±1.303 2.052 ±2.047 22.64

    Tableau 3. Modèle de paramètres de 4 paramètres de régression logistique pour les courbes Standard en Figure 2. Deux substrats, ONPG et GPRC, ont été testés à l’aide de levures exprimant 1 de 2 récepteurs de œstrogènes humains (ERα ou REβ) fois sans et avec une période de froid de six jours après l’incubation de 17 h. On rapporte les paramètres comme estimations ±standard erreurs.

    Annexe 1. Application pour le calcul des valeurs de LacZ.  Pour utiliser l’application, tout d’abord télécharger le logiciel Java gratuit (tel qu’indiqué dans la Table des matières). Ensuite, ouvrez l’application LacZ. Le schéma utilisé par l’application doit être identique pour le schéma présenté dans la Figure 1. Si certains puits échantillon n’étaient pas utilisés, conserver des mesures d’absorbance des puits vides comme détenteurs de place dans le dataset d’absorbance est collé dans l’application de LacZ.  Cela préserve la disposition spatiale de la plaque dans la demande et s’assure que les puits de contrôle des médias sont dans leur emplacement de votre choix.  En outre, l’application ne s’exécutera pas si il y a des cellules vides. Pâte en OD405 lectures (pour ONPG) ou des lectures de574 OD (pour GPRC) de tous les puits à l’aide de la commande clavier « control (ctrl) + v » ou « commande + v, » selon la plate-forme informatique utilisée. Inscrivez le montant de temps d’incubation en heures pour le dosage produire la couleur (de l’étape 5,4 ; par exemple, 0,66667 h pendant 40 min). Cliquez sur suivant. Coller dans lectures610 OD de l’étape 5.3. Cliquez sur soumettre. LacZ résultats seront affiche et peuvent être copiées en appuyant sur « control (ctrl) + c » ou « commande + c, » dépend de la plate-forme de l’ordinateur utilisée. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

    Annexe 2. Options de logiciel statistique pour le calcul de EEQs. EEQs peuvent être calculées à l’aide d’une des trois options présentées.  Instructions d’utilisation 1. Le logiciel JMP ou 2. Code R sont fournis à l’appendice 2.  Le code R a également été converti en 3. un format de demande disponible à https://furmanbiology.shinyapps.io/YESapp/. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

    Annexe 3. Les données recueillies à l’aide de levure que ERα Express et GPRC comme substrat de l’échantillon. Mesures de OD610 et OD574 pour chacun des sept contrôles E2 de normes, des véhicules et des médias, et un seul échantillon représentatif de la PCP sont inclus, ainsi que les valeurs calculées de LacZ. LacZ valeurs, des normes ont été utilisées pour construire un modèle de régression logistique de quatre paramètres de la courbe standard, tel que décrit dans les étapes 7 a & B ci-dessus. Le modèle a été utilisé pour interpoler les estimations en triple de EEQs de l’échantillon représentatif en ng/mL dans la microplaque. Ces valeurs sont ensuite convertis en EEQs exprimées en ng/g d’échantillon (étape 8.1). S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

    Discussion

    L’oui est une faible coût méthode utilisée pour détecter des ligands oestrogéniques dans des échantillons environnementaux, tels que l’eau, les aliments, les tissus végétaux ou produits d’hygiène personnelle. Données présentées ici comparer 2 récepteurs d’oestrogène (ERα et REβ), 2 substrats (ONPG et GPRC) et 2 calendriers (d 2 protocoles sans réfrigération) et sept jours avec réfrigération pour mesurer l’oestrogénicité en produits de soins personnels via le test YES. Le 7D, réfrigéré protocole utilisant GPRC et levures exprimant ERα et/ou REβ mieux quantifie EEQs tout en étant compatible avec les contraintes de temps imposées par les cours de premier cycle laboratoire qui ne répondent qu’une seule fois / semaine pendant plusieurs heures. En effet, par rapport à l’essai de 2 jours sans réfrigération, le dosage réfrigéré de sept jours était associé à variance réduite dans la réplique de la plaque. En outre, la partie linéaire de la courbe d’étalonnage a été légèrement élargie pour les données recueillies à l’aide de l’essai réfrigéré. La partie linéaire de la courbe standard définit la plage de détection du test et est la seule partie de la courbe standard qui permet d’interpoler les EEQs de l’échantillon.

