Summary
Nonlytic insektcelle-ekspresjonssystemer er underutnyttet for produksjon, cellulær handel / lokalisering, og rekombinant protein funksjonell analyse. Her beskriver vi metoder for å generere ekspresjonsvektorer og påfølgende forbigående proteinekspresjon i kommersielt tilgjengelige sommerfugl-cellelinjer. Den ko-lokalisering av Bemisia tabaci aquaporins med subcellulære fluorescerende markørproteiner er også presentert.
Abstract
Heterologe proteiner ekspresjonssystemer brukes for fremstilling av rekombinante proteiner, tolkningen av cellulær handel / lokalisering, og bestemmelse av den biokjemiske funksjon av proteiner ved under eller organismen. Selv om baculovirus ekspresjons-systemer blir stadig mer brukt for proteinproduksjon i mange bioteknologisk, farmasøytiske og industrielle anvendelser, nonlytic systemer som ikke involverer viral infeksjon har klare fordeler, men er ofte overses og lite brukte. Her beskriver vi en fremgangsmåte for å generere nonlytic ekspresjonsvektorer og forbigående ekspresjon av rekombinant protein. Denne protokollen gir mulighet for effektiv cellulær lokalisering av rekombinante proteiner og kan brukes til hurtig å skjelne protein handelen i cellen. Vi viser ekspresjonen av fire rekombinante proteiner i en kommersielt tilgjengelig insekt-cellelinje med to aquaporin proteiner fra det insekt Bemisia tabaci, så velsom subcellulære markørproteiner som er spesifikke for celleplasmamembranen og intracellulære lysosomer. Alle rekombinante proteiner ble produsert som kimærer med fluorescerende protein markører på sin karboksyl termini, som gjør det mulig for den direkte påvisning av de rekombinante proteiner. Den doble transfeksjon av celler med plasmider som husing konstruksjoner for gener av interesse og en kjent subcellulær markør tillater levende celle avbildning og forbedret verdsetting av cellulært protein lokalisering.
Introduction
Fremstilling av rekombinante proteiner ved anvendelse av insektcelle-ekspresjonssystemer gir en rekke fordeler for studiet av eukaryote proteiner. Nemlig, insektceller har lignende post-translasjonelle modifikasjoner, behandling, sortering og mekanismer som de som er til stede i pattedyrceller, som er fordelaktig for fremstilling av korrekt foldete proteiner 1, 2, 3. Insektcellesystemer inkluderer også typisk mindre ressurskrevende og mindre tid og anstrengelse for vedlikehold enn pattedyrcellelinjer 4, 5. Baculovirus-ekspresjonssystemet er et slikt insektcelle-basert system som nå mye brukt i mange fagområder, inkludert produksjon av rekombinante proteiner for proteinkarakterisering og terapeutika, det immunogene presentasjonen av fremmede peptider og virale proteiner for vaksineproduksjon, syntesen av fler -protein-komplekser, Produksjon av glykosylerte proteiner, osv. 1, 2, 4, 6. Det finnes imidlertid situasjoner hvor baculovirus ekspresjon kan ikke være relevant 3, 7, og bruken av nonlytic og forbigående insekt ekspresjonssystemer kan være mer hensiktsmessig. Nærmere bestemt, har transient insektcelle ekspresjon mulighet for hurtig syntese av rekombinant protein, krever mindre utvikling og vedlikehold, innebærer ikke viral pålagt cellelyse, og gir et middel for å bedre studere cellulært handelen under proteinsyntesen 7, 8, 9, 10.
