Summary
Bu madde miktarının ligandlar kişisel bakım ürünlerinde (PCPs) östrojen reseptörleri alfa (ERα) ve/veya beta (ERβ) bağlamak için bir en iyi duruma getirilmiş Maya östrojen ekran sunar. Yöntem iki Renkölçer substrat seçenekleri, bir altı gün buzdolabında kuluçka kullanılmak üzere lisans dersleri ve veri analizi için istatistiksel araçlar içerir.
Abstract
Maya östrojen ekran (Evet) östrojenik ligandlar çevre örneklerinde algılamak için kullanılan ve endokrin bozulma çalışmalarda genel olarak uygulanmıştır. Östrojenik ligandlar doğal ve insan yapımı "çevre kişisel bakım ürünleri (PCPs), plastik, tarım ilaçları ve gıdalar dahil olmak üzere birçok tüketim malları içinde bulunan östrojen" (EEs) içerir. EEs insanların ve diğer hayvanların sinyal, potansiyel olarak doğurganlık azaltılması ve hastalık riski artan hormon bozabilir. EEs ve diğer endokrin engellemeden kimyasal maddeler (EDCs) kamu sağlığı önemi rağmen endokrin bozulma genellikle lisans müfredat dahil değildir. Bu eksiklik ilkeleri göstermek ilgili laboratuvar faaliyetleri eksikliği nedeniyle kısmen de lisans öğrencileri için erişilebilir olurken ilgilenmektedir. Bu makale bir en iyi duruma getirilmiş Evet ligandlar östrojen reseptörleri alfa (ERα) ve/veya beta (ERβ) bağlamak kişisel bakım ürünlerinde miktarının için sunar. Yöntem iki Renkölçer yüzeylerde birini içermektedir (ortho- nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG) veya chlorophenol kırmızı-β-D-galactopyranoside (CPRG)) 6 gün buzdolabında kuluçka adım için β-galaktozidaz tarafından i ciddi Lisans laboratuvar dersleri, otomatik bir uygulamadır kullanımda LacZ hesaplamalar ve R kodu ilişkili 4-parametre logistic regresyon analizi için kolaylaştırmak. Protokol geliştirmek ve hangi onlar ürünleri kendi östrojen taklit eder için seçtiğiniz ekran deney lisans öğrencileri sağlamak için tasarlanmış. Bu süreç içinde endokrin bozulma, hücre kültürü, reseptör bağlama, enzim aktivitesi, genetik mühendisliği, istatistik ve deneysel tasarım hakkında bilgi edinin. Aynı anda, onlar da temel ve geniş ilgili laboratuvar, gibi pratik beceri: konsantrasyonları; hesaplama çözümler yapma; steril tekniği gösteren; seri olarak standartlar sulandrarak; oluşturmak ve standart eğrileri enterpolasyonla; değişkenler ve denetimler belirlenmesi; toplama, düzenleme ve veri analizi; oluşturma ve grafik yorumlama; ve micropipettors ve Spektrofotometreler gibi ortak labaratuar donanımları kullanarak. Böylece, bu tahlil uygulama öğrencileri Çevre Bilimi ve sağlık gelişmekte olan konuları keşfetmek süre soruşturma tabanlı öğrenme yapmaya teşvik eder.
Introduction
Maya östrojen ekran (Evet) taklit estradiol (E2 veya 17β-estradiol) matrisler, su, bitki doku, tüketici ürünleri ve gıdalar1,2,3de dahil olmak üzere çeşitli ligandlar ölçmek için yaygın olarak kullanılır, 4. Toplu olarak, bu tür ligandlar "Çevre östrojen (EEs)." denir Evet aslında, vitro alternatif vivo içinde testlere kemirgen uterotrophic tahlil gibi5,6 ve tahlil7besleme Gökkuşağı alabalığı bir düşük geliştirildi. Bu testleri bir ürün teşvik veya östrojen bağımlı mekanizmaları engellemek kimyasallar içerip içermediğini belirlemek için amaçtır. EEs tespiti kritik, çünkü onlar normal endojen östrojen, özellikle fetal gelişim sırasında sinyal ile engelleyebilir. Bu girişim, obezite, infertilite, kanser ve Bilişsel kaybı8riskini artırarak sağlık ödün vermez.
EEs ve diğer EDCs kamu sağlığı önemi rağmen endokrin bozulma yaygın olarak lisans müfredat dahil değildir. Bu eksikliği ilkeleri göstermek faaliyetleri kısmen bir eksiklik nedeniyle de lisans öğrencileri için erişilebilir olurken ilgilenmektedir. Ayrıca, çeşitli varyasyonları Evet protokolü9,10,11,12,13var ve bu çeşitliliği tahlil optimizasyonu için zaman alıcı yapar Laboratuvar koordinatörleri özellikle ilgili teknikleri eğitim. Son olarak, Evet deneyleri genellikle üzerinde 1 uzun gün ya da 2 gün üst üste bir O/N kuluçka ile tamamlanır. Bu zamanlama genellikle bir kez karşılamak lisans laboratuvar dersleri biçimi ile uyumlu değildir / hafta birkaç h için.
Bu ihtiyaçlara yanıt olarak, bu el yazması ethanolic çıkarma yöntemleri için kişisel bakım ürünleri (PCPs)3 ve haftalık laboratuvar toplantıları karşılamak için 6 gün soğutma adım içerir en iyi duruma getirilmiş bir 96-şey Evet Protokolü bildirir. Mutlak etanol kutupsal ve nonpolar solutes çeşitli çözünebilmektedir çok yönlü bir organik çözücü var. Hazır, oldukça toksik olmayan, uygun fiyatlı ve su ile karışan olduğundan Ayrıca, lisans dersleri için uygundur; özel ekipman da kolayca buharlaşır. Ancak, etanol şiddetle hidrofobik Endokrin Bozucular veya birçok yağlar ve Vakslar ayıklamak için ideal değil, ortak malzemeler PCPs. zavallı ayıklama verimlilik olmak son iki yanlış negatif bulgular riskini artırır. Akılda bu sınırlamayla müfettişler ayıklama işlemleri (örneğin, ethanolic çekme ya da katı faz ayıklama) bu adres örnek özelliklerini seçin ve çalışma hedefleri (lisans öğretim ve araştırma) karşılamak gerekir.
Evet rekombinant Saccharomyces cerevisiae aslında Tulane Üniversitesi'nde Dr. Charles Miller tarafından oluşturulan dayanır. Lütfen bakın Miller vd. (2010) tam bir harita mühendislik plazmid14. Maya dönüştürülmüş bu Plasmid'ler ile yapısal ifade insan nükleer ERα veya ERβ (ESR1 ve ESR2, anılan sıraya göre de denir) galaktoz (için ERα) veya glikoz veya galaktoz (için ERβ) içeren ortamda büyüdü. Medyada östrojenik kimyasallar yoksa, β-galaktozidaz (lacZ) ifade östrojenik kimyasal konsantrasyonu orantılı bir düzeyde harekete geçirmek ligand-reseptör kompleksleri oluşturma reseptörleri, bağlayın. Maya hücreleri sonra birikmiş β-galaktozidaz serbest bırakmak için lysed. ONPG veya β-galaktozidaz tarafından sarı veya kırmızı ürünleri, sırasıyla vermeye i ciddi CPRG lizis arabellek içeriyor. Renkölçer ürünleri microwell plaka Spektrofotometre kullanarak Absorbans ölçerek sayılabilir. Renk değişimi derecesini östrojenik ligandlar Maya maruz kalmış konsantrasyonu orantılıdır.
Substrat (CPRG veya ONPG) seçim olasılığını test edilen örneklerinden doğan arka plan Absorbans bağlıdır. Örneğin, bitki özleri kez yapay olarak estrogenicity önlemler Eğer açılırsa medyaya bir sarı renk katacak ONPG (405 sayısal nm) substrat β-galaktozidaz için kullanılır. Bitki özleri, CPRG ile (574 sayısal nm) daha uygun bir Renkölçer substrat olabilir. CPRG daha ONPG daha pahalı olmakla birlikte onda biri Derişim kullanılır. Bu makale PCP estrogenicities hem ONPG hem de CPRG kullanarak sayısal özleri sunar.