    Dans tous les échantillons analysés, EEQs mesurées à l’aide du GPRC étaient inférieures à celles quantifié avec ONPG. Avec un coefficient d’extinction supérieur et inférieur Km et Vmax, GPRC est dix fois plus sensible que ONPG17. Ainsi, le GPRC peut être utilisé à des concentrations inférieures et peut être utilisé pour détecter des quantités plus faibles de la β-galactosidase. Pour ces raisons, le GPRC est généralement privilégiée au-dessus de l’ONPG18,19. Cependant, une plus grande sensibilité de substrat n’explique pas les valeurs inférieures de l’EEQ détecté avec GPRC. Les valeurs plus élevées de l’EEQ détectés avec ONPG pourraient être à cause d’interférences de matrice avec l’essai, comme indiqué par les autres auteurs2,18. Pigments jaunes dans des extraits de produits de soins personnels pourraient gonfler les valeurs de l’EEQ détectés avec ONPG. D’autres ont contourné ce problème en incluant des contrôles de pigment dans leur protocole expérimental2, une approche qui double le nombre de plaques dans une expérience. Lorsque la matrice peut être problématique, GPRC peut être un substrat préférable pour le test YES, bien qu’il est plus cher et nécessite des temps d’incubation plus longues que l’ONPG. En outre, le changement de couleur, induit par le clivage du substrat par la β-galactosidase est plus dramatique avec GPRC, rend plus facile pour les étudiants à visualiser les résultats.

    Miller et al. (2010), qui la levure utilisée dans le présent protocole d’ingénierie, a noté que la levure exprimant REβ étaient 30 x plus sensible au 17β-estradiol que levure exprimant ERα, une conclusion étayée par nos données14. En dehors de nuances possibles dans la construction plasmidique, Miller et al. (2010) ne pouvait pas expliquer cette différence de sensibilité14. Une des différences entre les deux constructions de plasmide sont que ERα expression est régulée par galactose, tandis que REβ l’expression est régulée par le glucose ou du galactose. La levure utilisée dans le test YES sont cultivées dans des milieux de glucose et galactose donnés lorsqu’ils sont dilués au début de l’essai. Par conséquent, levures exprimant REβ pourrait s’accumuler un nombre plus élevé de protéines réceptrices avant le début de l’essai, conférant ainsi une sensibilité plus élevée aux ligands oestrogéniques copie.

    La sensibilité plus faible des levures exprimant l’ERα peut expliquer des taux plus élevés de non-détection d’oestrogénicité des échantillons dosés avec ERα comparée à REβ. Pour accroître la probabilité que l’échantillon EEQs sera détecté, utilisateurs pourraient employer des méthodes et des solvants d’extraction différente ou ajouter des volumes plus importants de l’échantillon à la levure. Si des volumes plus élevés d’échantillon sont utilisés, les concentrations des normes E2 doivent être ajustées de telle que le même volume d’échantillons et étalons peut être utilisé dans le test. Une des limites de l’ajout d’échantillon plus est que les levures peuvent tolérer seulement 6-10 % d’éthanol, avec la meilleure tolérance aux températures d’incubation de 30 ou 35 ° C20. Pour contrôler des effets de l’éthanol sur la levure, les enquêteurs devraient en triple « levure seulement » puits s’ajoute le schéma et confirment que l' OD610 de ces puits « levure seulement » est comparable à l' OD610 de puits de contrôle véhicule immédiatement après l’addition de tampon LacZ. Alternativement, les échantillons dissous dans l’éthanol peuvent être ajoutés à plaques microwell sec et l’éthanol évaporé au large avant de levure sont ajoutés. Diméthylsulfoxyde (DMSO) est également utilisé comme solvant échantillon dans Oui essais, mais la concentration de travail final de DMSO avec de la levure doit être limitée à 1 %12.

    Le test YES est un outil de dépistage puissant pour détecter oestrogénicité dans des échantillons environnementaux. Plus précisément, l’oui détecte des ligands qui se lient à des récepteurs d’oestrogène nucléaire qui interagissent avec les éléments de réponse d’oestrogène pour diriger l' expression de gène14. Cependant, l’oui a aussi des limitations importantes. L’oui ne détecte pas les EEs qui fonctionnent par le biais de mécanismes non nucléaires tels que les récepteurs d’oestrogène de membrane ou mécanismes qui impliquent des éléments supplémentaires tels que les facteurs de transcription Activator Protein 1 (AP-1). En outre, parce que la levure n’ont pas la même capacité métabolique comme les cellules de mammifères, l’oui ne peut pas détecter des ligands qui nécessitent une activation métabolique pour être oestrogéniques.

