Denne artikel præsenterer en optimeret gær østrogen skærmen for kvantificering ligander i personlig plejeprodukter (PCPs) der binder østrogen receptorer alpha (ERα) og/eller beta (ERβ). Metoden indeholder to kolorimetriske substrat muligheder, en seks-dages nedkølet inkubation til brug i undergraduate kurser og statistiske værktøjer til dataanalyse.
Gær østrogen skærm (ja) bruges til at påvise østrogene ligander i miljøprøver og er blevet bredt anvendt i undersøgelser af endokrine desintegratorer. Østrogene ligander omfatter både naturlige og menneskeskabte “miljømæssige østrogen” (EBS) findes i mange forbrugsvarer herunder produkter til personlig pleje (PCPs), plastik, pesticider og fødevarer. Ebs forstyrre hormon signalering i mennesker og andre dyr, potentielt reducere frugtbarhed og øget risiko for sygdom. Trods vigtigheden af EBS og andre hormonforstyrrende forstyrre kemikalier (EDC) for den offentlige sundhed, er hormonforstyrrelser ikke typisk inkluderet i undergraduate læseplaner. Denne mangel er dels på grund af en mangel på relevante laboratorieaktiviteter, der illustrerer principperne involveret samtidig også være tilgængeligt for studerende. Denne artikel præsenterer en optimeret Ja for kvantificering ligander i produkter til personlig pleje, der binder østrogen receptorer alpha (ERα) og/eller beta (ERβ). Metoden indeholder en af de to kolorimetriske substrater (ortho– nitrophenylfosfat-β-D-galactopyranoside (ONPG) eller chlorphenol rød-β-D-galactopyranoside (CPRG)) som er kløvet af β-galactosidase, en 6-dages nedkølet inkubation trin til lette brugen i undergraduate laboratorium kurser, en automatiseret program for LacZ beregninger og R kode for den tilknyttede 4-parameter logistic regressionsanalyse. Protokollen er udviklet til at tillade studerende at udvikle og gennemføre eksperimenter hvor de skærmen produkter af deres valg til østrogen efterligner. I processen lærer de om endokrine desintegratorer, cellekultur, receptor binding, enzymaktivitet, genteknologi, statistik og eksperimenterende design. Samtidig, de også øve grundlæggende og bredt anvendelige laboratorium færdigheder, såsom: beregning af koncentrationer; at lave løsninger; demonstrere steril teknik; seriel fortynding standarder; konstruere og interpolering standard kurver; identificering af variabler og kontrol; indsamle, organisere og analysere data; opbygge og fortolke grafer; og ved hjælp af fælles laboratorieudstyr såsom micropipettors og spektrofotometre. Således tilskynder gennemfører dette assay eleverne til at deltage i undersøgelse-baseret læring mens udforske nye problemstillinger på miljø og sundhed.
Gær østrogen skærm (ja) er almindeligt anvendt til at kvantificere ligander, der efterligner estradiol (E2 eller 17β-estradiol) i en række forskellige matricer, herunder vand, plantevæv, forbrugerprodukter og fødevarer1,2,3, 4. Kollektivt, benævnes disse ligander “Miljømæssige østrogen (EBS).” Ja blev oprindeligt udviklet som en lav pris, in vitro- alternativ til i vivo test som den gnaver uterotrophic assay5,6 og regnbueørred fodring assay7. Formålet med disse test er at afgøre, om et produkt indeholder kemikalier, der stimulerer eller blokere østrogen-afhængige mekanismer. Påvisning af EBS er kritisk, fordi de kan forstyrre normale endogene østrogen signalering, især i løbet af fostrets udvikling. Denne indblanding kompromiser sundhed ved at øge risikoen for fedme, infertilitet, kræft og kognitive tab8.
Trods vigtigheden af EBS og andre EDC for folkesundheden, er hormonforstyrrelser ikke almindeligt inkluderet i undergraduate læseplaner. Denne mangel er dels på grund af mangel på aktiviteter, der illustrerer principperne involveret samtidig også være tilgængeligt for studerende. Derudover flere variationer af ja-protokollen findes9,10,11,12,13, og denne mangfoldighed gør assay optimering tidskrævende for laboratoriet koordinatorer ikke specifikt uddannet i de relevante teknikker. Endelig, ja assays er normalt afsluttet mere end 1 lang dag eller 2 dage i træk med en O/N inkubation. Denne timing er ikke kompatibel med formatet for undergraduate laboratorium kurser, som typisk mødes én gang / uge i flere timer.