Estrogenicity ERα ve ERβ kullanarak çevresel örneklerin miktarının daha bu reseptörler sadece birini kullanarak daha kapsamlı bir yaklaşım olacaktır. Hayvanlarda, bu reseptörler fark doku dağıtım, düzenleyici faaliyetleri ve bağlama benzeşim östrojenik ve anti-östrojenik ligandlar15sergi. Sentetik kimyasallar ya ERα ya da ERβ için tercih gösterebilir veya her iki reseptörleri eşit derecede iyi15bağlayabilirsiniz, ancak örneğin, bitkisel kökenli phytoestrogens genellikle ERβ daha güçlü2, bind. Bu nedenle, bağlama bir östrojen reseptör için mutlaka bağlama diğer tahmin değil.
EEs tesisleri yanı sıra birçok tüketici ürünleri (örneğin, böcek ilaçları, deterjanlar, yapıştırıcılar, Yağlama maddeleri, plastikler, gıdalar ve eczacılık) içinde bulunan rağmen sunulan veri bir seçki PCPs. kullanarak elde edilmiştir PCPs zorlayıcı, kolayca kullanılabilir, bütçe-dostça ve çevre ilgili lisans öğrencileri için. Laboratuvarda test evden onların favori PCPs getirmek için öğrenciler davet edilebilir verilebilir. Onlar da yüksek PCPs hipotez tahrik karşılaştırmalar oluşturmak ve toksisite puanları düşük için çevre çalışma grubu16 tarafından geliştirilen Skin Deep veritabanı arama yapabilirsiniz. Bu şekilde, öğrenciler aynı anda Gelişmiş laboratuvar becerileri gelişebilir; kendi kendini yönettiği, araştırmaya dayalı öğrenmede meşgul; ve Çevre Bilimi ve sağlık gelişmekte olan sorunları keşfetmek.
Protocol
1. yapımı reaktifler
- Glikoz ve galaktoz medya karıştırma 6,7 g maya azot temel, 20 g dekstroz veya galaktoz, 20 mg adenin sülfat (200 mg/100 mL sulu hisse senedi çözüm 10 mL eklendi), 20 mg urasil (200 mg/100 mL sulu hisse senedi çözüm 10 mL eklendi) hazırlayın , 60 mg lösin (1 g/100 mL sulu hisse senedi çözüm 6 mL eklendi) ve 20 mg histidin 1 L. Sterilize filtrasyon (0.2 µm filtre) sayesinde son hacmiyle deiyonize su (1 g/100 mL sulu hisse senedi çözüm 2 mL eklendi). Medya 4 ° C'de birkaç hafta saklanır.
- Estradiol (E2) standartlarına göre susuz etanol ve uygun çalışma konsantrasyonları sulandrarak eriterek toz E2 hazırlamak (227.5 nM & 9,75 nM) % 50 etanol içinde.
Not: estradiol 1 mg flakon satın aldıysanız, 1 mL etanol doğrudan şişe estradiol tozu çözülmeye ekleyin. Bu bir 3.67 mM hisse senedi #1 verir. 1 mL 36.71 mikron stokunun #2 yapmak 990 μL etanol içinde #1 stokunun 10 μL sulandırmak. O zaman, 990 μL % 50 etanol 367.13 nM stokunun #3 1 mL yapmak için #2 stokta 10 μL oranında seyreltin. Çalışma stokları yapmak için 619.7 μL #3 stokta 380.3 μL % 50 etanol 227.5 nM çalışan hisse senedi ERα ifade Maya ile standart eğriler oluşturmak için kullanılan 1 mL yapmak oranında seyreltin. 26.56 μL #3 stokta 9.75 nM çalışan hisse senedi ERβ ifade Maya ile standart eğriler oluşturmak için kullanılan 1 mL yapmak 973.44 μL % 50 etanol sulandırmak. Mühür standartları ile parafilm ve -20 mağazada veya-70 ° C.
Dikkat: E2 bir şüpheli kanserojen ve üreme toxicant var. Eğer inhale, yuttu veya deri yoluyla emilir zararlıdır. E2 çocuk ve fetusa emzirmek için zarar verebilir. E2 sucul yaşam için çok toksiktir. Hamilelik ve emzirme sırasında yay ve uygun kişisel koruma (eldiven, duman hood, toz maskesi) kullanın. E2 olarak tehlikeli atık bertaraf ve ortama serbest değil. - Deiyonize su bir final için 8,52 g Na2HPO4, 5.52 g NaH2PO4•H2O, 95.21 mg MgCl2, 745.5 mg KCl, 2 g N-lauroylsarcosine sodyum tuzu ve ONPG (400 mg) veya CPRG (77.7 mg) karıştırılarak LacZ arabellek hazırlamak 20 mL aliquots-20 ° C'de 1 L. mağaza LacZ arabellekte hacmi
Not: 20 mL aliquot bir 96-şey plaka için yeterlidir. - Sodyum karbonat 105.9 g Sodyum karbonat 1 L. mağazasında RT. son hacmiyle deiyonize su karıştırılarak hazırlamak
- 1 M dithiothreitol (DTT) su hazırlamak. DTT 25 µL aliquots-20 ° C'de dondurmak
Dikkat: DTT bir akut deri ve göz tahriş edici değil. Cilt ve göz teması, solunum ve sindirim önlemek için uygun bireysel koruma araçları (eldiven, duman hood, toz maskesi) kullanın.
Not: Her aliquot bir 96-şey plaka için yeterlidir.
2. hazırlama örnekleri ve ayıklama denetimleri
- Örnekleri test etmek için seçin.
Not: Bu makale veri sabun, saç kremi, şampuan, güneş kremi, Dudak kremi, Vakfı, tıraş kremi, tırnak cilası ve losyon da dahil olmak üzere on beş PCPs için sunar. - Örnek 1 g susuz etanol 15 mL konik tüp 10 mL ile birleştirir. 11 mL etanol 15 mL konik tüp içinde oluşan negatif ayıklama denetim hazırlayın. Çoğaltır gerektiği gibi hazırlayın.
Not: sunulan deneysel tasarım için üç aliquots tüm 15 PCPs ve onaylatılacak ayıklama kontrol çözümleri, her biri iletişim kuralını kullanarak bölüm 4 nüsha analiz Toplam 48 örnekleri, verimli hazırlanmıştır. Tek bir tabak triplicates 23 örnekleri hizmet verebilir. Çünkü kolayca buharlaşır susuz etanol Bu adımda kullanılır. Östrojen örnekleri konik tüpler içine leaching değil doğrulamak için negatif ayıklama denetimleri kullanın. - Tüp içeriği için 30 dk el sallayarak ve vortexing bir arada veya bir çok tüp vortexer tüpler sallayarak lunaparkçı.
- Bir kova santrifüj 10 dk. Decant için maksimum izin verilen hızda konik tüpler süpernatant her tüp 40 µm hücre süzgeç aracılığıyla 50 mL konik tüp içine santrifüj kapasitesi. Her 50 mL tüp cam mercek şişe içine boş içeriğini.
- Bırak şişeleri havalandırılmış bir mahalle etanol tamamen buharlaşmasına izin vermek bir hafta için açın. Alternatif olarak, Kuru havalandırılmış bir başlık altında azot veya rotary Evaporatör ile örnekleri. Işık duyarlı bileşenlerinin yıkımı önlemek için (örneğin, yer opak kumaş havalandırılmış hood kapı üzerinde) ışık kurutma örnekleri koruyun.
- 1.0 mL % 50 etanol ve girdap homojenize örneklerinde sulandırmak.
3. Kültür ve Maya14 Subculturing
- Maya 30 ° C'de filtre sterilize glikoz medyada kuluçka tarafından aktif maya kültürleri ( S. cerevisiae14rekombinant W303a zorlanma) korumak Taze filtre sterilize glikoz medya alt kültür Maya haftalık.
- Evet plakaları hazırlanıyor önce iki gece (yaklaşık 42 h) alt kültür maya aktif maya kültürleri 0.1 mL 10 mL steril tekniği kullanarak filtre sterilize glikoz medya ekleyerek. 30 ° C'de iki gece için kuluçkaya. Sallayarak Maya sığ kültürler şişeler steril 250 mL Erlenmeyer yetişir, gerekli değildir.
Not: Maya da buzdolabında Ağar kaplamalar üzerinde birkaç ay saklanabilir. Uzun süreli depolama için (yaş), 15-%50 steril gliserol, girdap ve donma-70 ° C'de O/N kültürler birleştirmek Steril gliserol hazırlamak için bir şırınga 300 µL gliserol gevşetti kapaklı bir cryovial ve basınçlı kap içine aktarmak için kullanın. Sonra 1200 µL O/N Maya kültür steril tekniği kullanarak ekleyin.