    En outre, le test YES ne peut pas facilement distinguer les ligands oestrogéniques et anti-oestrogéniques dans des échantillons complexes. Au lieu de cela, il mesure oestrogénicité net , qui est l’effet de la somme de ligands oestrogéniques et anti-oestrogéniques. Pour quantifier la concentration des antagonistes de l’ER ou évaluer l’activité inhibitrice des mélanges, l’essai peut être modifié en incubant des levures avec l’agoniste standard (17β-estradiol) et une chaîne de test échantillon concentration12. Ce processus détermine si antagonistes dans les échantillons peuvent diminuer l’activité induite par l’agoniste journaliste et fournit un écran utile pour identifier la présence d’antagonistes ER dans les échantillons.

    Le protocole présenté ici peut accueillir une variété de types d’échantillons, bien que certains échantillons peuvent nécessiter des modifications aux étapes de la préparation d’extraction et d’échantillon. Par exemple, EEQs variés considérablement entre les réplique de certains produits de soins personnels. Les échantillons plus variables ont tendance à contenir des gouttelettes d’huile ou dans le cas contraire, n’étaient pas parfaitement homogènes, ce qui indique qu’un solvant plus lipophile comme l’éther serait utile. Alternativement, les huiles et la cire dans les produits de soins personnels pourraient être exclues en extrayant des échantillons avec 50 % d’éthanol au lieu de 100 % d’éthanol.Une extraction de l’éthanol 50 % saisiront également plus des ligands oestrogéniques soluble dans l’eau (p. ex., certains pigments). Toutefois, 50 % d’éthanol s’évapore plus lentement que l’éthanol à 100 % et donc peut s’étendre de temps d’extraction. En outre, certains échantillons (tels que les savons) étaient cytotoxiques pour la levure, ce qui entraîne des mesures de densité cellulaire réduite (OD610). Fox et al. (2008) suggèrent que ces échantillons doivent être dilués et testés à nouveau si les différences de densité cellulaire dépassent 30 % par rapport au véhicule contrôle puits12.

    Si le test YES est utilisé à des fins de recherche analytique, courbes de dilution des pools d’échantillons peuvent être testés pour déterminer préventivement des volumes appropriés de l’extrait à ajouter à la levure à l’étape 4.5. Alternativement, les extraits peuvent être testées simultanément à plusieurs volumes (par exemple, 5 µL et 20 µL extrait ajouté à la levure à l’étape 4.5) ou des dilutions qui s’étendent sur ordres de grandeur (par exemple, 0.2 µL, 2 µL et 20 µL). Volumes « Appropriés » de l’extrait sont ceux permettant d’identifier l’oestrogénicité par LacZ valeurs le long de la partie linéaire de la courbe d’étalonnage correspondantes. Optimisation prévient les problèmes causés par l’ajout d’échantillon trop ou trop peu à la levure, tels que la cytotoxicité, faux négatifs ou oestrogénicité qui dépasse la courbe d’étalonnage. Comme mentionné ci-dessus, les volumes d’échantillons et étalons E2 doivent être ajustées lorsque des quantités différentes de ligand sont utilisées tel que les levures sont exposés à un volume cohérent et la concentration d’éthanol ou d’autre véhicule sur la plaque.

    Malgré le risque de faux négatifs, le test YES a été identifié comme un outil de test de niveau 3 pour les perturbateurs endocriniens par Schug et al. (2013), qui a développé un protocole complet de niveaux pour perturbation endocrinienne (TiPED)21. Pour l’enseignement universitaire, l’essai est valable pour l’enseignement des concepts liés à la perturbation du système endocrinien, culture cellulaire, liaison aux récepteurs, l’activité enzymatique, génie génétique, statistique et expérimental. Étudiants qui utilisent le test pratiquent également des compétences de laboratoire fondamental et largement applicable comme la dilution en série de normes ; extraction des échantillons ; produire des solutions ; construction et interpolation des courbes standard ; calcul des concentrations ; produire des solutions ; démonstration technique stérile ; culture de cellules ; identifier les variables et les contrôles ; recueillir, organiser et analyser les données ; construction et interprétation des graphiques ; et à l’aide d’équipement de laboratoire commun comme micropipettes et des spectrophotomètres.

    Disclosures

    Les auteurs n’ont rien à divulguer.

