यह लेख व्यक्तिगत देखभाल उत्पादों (PCPs) कि बांध एस्ट्रोजन रिसेप्टर्स अल्फा (ERα) और/या बीटा (ERβ) में लाइगैंडों को बढ़ाता है के लिए एक अनुकूलित खमीर एस्ट्रोजन स्क्रीन प्रस्तुत करता है । विधि दो वर्णमिति सब्सट्रेट विकल्प शामिल हैं, स्नातक पाठ्यक्रमों में उपयोग के लिए एक छह दिन प्रशीतित मशीन, और डेटा विश्लेषण के लिए सांख्यिकीय उपकरण ।
खमीर एस्ट्रोजन स्क्रीन (हां) पर्यावरण के नमूनों में एस्ट्रोजन लाइगैंडों का पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है और मोटे तौर पर अंत में स्रावी व्यवधान के अध्ययन में लागू किया गया है । एस्ट्रोजन लाइगैंडों दोनों प्राकृतिक और मानव निर्मित “पर्यावरणीय एस्ट्रोजन” (ईज) पर्सनल केयर उत्पाद (PCPs), प्लास्टिक, कीटनाशकों, और खाद्य पदार्थों सहित कई उपभोक्ता वस्तुओं में पाया शामिल हैं । मानव और अन्य जानवरों में ईज बाधित हार्मोन संकेत, संभावित प्रजनन क्षमता को कम करने और रोग जोखिम में वृद्धि. सार्वजनिक स्वास्थ्य के लिए ईज और अन्य अंत में खलल डालने वाले रसायनों (EDCs) के महत्व के बावजूद, अंत में स्रावी व्यवधान आमतौर पर स्नातक पाठ्यक्रम में शामिल नहीं है । यह कमिया आंशिक रूप से प्रासंगिक प्रयोगशाला गतिविधियों की कमी के कारण है जो शामिल सिद्धांतों का वर्णन करते हुए भी स्नातक छात्रों के लिए सुलभ है । यह लेख एक अनुकूलित हां व्यक्तिगत देखभाल उत्पादों कि बाइंड एस्ट्रोजन रिसेप्टर्स अल्फा (ERα) और/या बीटा (ERβ) में लाइगैंडों को बढ़ाता है के लिए प्रस्तुत करता है । विधि दो वर्णमिति सब्सट्रेट (ऑर्थो-nitrophenyl-β-d-galactopyranoside (ONPG) या chlorophenol लाल-β-d-galactopyranoside (CPRG)) है कि β-galactosidase, एक 6 दिन प्रशीतित गर्मी कदम से सट रहे हैं में से एक को शामिल स्नातक प्रयोगशाला पाठ्यक्रमों में उपयोग की सुविधा, LacZ गणना के लिए एक स्वचालित अनुप्रयोग, और संबद्ध 4-पैरामीटर उपस्कर प्रतिगमन विश्लेषण के लिए R कोड. प्रोटोकॉल के लिए स्नातक छात्रों को विकसित करने और प्रयोग जिसमें वे एस्ट्रोजन के लिए अपने को चुनने के उत्पादों के स्क्रीन नकल की अनुमति के लिए डिजाइन किया गया है । इस प्रक्रिया में, वे अंत में स्रावी व्यवधान, कोशिका संस्कृति, रिसेप्टर बाइंडिंग, एंजाइम गतिविधि, आनुवंशिक इंजीनियरिंग, सांख्यिकी, और प्रयोगात्मक डिजाइन के बारे में सीखते हैं । इसके साथ ही, वे मौलिक और मोटे तौर पर लागू प्रयोगशाला कौशल का अभ्यास करते हैं, जैसे: सांद्रता की गणना; समाधान बनाना; बाँझ तकनीक का प्रदर्शन; प्रश्नपत्र कमजोर मानक; निर्माण और interpolating मानक घटता; चर और नियंत्रण की पहचान; डेटा एकत्रित करना, व्यवस्थित करना और उसका विश्लेषण करना; निर्माण और रेखांकन की व्याख्या; और micropipettors और spectrophotometers के रूप में आम प्रयोगशाला उपकरणों का उपयोग । इस प्रकार, इस परख को लागू करने के छात्रों को जांच में संलग्न करने के लिए प्रोत्साहित करते हुए पर्यावरण विज्ञान और स्वास्थ्य में उभरते मुद्दों की खोज आधारित है ।