4. Evet tabak (gün 1 tahlil) hazırlanması
- Steril bir ölçek ve steril tekniği kullanarak, adım 3.2 Maya 0,065 ±0.005 610, optik bir yoğunluğunun seyreltik nm (OD610) filtre sterilize galaktoz medya.
- Optik yoğunluk pipetting 120 μL nüsha ile birlikte onaylatılacak galaktoz boşluklar her Maya örneğinin tarafından açık polistiren tabakta onaylamak (plaka gerekmez steril olması). Bir plaka Spektrofotometre seyreltilmiş Maya kültür 0,065 ±0.005 çıkarma OD610 okumalar galaktoz boşlukları Maya OD610 okuma net OD610 Maya belirlemek için gelen net bir OD610 sahip olduğunu doğrulamak için kullanın. Son hacim en az 30 mL sulandırılmış Maya her 96-şey plaka için hazırlayın.
Not: 595 ve 610 nm arasında Absorbans ölçme Spektrofotometre filtreler bu ölçüm için kullanılabilir.
- Optik yoğunluk pipetting 120 μL nüsha ile birlikte onaylatılacak galaktoz boşluklar her Maya örneğinin tarafından açık polistiren tabakta onaylamak (plaka gerekmez steril olması). Bir plaka Spektrofotometre seyreltilmiş Maya kültür 0,065 ±0.005 çıkarma OD610 okumalar galaktoz boşlukları Maya OD610 okuma net OD610 Maya belirlemek için gelen net bir OD610 sahip olduğunu doğrulamak için kullanın. Son hacim en az 30 mL sulandırılmış Maya her 96-şey plaka için hazırlayın.
Not: Polipropilen levhalar ısıyla iki yığılmış plaka folyo sarılı tarafından sterilize. Üst plaka örnek plaka için bir kapak olarak hizmet vermektedir ve yıkanmış, re-autoclaved olabilir ve yeniden.
Not: 205 μL kuyulardan G1 - 3 seri seyreltme işlemi tamamlandıktan sonra atın. Bu adımın sonunda, tüm standart wells 120 μL içermelidir. Seri seyreltme Tablo 1' de listelenen son E2 konsantrasyonları ortaya çıkarır. Seri seyreltme adımlar için çok kanallı bir pipettor ile steril ipuçları kullanmak yararlıdır.
Not: Araç kontrol wells Maya hücreleri ve medya ile ilgili arka plan Absorbans ölçmek için kullanılır. Ayrıca, test örnekleri OD610 değerleri karşılaştırarak tespit edilebilir sitotoksisite veya büyüme teşvik etkileri wells bu araç kontrol Wells ile sınayın.
Not: hangi örnekleri veya negatif ayıklama denetimleri eklenir not alın her şey için. Hangi kuyu var ve hangi yapmak değil, ipuçları taze bir kutu ile başlayın ve plaka içinde karşılık gelen wells konumları kutusunda aynı yerden ipuçlarını kullanın takip için. Bir 96-şey plaka 23 örnekleri nüsha olarak hizmet verebilir.
5. işlem Evet tabak (testin 2 gün)
- 30 ° C'de 17 h kuluçka sonra plakaları kuluçka makinesi kaldırın. Tabak hemen işlenebilir, 5.1.1 adıma devam edin. Tabak daha sonraki bir tarihte işlenir, 5.1.2 adıma devam edin.
- Bir çok kanallı pipettor Wells her satırın içeriğini karıştırmak için kullanın ve sonra Maya süspansiyon 50 µL de açık, polistren, 96-iyi Mikroplaka karşılık gelen her kuyudan aktarın.
Not: Polistiren levhalar steril olması gerekmez ama bir kapak olması gerekir. Her ne kadar bir 8-ipucu çok kanallı pipet ile triplicates arasında pipetting Eğer ipuçları yalnızca onaylatılacak kümeleri arasında değişmesi gerektiğini wells, çapraz kirletici önlemek için kuyu her satır için yeni damlalıklı ipuçlarını kullanın.- Yeni plaka etiketleyin. 5.2 adıma geçin.
- Tabak işlemeden önce saklamak için plastik wrap onları sarın. 6 4 ° C'de sarılmış plaka soğutmak ö. daha sonra tabakları buzdolabından çıkarın onları paketini açmak ve adım 5.1.1 olduğu gibi pipetting tarafından tüm wells içeriğini aktarmak. 5.2 adıma geçin.
- Bir çok kanallı pipettor Wells her satırın içeriğini karıştırmak için kullanın ve sonra Maya süspansiyon 50 µL de açık, polistren, 96-iyi Mikroplaka karşılık gelen her kuyudan aktarın.
- 1 m DTT 20 µL çözdürülen, oda sıcaklığında LacZ arabellek 1 mM DTT son bir konsantrasyon için 20 mL ekleyin. Mix LacZ arabellek iyi. Bir çok kanallı pipet kullanıyorsanız, bir reaktif rezervuar dağıtmak.
Dikkat: eldiven giymek ve mümkünse bir başlık, DTT ile çalışmak - Ya da çok kanallı pipet kullanarak veya pipettor yinelenen, DTT ve ONPG veya CPRG polistren levha, Bütün wells için içeren LacZ arabelleği 200 µL ekleyin ve hemen ölçmek ve bütün Wells bir plaka Spektrofotometre kullanarak OD610 kaydetmek. Ek plakalar için gerektiği kadar yineleyin.
Not: OD610 okuma LacZ hesaplama (adım 6.1) payda olarak kullanılır. Bu nedenle, okuma hemen sonra pipetting ve hücreleri yerleşmek önce elde etmek veya LacZ arabellek tarafından lysed. OD610 değerler örnek kuyuları için belirgin bir şekilde daha yüksek veya OD610 değerleri araç kontrol kuyuları için daha düşük ise, örnek özleri büyüme teşvik veya Maya, sitotoksik sırasıyla vardır. Hesaplama için hücre yoğunluğu küçük farklılıklar arasında farklılıklar her iki yönde % 30 fazla ama wells, düzeltmek üzere LacZ sonra ek % 50 etanol içinde (Kimden adım 2.6) örnek Sulandırılan sulandırmak ve örnek adım 3.2 döndürerek tekrar test 12. - Bir kapak ile kuruyucu. Maya içeren tabak 30 ° c (ONPG için) 40 dakika veya 3 h (için CPRG) hızlı o ERα14 kuluçkaya. Maya içeren tabak 30 ° c (ONPG için) 70 dakika veya 4 h (için CPRG) hızlı o ERβ14 kuluçkaya.
Not: Kuluçka kez CPRG ile çalışırken, esnektir; 2-4 h için kuluçka tahlil duyarlılığı artan daha uzun incubations ile her iki reseptörleri ile uygun sonuçlar verir. - Tabak kuluçka sonra bir çok kanallı pipet veya yinelenen pipettor 100 µL Sodyum karbonat, her şey için eklemek için kullanın. Sodyum karbonat pH yükseltir ve β-galaktozidaz reaksiyonu durdurur.
- Ölçmek ve OD405 (için ONPG) veya bütün Wells bir plaka Spektrofotometre kullanarak OD574 (için CPRG) kaydedin.
6.LacZ değer hesaplama
Not: LacZ değerleri renk değişimi her örnek için derecesini ölçmek ve çeşitli değişkenler için muhasebe tarafından ayrı deneyleri arasında değerleri karşılaştırmak için normalleştirilmiş bir yöntem sunmak (örneğin, Maya optik yoğunluk, medya optik yoğunluk ve kuluçka zaman Eğer Bu wells aynı tabakta arasında farklıdır)12.
- Medya (galaktoz) denetim wells (H10-12) için onaylatılacak OD610 değerler anlamına gelir hesaplamak ve onaylatılacak OD405 ya da araç (% 50 etanol) denetim (H1-3) için OD574 değerler anlamına gelir hesaplamak. Bu yollar ve kuluçka süresi (t) plaka için saat cinsinden (renk değişimi her iyi derecesine karşılık gelen) LacZ değerleri hesaplamak için (Adım 5.5) rengini değiştirmek için için tüm standart kullanın ve aşağıdaki denklemleri kullanarak örnek Kuyu yapımı:
- Alternatif olarak, otomatik uygulama standartları ve örnekleri LacZ değerlerini hesaplamak için ek 1 ' kullanın.