Svar på disse behov rapporter dette manuskript en optimeret 96-nå ja protokol, der omfatter ethanoliske udvindingsmetoder for produkter til personlig pleje (PCPs)3 og en 6-dages køle skridt til at rumme ugentlige laboratorium møder. Absolut ethanol er en alsidig organisk opløsningsmiddel, der kan opløse en lang række polære og upolære opløste stoffer. Derudover er det egnet til bachelor kurser, fordi det er let tilgængelige, relativt ugiftige, overkommelig, og blandbar med vand; det fordamper også nemt uden specialudstyr. Men ethanol er ikke ideelt til at udtrække kraftigt hydrofobe hormonforstyrrende stoffer eller mange olier og voks, de to sidstnævnte er almindelige ingredienser i PCPs. fattige ekstraktionseffektivitet øger risikoen for falsk negative resultater. Med denne begrænsning i tankerne, bør efterforskere vælge ekstraktion procedurer (fx, ethanoliske udvinding eller faste fase udvinding) at adresse prøve karakteristika og opfylde undersøgelse mål (forskning versus bachelor instruktion).
Ja er afhængig af rekombinant Saccharomyces cerevisiae oprindeligt lavet af Dr. Charles Miller ved Tulane University. Se venligst Miller et al. (2010) for et komplet kort over manipuleret plasmid14. Gær omdannet med disse plasmider constitutively express menneskelige nukleare ERα eller ERβ (også kaldet ESR1 og ESR2, henholdsvis) når der dyrkes i medier indeholdende galactose (for ERα) eller enten glucose eller galactose (for ERβ). Hvis østrogene kemikalier findes i medierne, binder de til receptorer, oprettelse af ligand-receptor komplekser, der aktiverer β-galactosidase (lacZ) udtryk på et niveau, der er proportional med koncentrationen af østrogene kemikalier. Gærceller er så mængden for at frigive den akkumulerede β-galactosidase. Lysisbuffer indeholder enten ONPG eller CPRG, som er kløvet af β-galactosidase at give gule eller røde produkter, henholdsvis. Kolorimetrisk produkter kan kvantificeres ved måling af absorbans ved hjælp af en microwell plade Spektrofotometer. Graden af farveskift er proportional med koncentrationen af østrogene ligander, gæren blev udsat.
Valget af substrat (CPRG eller ONPG) afhænger af potentialet for baggrundsabsorbansen som følge af de prøver, der testes. For eksempel planteekstrakter ofte vil tilføje en gul nuance til medierne, der kunstigt oppustet estrogenicity foranstaltninger, hvis ONPG (kvantificeres ved 405 nm) er brugt som substrat for β-galactosidase. Med plante ekstrakter, CPRG (kvantificeres på 574 nm) kan være et mere passende kolorimetriske substrat. CPRG er dyrere end ONPG men bruges på en tiendedel af molariteten. Denne artikel præsenterer estrogenicities af PCP ekstrakter kvantificeres ved hjælp af både ONPG og CPRG.
Kvantificere estrogenicity af miljøprøver ved hjælp af både ERα og ERβ er en mere omfattende tilgang end ved hjælp af kun én af disse receptorer. I dyr udstille disse receptorer differential væv distribution, reguleringsvirksomhed og bindende tilhørsforhold til østrogene og anti-østrogene ligander15. For eksempel, bind plante-baserede fytoøstrogener typisk ERβ mere kraftigt2, mens syntetiske kemikalier kan vise præference for enten ERα eller ERβ eller kan binde begge receptorer lige så godt15. Derfor forudsige binding til en østrogen receptor ikke nødvendigvis binding til den anden.