खमीर एस्ट्रोजन स्क्रीन (हां) व्यापक रूप से लाइगैंडों है कि एस्ट्राडियोल (E2 या 17β-एस्ट्राडियोल) मैट्रिक्स की एक किस्म में पानी, संयंत्र के ऊतकों, उपभोक्ता उत्पादों, और खाद्य पदार्थ1,2,3शामिल है, की नकल करने के लिए प्रयोग किया जाता है, 4. सामूहिक रूप से, ऐसे लाइगैंडों “पर्यावरणीय एस्ट्रोजन (ईज)” हैं । हां मूल रूप से एक कम लागत के रूप में विकसित किया गया था, इन विट्रो वैकल्पिक vivo परीक्षणों में कुतर uterotrophic परख5,6 और इंद्रधनुष ट्राउट खिला परख7की तरह । इन परीक्षणों का उद्देश्य यदि एक उत्पाद रसायनों कि उत्तेजित या एस्ट्रोजन पर निर्भर तंत्र ब्लॉक शामिल है निर्धारित करने के लिए है । ईज का पता लगाना महत्वपूर्ण है, क्योंकि वे सामांय अंतर्जात एस्ट्रोजन संकेतन, विशेष रूप से भ्रूण के विकास के दौरान हस्तक्षेप कर सकते हैं । यह हस्तक्षेप मोटापा, बांझपन, कैंसर के जोखिम को बढ़ाने के द्वारा स्वास्थ्य समझौता, और संज्ञानात्मक हानि8।
सार्वजनिक स्वास्थ्य के लिए ईज और अन्य EDCs के महत्व के बावजूद, अंत में स्रावी व्यवधान आमतौर पर स्नातक पाठ्यक्रम में शामिल नहीं है । यह कमी आंशिक रूप से गतिविधियों की कमी के कारण है कि शामिल सिद्धांतों का वर्णन करते हुए भी स्नातक छात्रों के लिए सुलभ जा रहा है । इसके अतिरिक्त, हां प्रोटोकॉल के कई रूपांतरों मौजूद9,10,11,12,13, और इस विविधता परख अनुकूलन समय के लिए लेने वाली बनाता है प्रयोगशाला समन्वयकों विशेष रूप से प्रासंगिक तकनीकों में प्रशिक्षित नहीं. अंत में, हां, परख आमतौर पर पूरा कर रहे है 1 लंबे दिन या 2 लगातार दिन एक O/ इस समय स्नातक प्रयोगशाला पाठ्यक्रम है, जो आम तौर पर एक बार मिलने के प्रारूप के साथ संगत नहीं है/
इन जरूरतों के जवाब में, इस पांडुलिपि एक अनुकूलित ९६-अच्छी तरह से हां प्रोटोकॉल है कि व्यक्तिगत देखभाल उत्पादों (PCPs) के लिए इथेनॉल निष्कर्षण तरीके शामिल है3 और एक 6 दिन प्रशीतन कदम साप्ताहिक प्रयोगशाला बैठकों को समायोजित करने के लिए रिपोर्ट । निरपेक्ष इथेनॉल एक बहुमुखी कार्बनिक विलायक कि ध्रुवीय और ध्रुवीय solutes की एक किस्म को भंग कर सकते है । इसके अलावा, यह स्नातक पाठ्यक्रमों के लिए उपयुक्त है, क्योंकि यह आसानी से उपलब्ध है, अपेक्षाकृत विषाक्त, सस्ती, और पानी के साथ मिश्रणीय; यह भी विशेष उपकरणों के बिना आसानी से वाष्पीकरण । हालांकि, इथेनॉल दृढ़ता से hydrophobic अंत-स्रावी अवरोधकों या कई तेलों और waxes, बाद दो PCPs में आम सामग्री जा रहा है निकालने के लिए आदर्श नहीं है । गरीब निष्कर्षण दक्षता झूठी नकारात्मक निष्कर्षों का खतरा बढ़ जाता है । मन में इस बाधा के साथ, जांचकर्ताओं निष्कर्षण प्रक्रियाओं का चयन करना चाहिए (उदा., इथेनॉल निष्कर्षण या ठोस चरण निष्कर्षण) कि पता नमूना विशेषताओं और अध्ययन के उद्देश्यों को पूरा (अनुसंधान बनाम स्नातक अनुदेश) ।
हां संयोजक पर निर्भर करता है Saccharomyces cerevisiae मूल रूप से Tulane विश्वविद्यालय में डॉ चार्ल्स मिलर के द्वारा बनाई गई । कृपया मिलर एट अल देखें । (२०१०) के लिए इंजीनियर प्लाज्मिड14का पूरा नक्शा । खमीर इन plasmids constitutively एक्सप्रेस मानव परमाणु ERα या ERβ (भी कहा जाता ESR1 और ESR2, क्रमशः) जब गैलेक्टोज (ERα के लिए) या तो ग्लूकोज या गैलेक्टोज (ERβ के लिए) युक्त मीडिया में हो के साथ तब्दील हो । यदि एस्ट्रोजन रसायन मीडिया में मौजूद हैं, वे रिसेप्टर्स को बांध, ligand रिसेप्टर कॉम्प्लेक्स कि सक्रिय β-galactosidase (lacZ) अभिव्यक्ति एक स्तर पर एस्ट्रोजन रसायनों की एकाग्रता के लिए आनुपातिक बनाने. खमीर कोशिकाओं तो जमा β-galactosidase जारी करने के लिए लीजड हैं । lysis बफ़र या तो ONPG या CPRG, जो β-galactosidase द्वारा पीले या लाल उत्पादों, क्रमशः उपज के लिए सट रहे हैं शामिल हैं । वर्णमिति उत्पादों एक microwell प्लेट spectrophotometer का उपयोग कर अवशोषक को मापने के द्वारा मात्रा जा सकता है । रंग बदलने की डिग्री एस्ट्रोजन लाइगैंडों जो खमीर उजागर किया गया था की एकाग्रता के लिए आनुपातिक है ।
सब्सट्रेट का चुनाव (CPRG या ONPG) परीक्षण किया जा रहा नमूनों से उत्पन्न होने वाली पृष्ठभूमि अवशोषण के लिए क्षमता पर निर्भर करता है. उदाहरण के लिए, संयंत्र निष्कर्षों अक्सर मीडिया है कि कृत्रिम रूप से estrogenicity उपायों अगर ONPG (४०५ एनएम पर मात्रा) में β-galactosidase के लिए सब्सट्रेट के रूप में प्रयोग किया जाता है फुलाने के लिए एक पीले रंग जोड़ देगा । संयंत्र निष्कर्षों के साथ, CPRG (५७४ एनएम पर मात्रा) एक अधिक उपयुक्त वर्णमिति सब्सट्रेट हो सकता है । CPRG ONPG से अधिक महंगा है, लेकिन एक दसवें molarity में प्रयोग किया जाता है । यह लेख PCP अर्क मात्रा दोनों ONPG और CPRG का उपयोग कर के estrogenicities प्रस्तुत करता है ।
ERα और ERβ दोनों का उपयोग कर पर्यावरण के नमूनों की estrogenicity बढ़ाता है इन रिसेप्टर्स में से केवल एक का उपयोग करने से एक अधिक व्यापक दृष्टिकोण है. पशुओं में, इन रिसेप्टर्स विभेदक ऊतक वितरण, विनियामक गतिविधियों, और एस्ट्रोजन और विरोधी एस्ट्रोजन लाइगैंडों के लिए बाध्यकारी समानताएं15प्रदर्शन. उदाहरण के लिए, संयंत्र आधारित phytoestrogens आमतौर पर ERβ अधिक दृढ़ता से बांध2, जबकि सिंथेटिक रसायनों या तो ERα या ERβ के लिए वरीयता दिखा सकते है या दोनों रिसेप्टर्स समान रूप से अच्छी तरह से15बांध कर सकते हैं । इसलिए, एक एस्ट्रोजन रिसेप्टर के लिए बाध्यकारी जरूरी दूसरे के लिए बाध्यकारी भविष्यवाणी नहीं करता है ।
हालांकि ईज कई उपभोक्ता उत्पादों में पाए जाते हैं (जैसे, कीटनाशक, डिटर्जेंट, चिपकने वाला, स्नेहक, प्लास्टिक, खाद्य पदार्थ, और फार्मास्यूटिकल्स) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पौधों, प्रस्तुत डेटा PCPs के एक चयन का उपयोग कर प्राप्त किया गया । PCPs मजबूर कर रहे हैं, आसानी से उपलब्ध है, बजट के अनुकूल है, और पर्यावरण के स्नातक छात्रों के लिए प्रासंगिक । छात्रों को प्रयोगशाला में परीक्षण के लिए अपने मनपसंद PCPs को घर से लाने के लिए आमंत्रित किया जा सकता है । वे भी त्वचा को गहरी पर्यावरण कार्य समूह द्वारा विकसित डेटाबेस खोज कर सकते है16 उच्च और निंन विषाक्तता स्कोर के साथ PCPs की परिकल्पना चालित तुलना उत्पंन करने के लिए । इस तरह, छात्रों को एक साथ उन्नत प्रयोगशाला कौशल विकसित कर सकते हैं; स्वयं निर्देशित, जांच आधारित सीखने में संलग्न; और पर्यावरण विज्ञान और स्वास्थ्य में उभरते मुद्दों का पता लगाने ।