Not: uygulama ile kullanılan plaka düzeni şekil 1' de sunulan plaka düzen aynı olmalıdır. Eğer bazı örnek kuyular kullanılan değil, ek 1 LacZ uygulama yapıştırılan Absorbans dataset içinde yer tutucu olarak boş kuyulardan Absorbans ölçümleri korur. Bu uygulama plaka kayma düzenini korur ve medya kontrol wells gerekli konumlarında olmasını sağlar. Ayrıca, boş hücreler varsa uygulama yürütmez.
- Alternatif olarak, otomatik uygulama standartları ve örnekleri LacZ değerlerini hesaplamak için ek 1 ' kullanın.
- Araçlarının her E2 standart ve her örnek için onaylatılacak LacZ değerleri hesaplayın. Demek LacZ değerleri µL-1rapor s-1. Günlük-her E2 standart konsantrasyonları Dönüştür ve (ek 2) template.csv dosyası olarak biçimlendirilmiş bir elektronik belge oluşturmak.
7. enterpolasyonla 4-parametre Logistic regresyon kullanarak örnek Estradiol eşdeğerlerine (EEQs)
Not: Örnek LacZ değerler (renk değiştir) LacZ değerleri E2 ile oluşturulan standart eğrisi EEQs ile ilgili. EEQs böylece ne kadar örnek aynı renk değişikliği yanıt E2 bilinen bir konsantrasyon olarak temin için gerekli olduğunu belirlemek.
- EEQs test örnekleri için hesaplamak için standart eğri çizmek. E2 standartları (y ekseni) ve karşılık gelen günlük dönüştürülmüş E2 konsantrasyonları (x ekseni) dört parametre logistic regresyon modeli için ortalama LacZ değerleri uygun.
- Model test örnek LacZ değerler için EEQs getirmek için kullanın. Ek 2' de belirtildiği gibi istatistiksel yazılım kullanarak EEQs Logistic regresyon hesaplamaları gerçekleştirin.
8. EEQs (ng/mL) PCP örnek kitle standartlaştırılmasına
- EEQs eklenen PCP örnek miktarı ile ilişkili her şey adım 4.5, EEQ (ng/mL) örnek wells (325 µL) kaplama toplam birim tarafından çarpma ve sonra ayıklanan örnek eklendi hacimce bölme için her şey (5 µL).
Not: Bu değerler ayıklanan örnek mL EEQ gösterir. PCP 1 g kullanarak örnekleri hazırlanmıştır, bu değerler de EEQ PCP (ng/g) gram başına temsil. Bu şekilde ifade, EEQ değerleri (ng/g) arasında farklı PCPs. EEQ (ng/g) değerler için bu çalışmada test kişisel bakım ürünleri Tablo 2' de gösterilen ve tüm iletişim kuralı toplanan örnek veri içinde bulunan karşılaştırılabilir Ek 3.
Representative Results
Estrogenicities 15 PCPs onaylatılacak örnekleri bu Evet protokolü kullanılarak değerlendirilmiştir. Miller vd tarafından belirtildiği gibi (2010), ERβ ifade Maya ile deneyleri bir büyüklük deneyleri ERα (Şekil 2)14ifade Maya ile daha hassas daha vardı. Bu nedenle, östrojenik aktivite daha sık ERβ ifade Maya (Tablo 2) ile tespit edilmiştir. Östrojenik aktivite ile ERβ sekiz PCPs sergiledi ve östrojenik aktivite ile ERα 5 PCPs sergiledi. Vakfı, tıraş kremi ve tırnak cilası yalnızca test konsantrasyonları ERβ ile östrojenik ise saç kremi, güneş kremi, losyon ve Dudak kremi örnekleri her iki reseptörleri ile östrojenik. Diğer yedi PCPs (4 şampuanlar, 2 sabunlar ve 1 Dudak kremi) ile test edilen konsantrasyonlarda ya reseptör östrojenik değildi.
Reseptör duyarlılık farklılıkları ek olarak, her örnek için EEQs tahlil (Tablo 2) kullanılan Renkölçer substrat (ONPG veya CPRG) bağlı olarak farklılık. Tüm bir örnek ama, ONPG kullanarak kararlı EEQs bu CPRG kullanarak kararlı daha yüksek bulundu. Ayrıca, ayıklama çoğaltır arasında varyasyon için EEQs ERβ ve CPRG ile ölçülen en düşük ve en yüksek EEQs için ERα ve ONPG (Tablo 2) ile belirlenir.
Renkölçer yüzeylerde karşılaştırma ek olarak 1 da çalışmanın amacı kuluçka test bir lisans laboratuvar ders programı ile uyumlu olan süre kere oldu. Tipik Evet tahlil 17 h kuluçka hemen tek bir haftalık oturum kısıtlı bir öğretim laboratuvar olarak uygulamak imkansız bir zamanlama LacZ arabelleği için 40 dk - 4 h, kuluçka tarafından takip gerektirir. Bu tahlil öğretim kullanımını kolaylaştırmak için tahlil bir 6 d soğutma süre (Adım 5.1.2) 17 h kuluçka sonra tanıtarak güncellenmiştir. Buzdolabında tabak üzerinden standart eğrileri bu sigara buzdolabında tabak dan karşılaştırılabilir (rakamlar 2 & 3), dört parametre logistic regresyon modeli kullanarak tahmini parametrelerinin standart hataları tüm olduğunu dışında nonrefrigerated plakaları (Tablo 3) için buzdolabında plakaları için daha küçük. Böylece, kaplamalar için 6 d soğutma hata azaltır ve EEQ tahminleri doğruluğunu artırır.
Şekil 1. Microwell plaka düzeni ve standart seyreltme eğri Evet tahlil için hazırlık. E2 standartları (ışık gri wells), örnekleri ve negatif ayıklama denetimleri (beyaz wells) ve araç (H1 - 3) ve galaktoz medya (H10 - 12) denetimleri (koyu gri wells) tek nüsha test edildi. Bir E2 standart eğri (ışık gri wells) içine kuyu A1 A3 ve 120 µL wells B1 G3 üzerinden içine Maya Maya 320 µL kaplama tarafından inşa edilmiştir. Sonra 5 µL E2 (227.5 nM ERα hızlı Maya için; 9,75 nM ERβ hızlı Maya için) kuyu A1 A3 ile Maya için eklenmiştir. Maya + E2 süspansiyon seri olarak Tablo 1' de listelenen son E2 konsantrasyonları verimli de altındaki her kuyudan 205 µL aktararak seyreltilmiş. Seri seyreltme işleminin sonunda, 205 µL kuyulardan G1 G3 her iyi 120 µL son hacmi elde etmek için üzerinden atılmalıdır, unutmayın. Örnek ve negatif ayıklama denetim wells (% 50 etanol içinde çözünmüş) her ekstresinin 5 µL ekleyerek Maya 320 µL için hazırlanmıştır. Araç kontrol wells (H1 - 3) Maya 320 µL % 50 etanol 5 µL ekleyerek hazırlanmıştır. Tüm örnek ve denetim kuyuları pipetting tarafından karıştırıldı ve 205 µL kaldırıldı ve 120 µL için iyi birimleri ayarlamak için atılır. Son olarak, medya kontrolleri galaktoz medya 120 µL H10 - 12 kuyu kaplama tarafından hazırlanmıştır. Ek 1 ve ek 2' de, E2 açıklanan R tabanlı uygulama LacZ hesap makinesi kullanmak zorunda standart eğri ve araç ve galaktoz medya denetimleri kaplama gösterildiği gibi gerekir. Kaplama sırasını belirtilmediği sürece örnekleri ve negatif ayıklama denetimleri beyaz wells hiçbirinde kaplama. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2. Standart eğriler 4-parametre Logistic regresyon oluşturulan Evet plakaları için. İki yüzeylerde (ONPG & CPRG) iki insan östrojen reseptörleri (ERα veya ERβ) her iki(a)olmadan birini ifade Maya kullanarak test edildi ve (B) 6 d soğutma süresi sonunda 17β-östradiol ve örnek ile 17 h kuluçka ile ayıklar. Tüm E2 standartları ve medya ve araç denetimleri nüsha test edildi. Puan nereye LacZ değerleri β-galaktozidaz tarafından indüklenen renk değişikliği derecesini yansıtır onaylatılacak LacZ değerlerden anlamına gelir temsil eder. Logistic regresyon modeli parametreler Tablo 3' te listelenir. ONPG = ortho- nitrophenyl-β-D-galactopyranoside; CPRG chlorophenol kırmızı-β-D-galactopyranoside =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3. Gelişmiş Evet tabak örnekleri. İki yüzeylerde (ONPG & CPRG) insan östrojen reseptörleri (ERα veya ERβ), ifade Maya kullanarak test edildi ya olmadan (sol) veya (sağ) altı gün soğutma süresi sonunda 17 h kuluçka 17β-estradiol veya örnek ile ayıklar. Tüm E2 standartları, medya ve araç denetimleri triplicates test edildi. Levhalar her plaka ve denetimleri (% 50 etanol + Maya sağ sol ve galaktoz medyada) göre şekil 1her plaka alttaki üst satırdaki en yüksek E2 konsantrasyon ile düzenlenmiştir. ONPG = ortho- nitrophenyl-β-D-galactopyranoside; CPRG chlorophenol kırmızı-β-D-galactopyranoside =.Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Standart numarası | [E2] için ERα Maya (AM) | [E2] için ERβ Maya (AM) |
| 1 | 3500 | 150 |
| 2 | 2208 | 94.6 |
| 3 | 1393 | 59.7 |
| 4 | 878 | 37.6 |
| 5 | 554 | 23,7 |
| 6 | 349 | 15 |
| 7 | 220 | 9,45 |
Tablo 1. Son konsantrasyonları E2 standartları Evet içinde kullanılan.