    Acknowledgments

    Ce projet a été financé par démarrage financé TME et AMR de Louisiana Tech University et l’Université Furman, respectivement. Supplémentaire a été financé par une subvention de promotion Faculté de 2015 à AMR et TME de The Associated collèges du Sud, une subvention de Louisiane EPSCoR Pfund à TME de la National Science Foundation et le Conseil des gouverneurs de la Louisiane et une bourse de voyage à TME de la University of the South. Nous remercions le Dr David Eubanks (Furman) d’assistance pour des analyses statistiques et M. Christopher Moore « qui nous a donné un coup de main » pendant le tournage.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Equipment
    Vortex Mixer (for single or multiple tubes) Fisher Scientific (www.fishersci.com) 02-215-365 Any mixer will suffice.
    Bucket centrifuge Fisher Scientific (www.fishersci.com) 75-063-839 Any bucket centrifuge will suffice if it is capable of centrifuging conical tubes at 4000 rpm.
    Bunsen burner Fisher Scientific (www.fishersci.com) 17-012-823 Any Bunsen burner will suffice, or an alcohol burner (Fisher Scientific 04-245-1) can be used instead.
    Incubator Fisher Scientific (www.fishersci.com) 50125590H Any incubator will suffice if it is capable of maintaining 30 °C.
    Microplate reader BioTek (www.biotek.com) EPOCH2 A different brand of plate reader will suffice if it can measure absorbance at wavelengths of 405, 574, and 610 nm.
    Gen5 microplate reader and imager software BioTek (www.biotek.com) GEN5 Software required depends on make and model of plate reader; GEN5 software is intended for use with BioTek plate reader.
    Refrigerator Fisher Scientific (www.fishersci.com) 05LREEFSA Any refrigerator will suffice if it is capable of maintaining 4 °C.
    Pipettor or PipetAid compatible with 1 - 10 mL serological pipets Fisher Scientific (www.fishersci.com) 13-681-15E Any pipettors will suffice if they are compatible with 1 & 10 mL serological pipets.
    P10 micropipettor Fisher Scientific (www.fishersci.com) F144562G Any micropipettor will suffice if it is capable of dispensing 5 µl.
    P200 micropipettor Fisher Scientific (www.fishersci.com) F144565G Any micropipettor will suffice if it is capable of dispensing up to 200 µl.
    P300 multichannel pipettor Fisher Scientific (www.fishersci.com) FBE1200300 Any multichannel pipettor will suffice if it is capable of dispensing 50 - 205 µl.
    Repeating pipettor Fisher Scientific (www.fishersci.com) F164001G Must be able to deliver 100 - 320 µl; this pipettor is optional because a multichannel pipettor can be used instead.
    Name Company Catalog Number Comments
    Supplies
    Sterile 15 mL conical tubes with caps Fisher Scientific (www.fishersci.com) 05-539-801
    Glass scintillation vials Fisher Scientific (www.fishersci.com) 03-337-4
    Polystyrene 96-well, flat-bottom microplates with lid (nonsterile) Fisher Scientific (www.fishersci.com) 12565501
    Polypropylene 96-well, flat-bottom microplates without lid  Cole-Parmer (www.coleparmer.com) EW-01728-81
    100 mL glass beakers Fisher Scientific (www.fishersci.com) 02-539H Any glass beakers will suffice if they are autoclavable.
    250 mL glass Erlenmeyer flasks Fisher Scientific (www.fishersci.com) FB500250 Any glass Erlenmeyer flasks will suffice if they are autoclavable.
    Sterile, adhesive, porous film  VWR (www.vwr.com) 60941-086
    Metal forceps Fisher Scientific (www.fishersci.com) 12-000-157 Any metal forceps will suffice.
    Reagent reservoir Fisher Scientific (www.fishersci.com) 07-200-127
    Filtration units (0.2 µm) Fisher Scientific (www.fishersci.com) 09-761-52
    Squirt bottle (for ethanol) Fisher Scientific (www.fishersci.com) 02-897-10 Any laboratory squirt bottles will suffice.
    Autoclavable storage bottles Fisher Scientific (www.fishersci.com) 06-414-1D Any autoclavable glass storage bottles will suffice.
    10 mL glass serological pipets (sterile) Fisher Scientific (www.fishersci.com) 13-678-27F Any glass serological pipets will suffice.
    1 mL glass serological pipets (sterile) Fisher Scientific (www.fishersci.com) 13-678-27C Any glass serological pipets will suffice.
    P10 micropipettor tips USA Scientific (www.usascientific.com) 1120-3810 Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above.
    P200 micropipettor tips USA Scientific (www.usascientific.com) 1120-8810 Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above.
    P300 micropipettor tips USA Scientific (www.usascientific.com) 1120-9810 Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above.
    Syringe tips for repeating pipettor Fisher Scientific (www.fishersci.com) F164150G Only required if a repeating pipettor is used.