Selv om EBS er fundet i mange forbrugerprodukter (f.eks.pesticider, vaskemidler, klæbemidler, smøremidler, plast, fødevarer og lægemidler) samt planter, de præsenterede data blev indhentet ved hjælp af et udvalg af PCPs. PCPs er overbevisende, let tilgængelige budget-venlige og miljømæssigt relevante for studerende. Eleverne kan opfordres til at bringe deres foretrukne PCPs fra hjem til test i laboratoriet. De kan også søge i huden dyb databasen udviklet af Environmental Working Group16 for at generere hypotese-drevet sammenligninger af PCPs med høj og lav toksicitet scores. På denne måde, kan studerende samtidig udvikle avancerede laboratorium færdigheder; engagere sig i selvstyret, undersøgelse baseret læring; og udforske nye problemstillinger på miljø og sundhed.
Ja er en billig metode til at registrere østrogene ligander i miljøprøver, såsom vand, mad, plantevæv eller produkter til personlig pleje. Data præsenteres her Sammenlign 2 østrogenreceptorer (ERα og ERβ), 2 substrater (ONPG og CPRG) og 2 tidslinjer (2 d-uden køling) og syv-dages protokollen med køleanlæg til måling af estrogenicity i personlig plejeprodukter via ja assay. 7 d, nedkølet protokollen ved hjælp af CPRG og gær udtryk for ERα og/eller ERβ bedste kvantificerer EEQs mens også er kompatibel med tidsbegrænsninger pålagt af bachelorstuderende laboratorium kurser, som mødes én gang / uge i flere timer. Faktisk var i forhold til 2 d assayet uden køling, syv-dages nedkølet analysen forbundet med reduceret variansen på tværs af plade replikater. Den lineære del af standardkurven var derudover lidt udvidet for data indsamlet ved hjælp af den kølede assay. Den lineære del af standardkurven definerer assay registreringsområde og er den eneste del af standardkurven, der kan bruges til at interpolere prøve EEQs.
I alle, men en af de testede prøver var EEQs målt ved hjælp af CPRG lavere end de tal med ONPG. Med en højere extinction koefficient og lavere Km og Vmaxer CPRG ti gange mere følsom end ONPG17. Således CPRG kan anvendes ved lavere koncentrationer og kan bruges til at registrere lavere mængder af β-galactosidase. Af disse grunde er CPRG generelt foretrækkes over ONPG18,19. Større substrat følsomhed forklarer imidlertid ikke de lavere EEQ værdier fundet med CPRG. De højere EEQ værdier fundet med ONPG kan skyldes matrix interferens med analysen, som bemærket af andre forfattere2,18. Gule pigmenter fra personlig pleje produkt ekstrakter kunne puste EEQ værdier fundet med ONPG. Andre har omgået dette problem ved at inkludere pigment kontrol i deres eksperimentelle design2, en tilgang, der fordobler antallet af plader i et eksperiment. Når matrix forstyrrelser kan være problematisk, kan CPRG være at foretrække substrat for ja assay, selvom det er dyrere og kræver længere inkuberingstider end ONPG. Derudover er farveændringen induceret af kløvningen af substrat af β-galactosidase mere dramatisk med CPRG, hvilket gør det lettere for studerende at visualisere resultater.
Miller et al. (2010), der manipuleret gæren bruges i denne protokol, bemærkes, at gær at udtrykke ERβ var 30 x mere følsomme over for 17β-østradiol end gær udtryk for ERα, en konstatering, underbygget af vores data14. Bortset fra potentielle nuancerne i plasmid konstruktion, Miller et al. (2010) kunne ikke forklare denne forskel i følsomhed14. En forskel mellem de to plasmid konstruktioner er at ERα udtryk er reguleret af galaktose, hvorimod ERβ udtryk er reguleret af enten glucose eller galactose. Gæren bruges i ja assay er kulturperler i glucose medier og kun givet galaktose, når de er fortyndet i starten af analysen. Derfor, gær at udtrykke ERβ kan akkumulere højere kopi numre af receptorproteiner forud for starten af analysen, hvilket giver højere følsomhed over for østrogene ligander.