हां, पानी, भोजन, संयंत्र के ऊतकों, या व्यक्तिगत देखभाल उत्पादों के रूप में पर्यावरण के नमूनों में एस्ट्रोजन लाइगैंडों का पता लगाने के लिए इस्तेमाल एक कम लागत विधि है । डेटा यहां प्रस्तुत 2 एस्ट्रोजन रिसेप्टर्स की तुलना (ERα और ERβ), 2 सब्सट्रेट (ONPG और CPRG), और 2 समय (प्रशीतन के साथ 2 डी प्रोटोकॉल और प्रशीतन के साथ सात दिन प्रोटोकॉल) के माध्यम से व्यक्तिगत देखभाल उत्पादों में estrogenicity को मापने के लिए हां परख । 7 डी, प्रशीतित CPRG और खमीर व्यक्त ERα और/या ERβ सर्वश्रेष्ठ quantifies EEQs का उपयोग कर प्रोटोकॉल जबकि भी समय की कमी के साथ संगत जा रहा है स्नातक प्रयोगशाला पाठ्यक्रम है कि केवल एक बार मिलने/ वास्तव में, प्रशीतन के बिना 2 डी परख की तुलना में, सात दिन प्रशीतित परख प्लेट की नकल भर में कम विचरण के साथ जुड़ा हुआ था । इसके अलावा, मानक वक्र के रैखिक हिस्सा थोड़ा प्रशीतित परख का उपयोग एकत्र डेटा के लिए विस्तारित किया गया था । मानक वक्र के रैखिक भाग परख पता लगाने रेंज परिभाषित करता है और मानक वक्र है कि नमूना EEQs लगाना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता का ही हिस्सा है ।
सभी लेकिन परीक्षण नमूनों में से एक में, EEQs CPRG का उपयोग कर मापा ONPG के साथ उन मात्रा से कम थे. एक उच्च विलुप्त होने गुणांक और कम कश्मीरएम और वीमैक्सके साथ, CPRG दस गुना अधिक ONPG17से अधिक संवेदनशील है । इस प्रकार, CPRG कम सांद्रता पर इस्तेमाल किया जा सकता है और β-galactosidase की कम मात्रा का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इन कारणों के लिए, CPRG आम तौर पर ONPG18,19से अधिक पसंद है । हालांकि, अधिक सब्सट्रेट संवेदनशीलता CPRG के साथ पाया कम EEQ मान समझा नहीं है । उच्च EEQ मूल्यों ONPG के साथ पता चला मैट्रिक्स परख के साथ हस्तक्षेप के कारण हो सकता है, के रूप में अंय लेखकों2,18द्वारा उल्लेख किया । व्यक्तिगत देखभाल उत्पाद निष्कर्षों से पीला pigments EEQ ONPG के साथ पाया मूल्यों बढ़ सकता है । दूसरों को अपने प्रयोगात्मक डिजाइन2, एक दृष्टिकोण है कि एक प्रयोग में प्लेटों की संख्या डबल्स में वर्णक नियंत्रण सहित द्वारा इस समस्या को दरकिनार कर दिया है । जब मैट्रिक्स हस्तक्षेप समस्याग्रस्त हो सकता है, CPRG हां परख के लिए एक बेहतर सब्सट्रेट हो सकता है, हालांकि यह अधिक महंगा है और ONPG की तुलना में अब मशीन समय की आवश्यकता है । इसके अलावा, β-galactosidase द्वारा सब्सट्रेट की दरार से प्रेरित रंग परिवर्तन CPRG के साथ और अधिक नाटकीय है, यह आसान परिणाम कल्पना करने के लिए छात्रों के लिए बना रही है ।
मिलर एट अल. (२०१०), जो इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल खमीर इंजीनियर, नोट किया है कि खमीर व्यक्त ERβ 30x अधिक 17β के प्रति संवेदनशील थे-खमीर ERα, एक खोज हमारे डेटा द्वारा पुष्टि की से एस्ट्राडियोल व्यक्त14। प्लाज्मिड निर्माण में संभावित बारीकियों के अलावा मिलर एट अल. (२०१०) संवेदनशीलता में इस अंतर को14नहीं समझा जा सका. दो प्लाज्मिड निर्माण के बीच एक अंतर यह है कि ERα अभिव्यक्ति गैलेक्टोज द्वारा विनियमित है, जबकि ERβ अभिव्यक्ति या तो ग्लूकोज या गैलेक्टोज द्वारा विनियमित है । हां परख में इस्तेमाल खमीर ग्लूकोज मीडिया में संस्कृति और केवल गैलेक्टोज दिया जाता है जब वे परख के शुरू में पतला कर रहे हैं । इसलिए, खमीर व्यक्त ERβ रिसेप्टर प्रोटीन के उच्च प्रति संख्या जमा कर सकते है परख के शुरू करने से पहले, जिससे एस्ट्रोजन लाइगैंडों के लिए उच्च संवेदनशीलता प्रदान ।