Toz E2 susuz etanol içinde çözünmüş ve hisse senedi 227.5 konsantrasyonları çalışmaya seyreltilmiş nM (için ERα hızlı Maya) ve 9,75 nM (Maya ERβ ifade) için % 50 etanol içinde.Çalışma stokları Maya galaktoz medya içeren Mikroplaka wells için eklendi ve seri olarak tabloda gösterilen konsantrasyonları seyreltilmiş.
| Test örnekleri | Tahlil koşulları | Östrojenik karşılıkları (EEQs) PCPs | |||||
| PCP # | Örnek türü | Reseptör | Substrat | EEQ 1 (ng/g) | EEQ 2 (ng/g) | EEQ 3 (ng/g) | EEQ (ng/g) demek |
| 1 | Saç kremi | ERα | ONPG | ND | 0.379 | ND | < 0.379 |
| 1 | Saç kremi | ERα | CPRG | ND | ND | ND | ND |
| 1 | Saç kremi | ERβ | ONPG | 0.528 | 0.338 | 0.363 | 0.410 |
| 1 | Saç kremi | ERβ | CPRG | ND | 0.215 | ND | < 0.215 |
| 4 | Güneş kremi | ERα | ONPG | 6.803 | 1.390 | ND | < 4.097 |
| 4 | Güneş kremi | ERα | CPRG | ND | ND | ND | ND |
| 4 | Güneş kremi | ERβ | ONPG | 1.321 | 0,838 | 0.818 | 0.992 |
| 4 | Güneş kremi | ERβ | CPRG | 0.651 | 0.591 | 0.725 | 0.656 |
| 7 | Vakfı | ERα | ONPG | ND | ND | ND | ND |
| 7 | Vakfı | ERα | CPRG | ND | ND | ND | ND |
| 7 | Vakfı | ERβ | ONPG | ND | 0,158 | ND | < 0,158 |
| 7 | Vakfı | ERβ | CPRG | ND | ND | ND | ND |
| 9 | Tıraş kremi | ERα | ONPG | ND | ND | ND | ND |
| 9 | Tıraş kremi | ERα | CPRG | ND | ND | ND | ND |
| 9 | Tıraş kremi | ERβ | ONPG | ND | 0.256 | 0.295 | < 0.276 |
| 9 | Tıraş kremi | ERβ | CPRG | 0.507 | 0.392 | 0.560 | 0.486 |
| 10 | Tırnak cilası | ERα | ONPG | ND | ND | ND | ND |
| 10 | Tırnak cilası | ERα | CPRG | ND | ND | ND | ND |
| 10 | Tırnak cilası | ERβ | ONPG | 0.916 | 0.503 | 0,554 | 0.658 |
| 10 | Tırnak cilası | ERβ | CPRG | 0.532 | 0.628 | 0.594 | 0.585 |
| 11 | Losyon | ERα | ONPG | ND | ND | 2.327 | < 2.327 |
| 11 | Losyon | ERα | CPRG | ND | ND | ND | ND |
| 11 | Losyon | ERβ | ONPG | Aralığı aşıyor | 2.599 | 1.845 | > 2.222 |
| 11 | Losyon | ERβ | CPRG | -- | 1.986 | 1.236 | 1.611 |
| 13 | Güneş kremi | ERα | ONPG | 14.069 | 11.494 | 10.189 | 11.917 |
| 13 | Güneş kremi | ERα | CPRG | 4.773 | 5.790 | 5.850 | 5.471 |
| 13 | Güneş kremi | ERβ | ONPG | Aralığı aşıyor | 2.580 | Aralığı aşıyor | > 2.580 |
| 13 | Güneş kremi | ERβ | CPRG | 0.292 | 0.240 | ND | < 0.266 |
| 15 | Dudak kremi | ERα | ONPG | ND | ND | 0.431 | < 0.431 |
| 15 | Dudak kremi | ERα | CPRG | ND | ND | ND | ND |
| 15 | Dudak kremi | ERβ | ONPG | 1.202 | 1.060 | 0.887 | 1.050 |
| 15 | Dudak kremi | ERβ | CPRG | 0.820 | 0.871 | 0.851 | 0.847 |
Tablo 2. PCPs EEQs sıfır EEQs ile. 15 PCPs ve üç ayıklama denetim üç aliquots susuz etanol homojenize, buharlaşan ve her biri nüsha Evet tahlil kullanarak analiz Toplam 48 örneklerin % 50 etanol içinde yeniden düzenlendi. Sekiz PCPs en az 1 sıfır EEQ, 7 PCPs test konsantrasyonları östrojenik olmak bulunamadı vardı. EEQ 1, EEQ 2 ve EEQ 3 her PCP üç aliquots için bakın, her nüsha ayrı bir plaka üzerinde test. EEQ 1, EEQ 2 ve EEQ 3 triplicates her aliquot için anlamı vardır. Assay olarak kullanılan maya 1 / insan östrojen reseptörleri (ERα veya ERβ) 2 izoformlarının ifade. İki Renkölçer yüzeylerde, ONPG ve CPRG, Sigara buzdolabında protokolü kullanılarak test edilmiştir. EEQs LacZ değerleri (ile R2 değerleri ≥ 0.98) dört parametre logistic regresyon her 7 konsantrasyonları E2 de kullanılarak belirlenmiştir. ND tahlil algılama sınırın altına =.--kayıp çoğaltıldıktan =.
| Tahlil koşulları | Modeli parametreler | ||||||
| Reseptör | Substrat | 6 d için 4 ° C'de tutuklama | Model R2 | Büyüme oranı (LacZ birimleri/ng/ml) | Dönüm noktası (ng/mL) | Alt asimptot (LacZ adet) | Üst asimptot (LacZ adet) |
| ERα | ONPG | HAYIR | > 0,99 | 8.548 ±1.633 | -0.512 ±0.025 | -1.623 ±4.408 | 128.11 ±6.31 |
| ERα | ONPG | EVET | > 0,99 | 7.618 ±0.758 | -0.587 ±0.014 | -8.378 ±2.223 | 99.53 ±2.528 |
| ERα | CPRG | HAYIR | > 0,99 | 8.256 ±2.182 | -0.610 ±0.033 | 0.853 ±3.333 | 62.52 ±3.473 |
| ERα | CPRG | EVET | > 0,99 | 5.068 ±0.616 | -0.523 ±0.022 | -3.147 ±1.946 | 68.06 ±3.069 |
| ERβ | ONPG | HAYIR | > 0,99 | 1.041 ±2.004 | -0.898 ±4.410 | -32.98 ±86.62 | 248.6 ±778.9 |
| ERβ | ONPG | EVET | > 0,99 | 4.327 ±1.289 | -1.736 ±0.087 | 4.654 ±3.087 | 66.37 ±10.75 |
| ERβ | CPRG | HAYIR | 0,99 = | 5.673 ±1.764 | -1.914 ±0.052 | 3.925 ±1.679 | 28.05 ±2.334 |
| ERβ | CPRG | EVET | > 0,99 | 4.412 ±1.142 | -1.894 ±0.051 | 2,052 ±1.303 | 22.64 ±2.047 |
Tablo 3. Model parametre 4-parametre Logistic gerileme için standart eğrileri, Şekil 2. İki yüzeylerde, ONPG ve CPRG, Maya olmadan ve 17 h kuluçka sonra altı gün soğutma süresi ile 1 / 2 insan östrojen reseptörleri (ERα veya ERβ) ifade kullanarak test edildi. Parametreleri ±standard hataları tahmin ediyor olarak bildirilir.