Den lavere følsomhed af ERα-udtrykker gær kan forklare de højere priser for ikke-påvisning af estrogenicity i prøverne målt med ERα sammenlignet med ERβ. For at øge sandsynligheden for vil at prøve EEQs blive opdaget, brugernes kunne ansætte forskellige ekstraktionsmidler og metoder eller tilføje større mængder af prøven til gæren. Hvis højere prøve diskenheder bruges, bør koncentrationen af E2 standarder justeres således, at den samme mængde af standarder og prøver kan bruges i analysen. En begrænsning af tilføjer flere prøve er, at gæren kan tåle kun 6-10% ethanol, med bedre tolerance ved inkubation temperaturer på 30 vs 35 ° C20. For at kontrollere for virkningerne af ethanol på gær, bør efterforskere tilføje tredobbelt “gær kun” brønde til plade layout og bekræfte, at OD610 af disse “gær kun” wells er sammenlignelig med OD610 af køretøjet kontrolhullerne straks efter tilsætning af LacZ buffer. Alternativt, prøver opløst i ethanol kan føjes til tørre microwell plader og ethanol fordampet ud før gær er tilføjet. Dimethylsulfoxide (DMSO) er også brugt som prøve opløsningsmiddel i ja-undersøgelser, men den endelige arbejde koncentration af DMSO med gær bør begrænses til 1%12.
Ja assay er en kraftfuld screeningsværktøj til påvisning af estrogenicity i miljøprøver. Specifikt, registrerer ja ligander, der binder nukleare østrogen-receptorer, der interagerer med østrogen svar elementer til direkte gene expression14. Ja har imidlertid også vigtige begrænsninger. Ja registrerer ikke EBS, der arbejder gennem ikke-nukleare mekanismer såsom membran østrogenreceptorer eller mekanismer, der indebærer yderligere elementer som aktivator Protein 1 (AP-1) transkriptionsfaktorer. Desuden, fordi gær ikke har de samme metaboliske kapacitet som pattedyrceller, ja ikke kan registrere ligander, der kræver metabolisk aktivering skal østrogene.
Derudover kan ja assay let skelne mellem østrogene og anti-østrogene ligander i komplekse prøver. I stedet, det måler net estrogenicity, som er den samlede effekt af østrogene og anti-østrogene ligander. For at kvantificere koncentrationen af ER antagonister eller evaluere de hæmmende aktivitet af blandinger, kan analysen ændres ved at inkubere gær med både den standard agonist (17β-estradiol) og en række test stikprøven koncentrationer12. Denne proces bestemmer hvis antagonister i prøverne kan mindske agonist-induceret reporter aktivitet og giver en nyttig skærmen for at identificere tilstedeværelsen af ER antagonister i prøver.
Protokollen præsenteres her kan rumme en række forskellige typer prøve, selvom nogle prøver kan kræve ændringer i forberedelsestrin udvinding og prøve. For eksempel, EEQs varierede meget blandt replikater af nogle produkter til personlig pleje. De mere variable prøver en tendens til at indeholde olie dråber eller ellers var ikke helt homogen, der angiver, at en mere lipofile opløsningsmiddel som diethylether ville være nyttigt. Alternativt, olier og voks i produkter til personlig pleje kan udelukkes ved at udtrække prøver med 50% ethanol i stedet for 100% ethanol.En 50% ethanol udvinding vil også fange mere vandopløselige østrogene ligander (fx, nogle pigmenter). Men 50% ethanol fordamper langsommere end 100% ethanol og dermed kan forlænge udvindingen tid. Derudover var nogle prøver (såsom sæber) cytotoksiske til gær, hvilket resulterer i reducerede celle tæthed målinger (OD610). Fox et al. (2008) tyder på, at prøverne fortyndes og testes igen hvis celle tæthed forskelle overstiger 30% i forhold til koeretoejets styring wells12.
Hvis ja analysen bruges til analytiske forskning, kan fortynding kurver af prøven puljer testes Bestem preemptively passende mængde ekstrakt tilføjes til gær i trin 4.5. Alternativt, ekstrakter kan testes samtidigt på flere diskenheder (f.eks.5 µL og 20 µL ekstrakt tilsættes gær i trin 4,5) eller fortyndinger, der spænder over størrelsesordener (f.eks.0,2 µL, 2 µL og 20 µL). “Passende” bind af ekstrakt er dem, der identificerer estrogenicity af tilsvarende LacZ værdier langs den lineære del af standardkurven. Optimering forhindrer problemer forårsaget ved at tilføje for meget eller for lidt prøve gær, som cytotoksicitet, falske negativer eller estrogenicity, der overstiger standardkurven. Som nævnt ovenfor, bør mængder af prøver og E2 standarder justeres, når forskellige mængder af ligand bruges sådan, at gær er udsat for en konsekvent mængde og koncentration af ethanol eller andre køretøjer i hele pladen.