ERα-व्यक्त खमीर की कम संवेदनशीलता ERβ के साथ तुलना में ERα के साथ मापा नमूनों में गैर-estrogenicity का पता लगाने की उच्च दर की व्याख्या कर सकते हैं । संभावना है कि नमूना EEQs का पता लगाया जाएगा बढ़ाने के लिए, उपयोगकर्ताओं को अलग निष्कर्षण सॉल्वैंट्स और तरीकों को रोजगार या खमीर के लिए नमूना के उच्च मात्रा में जोड़ सकते हैं । यदि उच्च नमूना मात्रा का उपयोग किया जाता है, E2 मानकों की सांद्रता समायोजित किया जाना चाहिए ऐसी है कि मानकों और नमूनों की एक ही मात्रा परख में इस्तेमाल किया जा सकता है । अधिक नमूना जोड़ने की एक सीमा है कि खमीर केवल 6-10% इथेनॉल बर्दाश्त कर सकते हैं, 30 बनाम ३५ डिग्रीसेल्सियस20 की मशीन तापमान पर बेहतर सहिष्णुता के साथ । खमीर पर इथेनॉल के प्रभाव के लिए नियंत्रण करने के लिए, जांचकर्ताओं तपसिल “प्लेट लेआउट के लिए खमीर केवल कुओं” जोड़ना चाहिए और पुष्टि करते है कि इन “केवल खमीर” कुओं के आयुध डिपो ६१० वाहन नियंत्रण कुओं के आयुध डिपो के लिए तुरंत तुलनीय है LacZ बफ़र के अलावा के बाद । वैकल्पिक रूप से, इथेनॉल में भंग नमूनों सूखी microwell प्लेटों को जोड़ा जा सकता है और इथेनॉल से पहले काफूर खमीर जोड़ रहे हैं । Dimethylsulfoxide (DMSO) भी हां परख में एक नमूना विलायक के रूप में प्रयोग किया जाता है, लेकिन अंतिम खमीर के साथ DMSO के काम एकाग्रता 1%12तक सीमित किया जाना चाहिए ।
हां परख पर्यावरण के नमूनों में estrogenicity का पता लगाने के लिए एक शक्तिशाली स्क्रीनिंग उपकरण है । विशेष रूप से, हां लाइगैंडों का पता लगाता है कि परमाणु एस्ट्रोजन रिसेप्टर्स कि एस्ट्रोजन प्रतिक्रिया तत्वों के साथ बातचीत करने के लिए प्रत्यक्ष जीन अभिव्यक्ति14बाँध. हालांकि, हां भी महत्वपूर्ण सीमाएं हैं । हां पता नहीं ईज कि गैर परमाणु तंत्र के माध्यम से ऐसी झिल्ली एस्ट्रोजन रिसेप्टर्स या तंत्र है कि उत्प्रेरक प्रोटीन 1 (एपी-1) प्रतिलेखन कारकों के रूप में अतिरिक्त तत्वों को शामिल के रूप में काम करते हैं । इसके अलावा, क्योंकि खमीर स्तनधारी कोशिकाओं के रूप में एक ही चयापचय क्षमता नहीं है, हां लाइगैंडों कि चयापचय सक्रियण के लिए एस्ट्रोजन की आवश्यकता का पता लगाने नहीं कर सकते ।
इसके अलावा, हां परख आसानी से एस्ट्रोजन और विरोधी के बीच अंतर जटिल नमूनों में एस्ट्रोजन लाइगैंडों नहीं कर सकते । इसके बजाय, यह शुद्ध estrogenicity उपाय है, जो एस्ट्रोजन और विरोधी एस्ट्रोजन लाइगैंडों का योग प्रभाव है । एर विरोधी की एकाग्रता मात्रा या मिश्रण के निरोधात्मक गतिविधि का मूल्यांकन करने के लिए, परख दोनों मानक एगोनिस्ट (17β-एस्ट्राडियोल) और परीक्षण नमूना सांद्रता की एक श्रेणी के साथ खमीर गर्मी द्वारा संशोधित किया जा सकता है12। नमूनों में विरोधी एगोनिस्ट-प्रेरित रिपोर्टर गतिविधि कम कर सकते हैं और नमूनों में ईआर विरोधी की उपस्थिति की पहचान के लिए एक उपयोगी स्क्रीन प्रदान करता है, तो यह प्रक्रिया निर्धारित करता है ।