Ek 1. Uygulama LacZ değerleri hesaplamak için. Uygulamayı kullanmak için önce (olarak malzeme tablokaydetti) Ücretsiz Java yazılımını indirme. Daha sonra LacZ uygulamayı açabilir. Uygulama ile kullanılan plaka düzeni şekil 1' de sunulan plaka düzen aynı olmalıdır. Eğer bazı örnek kuyular kullanılan değil, LacZ uygulama yapıştırılan Absorbans dataset içinde yer tutucu olarak boş kuyulardan Absorbans ölçümleri korur. Bu uygulama plaka kayma düzenini korur ve medya kontrol wells gerekli konumlarında olmasını sağlar. Ayrıca, boş hücreler varsa uygulama yürütmez. Yapıştır (için ONPG) OD405 okuma veya klavye komutu "(ctrl) Ctrl + v" kullanarak tüm Wells (için CPRG) OD574 okuma ya da "command + v," kullanılan bilgisayar platformuna bağlı olarak. Saat renk üretmek tahlil için kuluçka süresini girin (Adım 5,4; Örneğin, 0.66667 h 40dakika için). İleri'yi tıklatın. OD610 okuma adım 5.3 yapıştırın. Gönder'i tıklatın. LacZ sonuçları görüntülenir ve basarak "kontrol (ctrl) + c" veya "command + c," kullanılan bilgisayar platformu üzerinde bağlı olarak kopyalanabilir. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.
Ek 2. EEQs hesaplamak için istatistiksel yazılım seçenekleri. EEQs sunulan üç seçenekten birini kullanılarak hesaplanabilir. 1 kullanarak için yönergeler. JMP yazılım veya 2. R kod ek 2'de verilmektedir. R kodu da 3'e dönüştürdü. https://furmanbiology.shinyapps.io/YESapp/ kullanılabilir bir uygulama biçimi. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.
Ek 3. Örnek Maya bu hızlı ERα ve CPRG substrat kullanarak veri toplanan. Ölçümleri610 OD ve574 her yedi E2 standartları, araç ve medya denetimleri için OD ve tek temsilcisi PCP örnek, hesaplanan LacZ değerleri ile birlikte dahil. LacZ değerleri standart adımları 7A içinde açıklandığı gibi standart eğri dört parametre logistic regresyon modeli oluşturmak için kullanılan & B yukarıdaki. Model EEQs ng/ml Mikroplaka Wells temsilcisi örnek onaylatılacak tahminleri getirmek için kullanıldı. Bu değerler daha sonra ng/g örnek (Adım 8.1) ifade edilen EEQs çevrildi. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.
Discussion
Evet, su, yiyecek, bitki doku veya kişisel bakım ürünleri gibi çevre örneklerinde östrojenik ligandlar algılamak için kullanılan düşük maliyetli bir yöntemdir. Veri burada karşılaştırma 2 östrojen reseptörleri (ERα ve ERβ), 2 yüzeylerde (ONPG ve CPRG) ve 2 zaman çizelgeleri (soğutma olmadan 2 d Protokolü) ve yedi günlük iletişim kuralı ile soğutma estrogenicity Evet tahlil üzerinden kişisel bakım ürünlerinde ölçmek için sunulan. Ayrıca zaman kısıtlamaları ile uyumlu olma yalnızca bir kez karşılayan lisans Laboratuvarı kursları tarafından empoze ederken 7 d, EEQs CPRG ve ERα ve/veya ERβ en iyi ifade Maya buzdolabında iletişim kuralı'nı quantifies / hafta birkaç h için. Aslında, soğutma olmadan 2 d tahlil için karşılaştırıldığında, yedi gün buzdolabında tahlil plaka çoğaltır arasında sınırlı varyans ile ilişkili. Buna ek olarak, standart eğri doğrusal parçası biraz buzdolabında tahlil kullanarak toplanan veriler için genişletildi. Standart eğri doğrusal bölümünü tahlil algılama aralığı tanımlar ve örnek EEQs getirmek için kullanılan standart eğri tek bir bölümüdür.
Tüm test örnekleri biri dışında CPRG kullanarak ölçülen EEQs bu ONPG ile sayısal daha düşük bulunmuştur. Bir daha yüksek tükenme katsayısı ve alt Km ve Vmaxile CPRG on kat daha fazla ONPG17duyarlıdır. Böylece, CPRG düşük konsantrasyonlarda kullanılabilir ve daha düşük miktarlarda β-galaktozidaz algılamak için kullanılabilir. Bu nedenlerden dolayı CPRG ONPG18,19üzerinde genellikle tercih edilir. Ancak, büyük substrat duyarlılığı düşük EEQ değerler ile CPRG algılanan açıklamaz. Diğer yazarlar2,18tarafından belirtildiği gibi ONPG ile tespit daha yüksek EEQ değerleri tahlil ile matris girişim nedeniyle olabilir. Kişisel bakım ürün özleri gelen sarı pigmentler ile ONPG tespit EEQ değerleri şişirmek. Diğerleri bu sorun onların deneysel tasarım2, bir deney levha sayısı ikiye katlanır bir yaklaşım pigment denetimleri dahil ederek hile. Matris girişim sorunlu olabilir ne kadar daha pahalı ve ONPG daha uzun kuluçka süreleri gerektirir CPRG Evet tahlil için tercih edilir substrat olabilir. Ayrıca, β-galaktozidaz tarafından ham malzeme cleavage tarafından indüklenen renk değişikliği ile CPRG sonuçları görselleştirmek öğrenciler için daha kolay, daha dramatik.
Miller vd. (2010), kim bu protokol için kullanılan Maya mühendislik, bu Maya ERβ 30 x daha 17β-estradiol için Maya ERα, bizim veri14tarafından kanıtlanmış bir bulgu ifade daha hassas olduğunu ifade kaydetti. Ayrı--dan potansiyel nüanslar plazmid inşaat, Miller vd. (2010) duyarlılık14bu farkı anlatmak değil. ERβ ifade glikoz veya galaktoz tarafından düzenlenir, ancak iki plazmid yapıları arasında bir fark ERα ifade galaktoz tarafından düzenlenmiştir olmasıdır. Evet assay olarak kullanılan Maya glikoz medyada kültürlü ve tahlil başlangıcında seyreltilmiş zaman sadece galaktoz göz önüne alındığında. Bu nedenle, ERβ ifade Maya kopya numaraları daha büyük reseptör protein böylece östrojenik ligandlar daha yüksek duyarlılık veriyor testin başlangıç önce birikir.
Maya ERα ifade etmek daha düşük duyarlılık algılama estrogenicity ile ERα ERβ ile karşılaştırıldığında ölçülen örneklerinde yüksek oranda açıklayabilir. Olasılığını artırmak için bu örnek EEQs tespit, kullanıcılar farklı ayıklama çözücüler ve yöntemleri istihdam veya örnek daha yüksek miktarlar için maya ekleyin. Daha yüksek örnek birimleri kullandıysanız, öyle ki standartlar ve örnekler aynı birim-ebilmek var olmak kullanılmış içinde tahlil E2 standartları konsantrasyonları ayarlanmalıdır. Daha fazla örnek ekleme bir maya kuluçka sıcaklıklar 30 vs 35 ° C20daha iyi hoşgörü ile sadece % 6-10 etanol, tolere edebilir kısıtlamadır. Maya etanol etkileri için denetlemek için müfettişler onaylatılacak "sadece Maya" wells plaka düzenine ekleme ve bu "sadece Maya" Wells OD610 hemen OD610 araç kontrol Wells için karşılaştırılabilir olduğunu doğrulayın LacZ arabellek eklenmesinden sonra. Alternatif olarak, Kuru microwell plakaları ve Maya eklenir önce kapalı buharlaşıp etanol etanol içinde çözünmüş örnekleri eklenebilir. Dimethylsulfoxide (DMSO) de bir örnek çözücü Evet deneyleri, ama DMSO son çalışma konsantrasyonu Maya ile %112' ye sınırlı olmalıdır kullanılır.