    Sterile petri dishes Fisher Scientific (www.fishersci.com) FB0875712 Any sterile petri dishes will suffice.
    Parafilm Fisher Scientific (www.fishersci.com) S37440
    Name Company Catalog Number Comments
    Yeast 
    Saccharomyces cerevisiae strains that lack the TRP1 gene product (e.g., W303a) American Type Culture Company (ATCC) (www.ATCC.org) MYA-151 Recombinant yeast are also available upon request from the authors.
    Receptor/reporter plasmid for ERα Addgene (www.addgene.org) pRR-ERalpha-5Z (Plasmid #23061) 
    Receptor/reporter plasmid for ERβ Addgene (www.addgene.org) pRR-ERbeta-5Z (Plasmid #23062) 
    Name Company Catalog Number Comments
    Chemicals
    Difco agar BD (www.bd.com) 214530
    Dithiothreitol Sigma (www.sigmaaldrich.com) D0632 CAUTION:  Dithiothreitol is an acute skin and eye irritant.  Use appropriate personal protection equipment (gloves, fume hood, dust mask) to avoid skin and eye contact, inhalation and ingestion.
    Ortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside Sigma (www.sigmaaldrich.com) N1127
    Chlorophenol red-β-D-galactopyranoside Sigma (www.sigmaaldrich.com) 10884308001
    Yeast nitrogen base Sigma (www.sigmaaldrich.com) Y0626
    Glucose Sigma (www.sigmaaldrich.com) G8270
    Galactose Sigma (www.sigmaaldrich.com) G5388
    Adenine sulfate Sigma (www.sigmaaldrich.com) A9126
    Uracil Sigma (www.sigmaaldrich.com) U0750
    Leucine Sigma (www.sigmaaldrich.com) L8000
    Histidine Sigma (www.sigmaaldrich.com) H8000
    17 β-Estradiol  Sigma (www.sigmaaldrich.com)                     MP Biomedicals  E8875-250 mg     0219456401 - 1 mg CAUTION:  Estradiol is a suspected carcinogen and reproductive toxicant.  It is harmful if inhaled, swallowed, or absorbed through skin.  Estradiol may cause harm to breast-fed children and fetuses.  Estradiol is very toxic to aquatic life.  Use appropriate personal protection (gloves, fume hood, dust mask) and avoid exposure during pregnancy and lactation.  Estradiol should be disposed of as hazardous waste and not released to the environment.
    100% ethanol Pharmco-Aaper (www.pharmcoaaper.com) 111000200
    Sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma (www.sigmaaldrich.com) S9638
    Sodium phosphate dibasic (anhydrous) Sigma (www.sigmaaldrich.com) S0876
    Magnesium chloride Sigma (www.sigmaaldrich.com) M8266
    Potassium chloride Sigma (www.sigmaaldrich.com) P9333
    Sarkosyl (N-lauroylsarcosine sodium salt) Sigma (www.sigmaaldrich.com) L5125
    Sodium carbonate Sigma (www.sigmaaldrich.com) S7795
    Name Company Catalog Number Comments
    Software
    Excel spreadsheet software Microsoft  Excel is convenient spreadsheet software for managing data outputs and generating .csv files for R analysis.
    Java software (required for Appendix 1 application)  Oracle Corporation To calculate LacZ values using the application in Appendix 1, first download free Java software (https://www.java.com/en/download/), then open the LacZ application in Appendix 1.  LacZ results created by the application can be copied by pressing "control (ctrl) + c" on PC keyboards, or "command + c" on Mac keyboards.
    JMP statistical software version 13.0.0 SAS Institute Appendix 2 includes directions on using JMP to fit LacZ data to a four-parameter logistic regression curve.  The curve is used to interpolate test sample estradiol equivalents (EEQs), relative to the estradiol standard curve.
    R statistical computing and graphics software R Foundation Free R software can be downloaded from https://www.r-project.org/.  Directions and code for using R to fit LacZ data to a four-parameter logistic regression curve are given in Appendix 2.

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    References

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    Détection des Ligands oestrogéniques dans les produits de soins personnels à l’aide d’une levure oestrogène écran optimisé pour le laboratoire d’enseignement de premier cycle
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    Edwards, T. M., Morgan, H. E., Balasca, C., Chalasani, N. K., Yam, L., Roark, A. M. Detecting Estrogenic Ligands in Personal Care Products using a Yeast Estrogen Screen Optimized for the Undergraduate Teaching Laboratory. J. Vis. Exp. (131), e55754, doi:10.3791/55754 (2018).More

    Edwards, T. M., Morgan, H. E., Balasca, C., Chalasani, N. K., Yam, L., Roark, A. M. Detecting Estrogenic Ligands in Personal Care Products using a Yeast Estrogen Screen Optimized for the Undergraduate Teaching Laboratory. J. Vis. Exp. (131), e55754, doi:10.3791/55754 (2018).

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