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल नमूना प्रकार की एक किस्म को समायोजित कर सकते हैं, हालांकि कुछ नमूनों निष्कर्षण और नमूना तैयारी चरणों में संशोधनों की आवश्यकता हो सकती है । उदाहरण के लिए, EEQs कुछ व्यक्तिगत देखभाल उत्पादों की प्रतिकृति के बीच व्यापक रूप से विविध । अधिक चर नमूने तेल बूंदों को शामिल करने के लिए या अंयथा पूरी तरह से सजातीय नहीं थे, यह दर्शाता है कि एक और अधिक lipophilic विलायक जैसे diethyl ईथर के रूप में उपयोगी होगा । वैकल्पिक रूप से, तेल और व्यक्तिगत देखभाल उत्पादों में मोम के बजाय १००% इथेनॉल के ५०% इथेनॉल के साथ नमूने निकालने से बाहर रखा जा सकता है ।एक ५०% इथेनॉल निष्कर्षण भी अधिक पानी में घुलनशील एस्ट्रोजन लाइगैंडों (जैसे, कुछ pigments) पर कब्जा होगा । हालांकि, ५०% इथेनॉल और धीरे से १००% इथेनॉल वाष्पीकरण और इस तरह निष्कर्षण समय का विस्तार हो सकता है । इसके अतिरिक्त, (जैसे साबुन के रूप में) कुछ नमूने खमीर, कम सेल घनत्व माप (ओडी६१०) में जिसके परिणामस्वरूप साइटोटोक्सिक थे । फॉक्स एट अल । (२००८) सुझाव है कि इस तरह के नमूनों और पतला किया जाना चाहिए अगर सेल घनत्व मतभेद 30% से अधिक वाहन नियंत्रण वेल्स12की तुलना में ।
यदि हां परख विश्लेषणात्मक अनुसंधान प्रयोजनों के लिए प्रयोग किया जाता है, नमूना पूल के कमजोर पड़ने curves preemptively करने के लिए परीक्षण किया जा सकता है निकालने के उचित मात्रा निर्धारित करने के लिए कदम ४.५ में खमीर के लिए जोड़ा जाएगा । वैकल्पिक रूप से, अर्क एक साथ कई संस्करणों में परीक्षण किया जा सकता है (उदा, 5 µ एल और 20 µ एल निकालने ४.५ कदम में खमीर के लिए जोड़ा) या कमजोर पड़ने वाली है कि परिमाण के आदेश अवधि (उदा, ०.२ µ एल, 2 µ एल, और 20 µ एल) । निकालने के “उपयुक्त” खंड उन है कि मानक वक्र के रैखिक भाग के साथ LacZ मूल्यों का मिलान करके estrogenicity की पहचान कर रहे हैं । अनुकूलन खमीर, जैसे cytotoxicity, झूठी नकारात्मक, या मानक वक्र से अधिक है कि estrogenicity के लिए बहुत अधिक या बहुत कम नमूना जोड़ने के कारण समस्याओं से बचाता है । जैसा कि ऊपर उल्लेख किया है, नमूनों की मात्रा और E2 मानकों समायोजित किया जाना चाहिए जब ligand के विभिंन मात्रा में उपयोग किया जाता है ऐसी है कि खमीर एक सुसंगत मात्रा और थाली भर में इथेनॉल या अंय वाहन की एकाग्रता को उजागर कर रहे हैं ।
झूठी नकारात्मकता के लिए क्षमता के बावजूद, हां परख Schug एट अल द्वारा अंत-स्रावी अवरोधकों के लिए एक टीयर 3 परीक्षण उपकरण के रूप में पहचान की गई है । (२०१३), जो अंत में स्रावी व्यवधान (TiPED)21के लिए एक व्यापक tiered प्रोटोकॉल विकसित की है । स्नातक शिक्षा के लिए, परख के अंत में स्रावी व्यवधान, कोशिका संस्कृति, रिसेप्टर बाइंडिंग, एंजाइम गतिविधि, आनुवंशिक इंजीनियरिंग, सांख्यिकी, और प्रयोगात्मक डिजाइन से संबंधित अवधारणाओं शिक्षण के लिए मूल्यवान है । छात्र जो परख का उपयोग भी मौलिक और मोटे तौर पर लागू प्रयोगशाला कौशल ऐसे प्रश्नपत्र कमजोर मानकों के रूप में अभ्यास; नमूने निकालने; समाधान बनाना; निर्माण और interpolating मानक घटता; सांद्रता की गणना; समाधान बनाना; बाँझ तकनीक का प्रदर्शन; संवर्धन कोशिकाओं; चर और नियंत्रण की पहचान; डेटा एकत्रित करना, व्यवस्थित करना और उसका विश्लेषण करना; निर्माण और रेखांकन की व्याख्या; और micropipettors और spectrophotometers के रूप में आम प्रयोगशाला उपकरणों का उपयोग ।
The authors have nothing to disclose.