Evet tahlil estrogenicity çevre örneklerinde algılamak için bir güçlü tarama aracıdır. Özellikle, Evet gen ifade14yönlendirmek için östrojen yanıt öğeleriyle etkileşim nükleer östrojen reseptörleri bağlamak ligandlar algılar. Ancak, Evet de önemli sınırlamaları vardır. Evet membran östrojen reseptörleri gibi nükleer olmayan mekanizmalar veya aktivatör Protein 1 (AP-1) transkripsiyon faktörleri gibi ek ögeler dahil mekanizmaları aracılığıyla çalışma EEs algılamaz. Ayrıca, memeli hücre olarak aynı metabolik kapasiteye Maya yok çünkü, Evet östrojenik olmak metabolik etkinleştirme gerektiren ligandlar algılayamaz.
Ayrıca, Evet tahlil kolayca karmaşık örneklerinde östrojenik ve anti-östrojenik ligandlar ayırt edemez. Bunun yerine, bu östrojenik ve anti-östrojenik ligandlar toplam etkisi net estrogenicity ölçer. ER antagonistleri konsantrasyonu ölçmek veya karışımlar inhibitör etkinliğini değerlendirmek için tahlil Maya standart agonist (17β-estradiol) ve bir dizi test örnek konsantrasyonları12ile kuluçka tarafından değiştirilebilir. Bu işlem örnekleri antagonistleri muhabir agonist kaynaklı etkinlik düşürebilir belirler ve ER antagonistleri örneklerinde varlığını belirlemek için yararlı bir ekran sağlar.
Bazı örnekler çıkarma ve örnek hazırlık adımları değişiklikler gerektirebilir, ancak burada sunulan Protokolü örnek türü, hizmet verebilir. Örneğin, yaygın olarak arasında çeşitli EEQs bazı kişisel bakım ürünleri çoğaltır. Daha fazla değişken numune yağ damlacıkları içerir eğilimi veya aksi halde bir daha lipofilik çözücü Dietil eter gibi yararlı olacağını belirten tamamen homojen değildi. Alternatif olarak, yağlar ve balmumu kişisel bakım ürünlerinde % 50 etanol yerine % 100 etanol örnekleriyle ayıklayarak dışarıda.Bir % 50 etanol çıkarma da daha fazla suda çözünür östrojenik ligandlar (örneğin, bazı pigmentler) yakalayacaktır. Ancak, % 50 etanol % 100 etanol göre daha yavaş buharlaşır ve böylece ayıklama saat uzatabilir. Ayrıca, bazı örnekleri (sabun gibi) düşük hücre yoğunluk ölçümleri (OD610) kaynaklanan Maya, sitotoksik. Fox vd. (2008) tür örnekleri seyreltilmiş ve hücre yoğunluk farkları araç kontrol wells12' ye kıyasla % 30 aşmanız durumunda yeniden test olduğunu öneririz.
Evet tahlil analitik araştırma amaçlı kullanılırsa, örnek havuzları seyreltme eğrileri preemptively özü adım 4.5 Maya eklenmek üzere uygun miktarda belirlemek için test edilebilir. Alternatif olarak, özleri aynı anda birden fazla birim (örneğin, 5 µL ve Maya 4.5 adımda eklenen 20 µL özü), test edilebilir veya (örneğin, 0.2 µL, 2 µL ve 20 µL) büyüklük yayılan dilutions. "Uygun" özü hacimleri estrogenicity standart eğri doğrusal parçası boyunca LacZ değerleri eşleştirerek tanımlamak bunlar. En iyi duruma getirme sitotoksisite, yanlış negatif veya standart eğri aşan estrogenicity gibi Maya için çok fazla veya çok az örnek ekleyerek ortaya çıkan sorunları engeller. Maya maruz öyle ki bir tutarlı hacmi ve konsantrasyon etanol veya diğer araç plaka arasında ligand farklı miktarda kullanıldığında yukarıda belirtildiği gibi örnekleri ve E2 standartları hacimleri ayarlanmalıdır.
Yanlış negatifler için potansiyel rağmen Evet tahlil bir Tier 3 test aracı olarak Endokrin Bozucular için Schug vd tarafından belirlenmiştir (2013), kim bir kapsamlı katmanlı iletişim kuralı endokrin bozulma (TiPED)21için geliştirilmiştir. Lisans eğitimi için tahlil endokrin bozulma, hücre kültürü, reseptör bağlama, enzim aktivitesi, genetik mühendisliği, istatistik ve deneysel tasarım ile ilgili kavramları öğretmek için değerlidir. Tahlil kullanan öğrenciler aynı zamanda seri olarak standartlar sulandrarak gibi temel ve geniş ilgili laboratuvar becerileri uygulama; Ayıklanan örnekleri; çözümler yapma; oluşturmak ve standart eğrileri enterpolasyonla; konsantrasyonları hesaplama; çözümler yapma; steril tekniği gösteren; hücre kültürü çalışmalarının; değişkenler ve denetimler belirlenmesi; toplama, düzenleme ve veri analizi; oluşturma ve grafik yorumlama; ve micropipettors ve Spektrofotometreler gibi ortak labaratuar donanımları kullanarak.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu proje TME ve AMR Louisiana Tech Üniversitesi ve Furman Üniversitesi, sırasıyla fon start-up tarafından finanse edildi. Ek finansman tarafından sağlanan bir 2015 öğretim gelişme hibe AMR ve ilişkili kolej Güney, bir Louisiana EPSCoR Pfund hibe TME Ulusal Bilim Vakfı ve Louisiana kurulu Regents ve TME bir seyahat Ödülü için gelen TME Güney Üniversitesi. Biz Dr David Eubanks (Furman) İstatistiksel analizler ve Bay Christopher Moore hakkında yardım almak için "bize yardım etmek için" çekimler sırasında teşekkür ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Vortex Mixer (for single or multiple tubes) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 02-215-365 | Any mixer will suffice. |
| Bucket centrifuge | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 75-063-839 | Any bucket centrifuge will suffice if it is capable of centrifuging conical tubes at 4000 rpm. |
| Bunsen burner | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 17-012-823 | Any Bunsen burner will suffice, or an alcohol burner (Fisher Scientific 04-245-1) can be used instead. |
| Incubator | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 50125590H | Any incubator will suffice if it is capable of maintaining 30 °C. |
| Microplate reader | BioTek (www.biotek.com) | EPOCH2 | A different brand of plate reader will suffice if it can measure absorbance at wavelengths of 405, 574, and 610 nm. |
| Gen5 microplate reader and imager software | BioTek (www.biotek.com) | GEN5 | Software required depends on make and model of plate reader; GEN5 software is intended for use with BioTek plate reader. |
| Refrigerator | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 05LREEFSA | Any refrigerator will suffice if it is capable of maintaining 4 °C. |
| Pipettor or PipetAid compatible with 1 - 10 mL serological pipets | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 13-681-15E | Any pipettors will suffice if they are compatible with 1 & 10 mL serological pipets. |
| P10 micropipettor | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | F144562G | Any micropipettor will suffice if it is capable of dispensing 5 µl. |
| P200 micropipettor | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | F144565G | Any micropipettor will suffice if it is capable of dispensing up to 200 µl. |
| P300 multichannel pipettor | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | FBE1200300 | Any multichannel pipettor will suffice if it is capable of dispensing 50 - 205 µl. |
| Repeating pipettor | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | F164001G | Must be able to deliver 100 - 320 µl; this pipettor is optional because a multichannel pipettor can be used instead. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supplies | |||
| Sterile 15 mL conical tubes with caps | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 05-539-801 | |
| Glass scintillation vials | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 03-337-4 | |
| Polystyrene 96-well, flat-bottom microplates with lid (nonsterile) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 12565501 | |
| Polypropylene 96-well, flat-bottom microplates without lid | Cole-Parmer (www.coleparmer.com) | EW-01728-81 | |
| 100 mL glass beakers | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 02-539H | Any glass beakers will suffice if they are autoclavable. |
| 250 mL glass Erlenmeyer flasks | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | FB500250 | Any glass Erlenmeyer flasks will suffice if they are autoclavable. |
| Sterile, adhesive, porous film | VWR (www.vwr.com) | 60941-086 | |
| Metal forceps | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 12-000-157 | Any metal forceps will suffice. |
| Reagent reservoir | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 07-200-127 | |
| Filtration units (0.2 µm) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 09-761-52 | |
| Squirt bottle (for ethanol) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 02-897-10 | Any laboratory squirt bottles will suffice. |
| Autoclavable storage bottles | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 06-414-1D | Any autoclavable glass storage bottles will suffice. |
| 10 mL glass serological pipets (sterile) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 13-678-27F | Any glass serological pipets will suffice. |
| 1 mL glass serological pipets (sterile) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 13-678-27C | Any glass serological pipets will suffice. |
| P10 micropipettor tips | USA Scientific (www.usascientific.com) | 1120-3810 | Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above. |