Trods potentialet for falske negativer, er ja assay blevet identificeret som en Tier 3 test værktøj for hormonforstyrrende stoffer af Schug et al. (2013), der har udviklet en omfattende differentieret protokol for endokrine forstyrrelser (TiPED)21. For uddannelsen af de studerende er analysen værdifulde til undervisning i begreber i relation til hormonforstyrrelser, cellekultur, receptor binding, enzymaktivitet, genteknologi, statistik og eksperimenterende design. Studerende, der bruger analysen også øve grundlæggende og bredt anvendelige laboratorium færdigheder såsom seriel fortynding standarder; uddrager prøver; at lave løsninger; konstruere og interpolering standard kurver; beregning af koncentrationer; at lave løsninger; demonstrere steril teknik; dyrkning af celler; identificering af variabler og kontrol; indsamle, organisere og analysere data; opbygge og fortolke grafer; og ved hjælp af fælles laboratorieudstyr såsom micropipettors og spektrofotometre.
The authors have nothing to disclose.
Dette projekt blev finansieret af start-up finansiering til TME og AMR fra Louisiana Tech University og Furman University, henholdsvis. Yderligere støtte blev leveret af 2015 Fakultet avancement tilskud til AMR og TME fra The forbundet gymnasier i syd, Louisiana EPSCoR Pfund tilskud til TME fra National Science Foundation og Louisiana Board of Regents og en travel award til TME fra den Universitet i syd. Vi takker Dr. David Eubanks (Furman) for assistance med statistiske analyser og Mr. Christopher Moore “giver os en hånd” under optagelserne.
Equipment | |||
Vortex Mixer (for single or multiple tubes) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 02-215-365 | Any mixer will suffice. |
Bucket centrifuge | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 75-063-839 | Any bucket centrifuge will suffice if it is capable of centrifuging conical tubes at 4000 rpm. |
Bunsen burner | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 17-012-823 | Any Bunsen burner will suffice, or an alcohol burner (Fisher Scientific 04-245-1) can be used instead. |
Incubator | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 50125590H | Any incubator will suffice if it is capable of maintaining 30 °C. |
Microplate reader | BioTek (www.biotek.com) | EPOCH2 | A different brand of plate reader will suffice if it can measure absorbance at wavelengths of 405, 574, and 610 nm. |
Gen5 microplate reader and imager software | BioTek (www.biotek.com) | GEN5 | Software required depends on make and model of plate reader; GEN5 software is intended for use with BioTek plate reader. |
Refrigerator | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 05LREEFSA | Any refrigerator will suffice if it is capable of maintaining 4 °C. |
Pipettor or PipetAid compatible with 1-10 ml serological pipets | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 13-681-15E | Any pipettors will suffice if they are compatible with 1- and 10-ml serological pipets. |
P10 micropipettor | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | F144562G | Any micropipettor will suffice if it is capable of dispensing 5 µl. |
P200 micropipettor | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | F144565G | Any micropipettor will suffice if it is capable of dispensing up to 200 µl. |
P300 multichannel pipettor | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | FBE1200300 | Any multichannel pipettor will suffice if it is capable of dispensing 50 to 205 µl. |
Repeating pipettor | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | F164001G | Must be able to deliver 100-320 µl; this pipettor is optional because a multichannel pipettor can be used instead. |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Supplies | |||
Sterile 15-ml conical tubes with caps | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 05-539-801 | |
Glass scintillation vials | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 03-337-4 | |
Polystyrene 96-well, flat-bottom microplates with lid (non-sterile) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 12565501 | |
Polypropylene 96-well, flat-bottom microplates without lid | Cole-Parmer (www.coleparmer.com) | EW-01728-81 | |
100 ml glass beakers | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 02-539H | Any glass beakers will suffice if they are autoclavable. |
250 ml glass Erlenmeyer flasks | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | FB500250 | Any glass Erlenmeyer flasks will suffice if they are autoclavable. |
Sterile, adhesive, porous film | VWR (www.vwr.com) | 60941-086 | |
Metal forceps | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 12-000-157 | Any metal forceps will suffice. |
Reagent reservoir | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 07-200-127 | |
Filtration units (0.2 µm) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 09-761-52 | |
Squirt bottle (for ethanol) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 02-897-10 | Any laboratory squirt bottles will suffice. |