यह परियोजना लुइसियाना टेक यूनिवर्सिटी और Furman यूनिवर्सिटी से टीएमई और AMR को क्रमशः स्टार्ट-अप फंडिंग से वित्तपोषित थी । अतिरिक्त धन AMR और टीएमई को दक्षिण के संबद्ध कॉलेजों, एक लुइसियाना EPSCoR Pfund अनुदान के लिए एक २०१५ संकाय उंनति अनुदान द्वारा प्रदान की गई थी राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन और टीएमई के लुइसियाना बोर्ड से रीजेंट्स, और एक यात्रा पुरस्कार से टीएमई को दक्षिण के विश्वविद्यालय । हम सांख्यिकीय विश्लेषण और श्री क्रिस्टोफर मूर के लिए “हमें एक हाथ दे” फिल्माने के दौरान के साथ सहायता के लिए डॉ डेविड Eubanks (Furman) धंयवाद ।
Equipment | |||
Vortex Mixer (for single or multiple tubes) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 02-215-365 | Any mixer will suffice. |
Bucket centrifuge | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 75-063-839 | Any bucket centrifuge will suffice if it is capable of centrifuging conical tubes at 4000 rpm. |
Bunsen burner | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 17-012-823 | Any Bunsen burner will suffice, or an alcohol burner (Fisher Scientific 04-245-1) can be used instead. |
Incubator | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 50125590H | Any incubator will suffice if it is capable of maintaining 30 °C. |
Microplate reader | BioTek (www.biotek.com) | EPOCH2 | A different brand of plate reader will suffice if it can measure absorbance at wavelengths of 405, 574, and 610 nm. |
Gen5 microplate reader and imager software | BioTek (www.biotek.com) | GEN5 | Software required depends on make and model of plate reader; GEN5 software is intended for use with BioTek plate reader. |
Refrigerator | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 05LREEFSA | Any refrigerator will suffice if it is capable of maintaining 4 °C. |
Pipettor or PipetAid compatible with 1-10 ml serological pipets | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 13-681-15E | Any pipettors will suffice if they are compatible with 1- and 10-ml serological pipets. |
P10 micropipettor | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | F144562G | Any micropipettor will suffice if it is capable of dispensing 5 µl. |
P200 micropipettor | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | F144565G | Any micropipettor will suffice if it is capable of dispensing up to 200 µl. |
P300 multichannel pipettor | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | FBE1200300 | Any multichannel pipettor will suffice if it is capable of dispensing 50 to 205 µl. |
Repeating pipettor | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | F164001G | Must be able to deliver 100-320 µl; this pipettor is optional because a multichannel pipettor can be used instead. |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Supplies | |||
Sterile 15-ml conical tubes with caps | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 05-539-801 | |
Glass scintillation vials | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 03-337-4 | |
Polystyrene 96-well, flat-bottom microplates with lid (non-sterile) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 12565501 | |
Polypropylene 96-well, flat-bottom microplates without lid | Cole-Parmer (www.coleparmer.com) | EW-01728-81 | |
100 ml glass beakers | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 02-539H | Any glass beakers will suffice if they are autoclavable. |
250 ml glass Erlenmeyer flasks | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | FB500250 | Any glass Erlenmeyer flasks will suffice if they are autoclavable. |
Sterile, adhesive, porous film | VWR (www.vwr.com) | 60941-086 | |
Metal forceps | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 12-000-157 | Any metal forceps will suffice. |
Reagent reservoir | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 07-200-127 | |
Filtration units (0.2 µm) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 09-761-52 | |
Squirt bottle (for ethanol) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 02-897-10 | Any laboratory squirt bottles will suffice. |
Autoclavable storage bottles | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 06-414-1D | Any autoclavable glass storage bottles will suffice. |
10 ml glass serological pipets (sterile) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 13-678-27F | Any glass serological pipets will suffice. |
1 ml glass serological pipets (sterile) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 13-678-27C | Any glass serological pipets will suffice. |
P10 micropipettor tips | USA Scientific (www.usascientific.com) | 1120-3810 | Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above. |