| P200 micropipettor tips | USA Scientific (www.usascientific.com) | 1120-8810 | Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above. |
| P300 micropipettor tips | USA Scientific (www.usascientific.com) | 1120-9810 | Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above. |
| Syringe tips for repeating pipettor | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | F164150G | Only required if a repeating pipettor is used. |
| Sterile petri dishes | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | FB0875712 | Any sterile petri dishes will suffice. |
| Parafilm | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | S37440 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast | |||
| Saccharomyces cerevisiae strains that lack the TRP1 gene product (e.g., W303a) | American Type Culture Company (ATCC) (www.ATCC.org) | MYA-151 | Recombinant yeast are also available upon request from the authors. |
| Receptor/reporter plasmid for ERα | Addgene (www.addgene.org) | pRR-ERalpha-5Z (Plasmid #23061) | |
| Receptor/reporter plasmid for ERβ | Addgene (www.addgene.org) | pRR-ERbeta-5Z (Plasmid #23062) | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Difco agar | BD (www.bd.com) | 214530 | |
| Dithiothreitol | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | D0632 | CAUTION: Dithiothreitol is an acute skin and eye irritant. Use appropriate personal protection equipment (gloves, fume hood, dust mask) to avoid skin and eye contact, inhalation and ingestion. |
| Ortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | N1127 | |
| Chlorophenol red-β-D-galactopyranoside | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | 10884308001 | |
| Yeast nitrogen base | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | Y0626 | |
| Glucose | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | G8270 | |
| Galactose | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | G5388 | |
| Adenine sulfate | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | A9126 | |
| Uracil | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | U0750 | |
| Leucine | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | L8000 | |
| Histidine | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | H8000 | |
| 17 β-Estradiol | Sigma (www.sigmaaldrich.com) MP Biomedicals | E8875-250 mg 0219456401 - 1 mg | CAUTION: Estradiol is a suspected carcinogen and reproductive toxicant. It is harmful if inhaled, swallowed, or absorbed through skin. Estradiol may cause harm to breast-fed children and fetuses. Estradiol is very toxic to aquatic life. Use appropriate personal protection (gloves, fume hood, dust mask) and avoid exposure during pregnancy and lactation. Estradiol should be disposed of as hazardous waste and not released to the environment. |
| 100% ethanol | Pharmco-Aaper (www.pharmcoaaper.com) | 111000200 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic (anhydrous) | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | S0876 | |
| Magnesium chloride | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | M8266 | |
| Potassium chloride | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | P9333 | |
| Sarkosyl (N-lauroylsarcosine sodium salt) | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | L5125 | |
| Sodium carbonate | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | S7795 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Excel spreadsheet software | Microsoft | Excel is convenient spreadsheet software for managing data outputs and generating .csv files for R analysis. | |
| Java software (required for Appendix 1 application) | Oracle Corporation | To calculate LacZ values using the application in Appendix 1, first download free Java software (https://www.java.com/en/download/), then open the LacZ application in Appendix 1. LacZ results created by the application can be copied by pressing "control (ctrl) + c" on PC keyboards, or "command + c" on Mac keyboards. | |
| JMP statistical software version 13.0.0 | SAS Institute | Appendix 2 includes directions on using JMP to fit LacZ data to a four-parameter logistic regression curve. The curve is used to interpolate test sample estradiol equivalents (EEQs), relative to the estradiol standard curve. | |
| R statistical computing and graphics software | R Foundation | Free R software can be downloaded from https://www.r-project.org/. Directions and code for using R to fit LacZ data to a four-parameter logistic regression curve are given in Appendix 2. |
References
- Agradi, E., Vegeto, E., Sozzi, A., Fico, G., Regondi, S., Tome, F. Traditional healthy Mediterranean diet: estrogenic activity of plants used as food and flavoring agents. Phytother Res. 20 (8), 670-675 (2006).
- Morgan, H. E., Dillaway, D., Edwards, T. M. Estrogenicity of soybeans (Glycine max) varies by plant organ and developmental stage. Endocr Disruptors. 2 (1), (2014).
- Myers, S. L., Yang, C. Z., Bittner, G. D., Witt, K. L., Tice, R. R., Baird, D. D. Estrogenic and anti-estrogenic activity of off-the-shelf hair and skin care products. J Exp. Sci Environ Epidemiol. 25 (3), 271-277 (2015).
- Wagner, M., Oehlmann, J. Endocrine disruptors in bottled mineral water: estrogenic activity in the E-Screen. J Steroid Biochem Mol Biol. 127 (1-2), 128-135 (2011).
- Arnold, S. F., Robinson, M. K., Notides, A. C., Guillette, L. J. Jr, McLachlan, J. A. A yeast estrogen screen for examining the relative exposure of cells to natural and xenoestrogens. Environ Health Perspect. 104 (5), 544-548 (1996).
- Odum, J., et al. The rodent uterotrophic assay: critical protocol features, studies with nonyl phenols, and comparison with a yeast estrogenicity assay. Regul Toxicol Pharmacol. 25 (2), 176-188 (1997).
- Mellanen, P., et al. Wood-derived estrogens: studies in vitro with breast cancer cell lines and in vivo in trout. Toxicol Appl Pharmacol. 136 (2), 381-388 (1996).
- Bergman, A., Heindel, J. J., Jobling, S., Kidd, K. A., Zoeller, R. T. State of the science of endocrine disrupting chemicals – 2012. Inter-Organisation Programme for the Sound Management of Chemicals (IOMC). , Available from: http://www.who.int/ceh/publications/endocrine/en/ (2013).
- Balsiger, H. A., de la Torre, R., Lee, W. Y., Cox, M. B. A four-hour yeast bioassay for the direct measure of estrogenic activity in wastewater without sample extraction, concentration, or sterilization. Sci Total Environ. 408 (6), 1422-1429 (2010).
- Coldham, N. G., Dave, M., Sivapathasundaram, S., McDonnell, D. P., Connor, C., Sauer, M. J. Evaluation of a recombinant yeast cell estrogen screening assay. Environ Health Perspect. 105 (7), 734-742 (1997).
- De Boever, P., Demaré, W., Vanderperren, E., Cooreman, K., Bossier, P., Verstraete, W. Optimization of a yeast estrogen screen and its applicability to study the release of estrogenic isoflavones from a soygerm powder. Environ Health Perspect. 109 (7), 691-697 (2001).
- Fox, J. E., Burow, M. E., McLachlan, J. A., Miller, C. A. 3d Detecting ligands and dissecting nuclear receptor-signaling pathways using recombinant strains of the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nat Protoc. 3 (3), 637-645 (2008).
- Routledge, E. J., Sumpter, J. P. Estrogenic activity of surfactants and some of their degradation products assessed using a recombinant yeast screen. Environ Toxicol Chem. 15 (3), 241-248 (1996).
- Miller, C. A. 3d, Tan, X., Wilson, M., Bhattacharyya, S., Ludwig, S. Single plasmids expressing human steroid hormone receptors and a reporter gene for use in yeast signaling assays. Plasmid. 63 (2), 73-78 (2010).
- Delfosse, V., Grimaldi, M., Cavaillès, V., Balaguer, P., Bourguet, W. Structural and functional profiling of environmental ligands for estrogen receptors. Environ Health Perspect. 122 (12), 1306-1313 (2014).
- Environmental Working Group. Skin Deep Cosmetics Database. , Available from: http://www.ewg.org/skindeep (2016).
- Eustice, D. C., Feldman, P. A., Colberg-Poley, A. M., Buckery, R. M., Neubauer, R. H. A sensitive method for the detection of beta-galactosidase in transfected mammalian cells. Biotechniques. 11 (6), (1991).
- Buller, C., Zang, X. P., Howard, E. W., Pento, J. T. Measurement of beta-galactosidase tissue levels in a tumor cell xenograft model. Methods Find Exp Clin Pharmacol. 25 (9), 713-716 (2003).
- Pelisek, J., Armeanu, S., Nikol, S. Evaluation of beta-galactosidase activity in tissue in the presence of blood. J Vasc Res. 37 (6), 585-593 (2000).
- Gray, W. D. Studies on the alcohol tolerance of yeasts. J Bacteriol. 42 (5), 561-574 (1941).
- Schug, T. T., et al. Designing endocrine disruption out of the next generation of chemicals. Green Chem. 15 (1), 181-198 (2013).