Autoclavable storage bottles | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 06-414-1D | Any autoclavable glass storage bottles will suffice. |
10 ml glass serological pipets (sterile) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 13-678-27F | Any glass serological pipets will suffice. |
1 ml glass serological pipets (sterile) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 13-678-27C | Any glass serological pipets will suffice. |
P10 micropipettor tips | USA Scientific (www.usascientific.com) | 1120-3810 | Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above. |
P200 micropipettor tips | USA Scientific (www.usascientific.com) | 1120-8810 | Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above. |
P300 micropipettor tips | USA Scientific (www.usascientific.com) | 1120-9810 | Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above. |
Syringe tips for repeating pipettor | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | F164150G | Only required if a repeating pipettor is used. |
Sterile petri dishes | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | FB0875712 | Any sterile petri dishes will suffice. |
Parafilm | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | S37440 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Yeast | |||
Saccharomyces cerevisiae strains that lack the TRP1 gene product (e.g. W303a) | American Type Culture Company (ATCC) (www.ATCC.org) | MYA-151 | Recombinant yeast are also available upon request from the authors. |
Receptor/reporter plasmid for ERα | Addgene (www.addgene.org) | pRR-ERalpha-5Z (Plasmid #23061) | |
Receptor/reporter plasmid for ERβ | Addgene (www.addgene.org) | pRR-ERbeta-5Z (Plasmid #23062) | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chemicals | |||
Difco agar | BD (www.bd.com) | 214530 | |
Dithiothreitol | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | D0632 | CAUTION: Dithiothreitol is an acute skin and eye irritant. Use appropriate personal protection equipment (gloves, fume hood, dust mask) to avoid skin and eye contact, inhalation and ingestion. |
Ortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | N1127 | |
Chlorophenol red-β-D-galactopyranoside | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | 10884308001 | |
Yeast nitrogen base | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | Y0626 | |
Glucose | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | G8270 | |
Galactose | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | G5388 | |
Adenine sulfate | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | A9126 | |
Uracil | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | U0750 | |
Leucine | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | L8000 | |
Histidine | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | H8000 | |
17 β-Estradiol | Sigma (www.sigmaaldrich.com) MP Biomedicals | E8875-250 mg 0219456401 – 1 mg | CAUTION: Estradiol is a suspected carcinogen and reproductive toxicant. It is harmful if inhaled, swallowed, or absorbed through skin. Estradiol may cause harm to breast-fed children and fetuses. Estradiol is very toxic to aquatic life. Use appropriate personal protection (gloves, fume hood, dust mask) and avoid exposure during pregnancy and lactation. Estradiol should be disposed of as hazardous waste and not released to the environment. |
100% ethanol | Pharmco-Aaper (www.pharmcoaaper.com) | 111000200 | |
Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | S9638 | |
Sodium phosphate dibasic (anhydrous) | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | S0876 | |
Magnesium chloride | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | M8266 | |
Potassium chloride | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | P9333 | |
Sarkosyl (N-lauroylsarcosine sodium salt) | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | L5125 | |
Sodium carbonate | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | S7795 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
Excel spreadsheet software | Microsoft | Excel is convenient spreadsheet software for managing data outputs and generating .csv files for R analysis. | |
Java software (required for Appendix 1 application) | Oracle Corporation | To calculate LacZ values using the application in Appendix 1, first download free Java software (https://www.java.com/en/download/), then open the LacZ application in Appendix 1. LacZ results created by the application can be copied by pressing "control (ctrl) + c" on PC keyboards, or "command + c" on Mac keyboards. | |
JMP statistical software version 13.0.0 | SAS Institute | Appendix 2 includes directions on using JMP to fit LacZ data to a four-parameter logistic regression curve. The curve is used to interpolate test sample estradiol equivalents (EEQs), relative to the estradiol standard curve. | |
R statistical computing and graphics software | R Foundation | Free R software can be downloaded from https://www.r-project.org/. Directions and code for using R to fit LacZ data to a four-parameter logistic regression curve are given in Appendix 2. |