P200 micropipettor tips | USA Scientific (www.usascientific.com) | 1120-8810 | Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above. |
P300 micropipettor tips | USA Scientific (www.usascientific.com) | 1120-9810 | Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above. |
Syringe tips for repeating pipettor | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | F164150G | Only required if a repeating pipettor is used. |
Sterile petri dishes | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | FB0875712 | Any sterile petri dishes will suffice. |
Parafilm | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | S37440 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Yeast | |||
Saccharomyces cerevisiae strains that lack the TRP1 gene product (e.g. W303a) | American Type Culture Company (ATCC) (www.ATCC.org) | MYA-151 | Recombinant yeast are also available upon request from the authors. |
Receptor/reporter plasmid for ERα | Addgene (www.addgene.org) | pRR-ERalpha-5Z (Plasmid #23061) | |
Receptor/reporter plasmid for ERβ | Addgene (www.addgene.org) | pRR-ERbeta-5Z (Plasmid #23062) | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chemicals | |||
Difco agar | BD (www.bd.com) | 214530 | |
Dithiothreitol | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | D0632 | CAUTION: Dithiothreitol is an acute skin and eye irritant. Use appropriate personal protection equipment (gloves, fume hood, dust mask) to avoid skin and eye contact, inhalation and ingestion. |
Ortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | N1127 | |
Chlorophenol red-β-D-galactopyranoside | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | 10884308001 | |
Yeast nitrogen base | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | Y0626 | |
Glucose | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | G8270 | |
Galactose | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | G5388 | |
Adenine sulfate | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | A9126 | |
Uracil | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | U0750 | |
Leucine | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | L8000 | |
Histidine | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | H8000 | |
17 β-Estradiol | Sigma (www.sigmaaldrich.com) MP Biomedicals | E8875-250 mg 0219456401 – 1 mg | CAUTION: Estradiol is a suspected carcinogen and reproductive toxicant. It is harmful if inhaled, swallowed, or absorbed through skin. Estradiol may cause harm to breast-fed children and fetuses. Estradiol is very toxic to aquatic life. Use appropriate personal protection (gloves, fume hood, dust mask) and avoid exposure during pregnancy and lactation. Estradiol should be disposed of as hazardous waste and not released to the environment. |
100% ethanol | Pharmco-Aaper (www.pharmcoaaper.com) | 111000200 | |
Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | S9638 | |
Sodium phosphate dibasic (anhydrous) | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | S0876 | |
Magnesium chloride | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | M8266 | |
Potassium chloride | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | P9333 | |
Sarkosyl (N-lauroylsarcosine sodium salt) | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | L5125 | |
Sodium carbonate | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | S7795 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
Excel spreadsheet software | Microsoft | Excel is convenient spreadsheet software for managing data outputs and generating .csv files for R analysis. | |
Java software (required for Appendix 1 application) | Oracle Corporation | To calculate LacZ values using the application in Appendix 1, first download free Java software (https://www.java.com/en/download/), then open the LacZ application in Appendix 1. LacZ results created by the application can be copied by pressing "control (ctrl) + c" on PC keyboards, or "command + c" on Mac keyboards. | |
JMP statistical software version 13.0.0 | SAS Institute | Appendix 2 includes directions on using JMP to fit LacZ data to a four-parameter logistic regression curve. The curve is used to interpolate test sample estradiol equivalents (EEQs), relative to the estradiol standard curve. | |
R statistical computing and graphics software | R Foundation | Free R software can be downloaded from https://www.r-project.org/. Directions and code for using R to fit LacZ data to a four-parameter logistic regression curve are given in Appendix 2. |