Denne protokollen beskriver den hurtige dannelse av ekspresjonsvektorer ved bruk av to-trinns overlappforlengelse-PCR (OE-PCR) Escherichia coli. Plasmider blir brukt til å transfektere dobbelt kommersielt tilgjengelige dyrkede insektceller og for å fremstille representative proteiner. Protokollen beskriver fremstilling og bruk av to forskjellige fluoresceinmerkede subcellulære markørproteiner og demonstrerer colocalization med to aquaporin proteiner fra det insekt Bemisia tabaci. Følgende protokoll gir grunnleggende metodikk for OE-PCR, insektcelle vedlikehold og transfeksjon, og fluorescens mikroskopi for den cellulære lokalisering av målproteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. OE-PCR for konstruksjonen av ekspresjonsplasmider
Merk: Se tabell 1 for alle primere som brukes i OE-PCR. Bruken av en Hi-Fi-DNA-polymerase er anbefalt for alle amplifikasjoner. Imidlertid, fordi disse enzymer ofte ikke gitt noen 3' A, er det nødvendig å utføre en kort, ikke-amplifisering inkubasjon med en Taq DNA-polymerase for å 'A-hale' som PCR-produktene før kloning dem inn i en TA-insektcelle ekspresjon vektor. Denne protokollen viser en metode for å generere insekt-plasmider husing chimeriske proteiner, med de fluoriserende proteinene sammensmeltet i-ramme til karboksylenden av genene av interesse (i dette tilfellet to Bemisia tabaci aquaporin proteiner) eller til subcellulære markørproteiner (figur 1).
- Bruk OE-PCR, som består av to uavhengige amplifikasjonsrunder, for å danne: (1) sekvenser som koder for gener av interesse (B. tabaciaquaporin 1: BtDrip1; B. tabaci aquaporin 2: BtDrip2_v1) sammensmeltet i-ramme med et grønt fluorescent protein variant kalt EGFP eller (2) de subcellulære markører (Drosophila melanogaster sex peptid reseptor: DmSPR; Homo sapiens fosfolipase A2: HsPLA2) med den mCherry kodende sekvens. Direkte ligere de endelige OE-PCR produkter inn i PIB / V5-His-TA plasmid.
- For den første runden av PCR-OE (indikert ved AD og A'-D' på figur 1), bruker et genspesifikke senseprimer (vist med fet skrift i tabell 1), og et kimært antisense-primer (kursiv i tabell 1) som svarer til den endelige 15 bp (uten stoppkodonet) av genet av interesse / subcellulære markør og 15 bp av den 5'-enden av det ønskede fluorescerende protein (EGFP eller mCherry) for å generere et produkt med et 3'-overheng.
Merk: Se tabell 2 for PCR-forhold. - I et separat rør ved å bruke et gen-specific fluorescerende protein antisense-primer (vist med en understrekning i tabell 1), og et kimært senseprimer som inneholder 15 bp fra 3'-enden av genet som er av interesse / subcellulære markør og 15 bp fra 5'-enden av den ønskede fluorescerende protein for å danne et produkt med et 5'-overheng.
Merk: Se tabell 2 for PCR-betingelsene. Den PCR-templat, kan enten være en sekvens-validert PCR-produkt eller, mer foretrukket, plasmid-DNA som inneholder det ønskede sekvens. Studien er beskrevet her anvender sekvens validert plasmider. - Separer PCR-produktene med 1% agarose-gel-elektroforese (ved hjelp av standard molekylær-klasse agarose).
- Avgifts og rense produktene fra de forventede størrelser (se tabell 2) ved å bruke et kommersielt tilgjengelig DNA-gel ekstraksjonssett (se tabellen av materialer for det spesifikke settet anvendt i denne protokollen).
- Bruk gelrensede PCR-produkter fra trinn 1.1.4 for å generere den endelige overlapp eXTension produkter (angitt ved A '' - D '' på figur 1). Bruk en gen-spesifikk Sense-primer for genet av interesse / subcellulære markør og det tilsvarende gen-spesifikke antisense-primer for den fluorescerende protein for å frembringe det ønskede kimære sekvens.
Merk: Se tabell 2 for PCR-betingelsene. Det kan være nødvendig empirisk å bestemme de optimale mengdene av første runde overlapping ekstensjonsprodukter å tilsette til reaksjonsblandingen for å gi den endelige, i full-lengde kimære PCR-produkt. - Separer andre runde OE-PCR-produktene ved 1% agarosegel-elektroforese. Avgifts og rense produktet ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig DNA-gel ekstraksjonssett.
- Inkuber gelrensede andre rundt OE-PCR-produkter med 1 enhet Taq DNA-polymerase masterblanding i 10 minutter ved 72 ° C for å frembringe de 3' adenylated (dvs. A-tailed) produkter som trengs for TA kloning.
- Ligere de resulterende produktene adenylatedinn i PIB-ekspresjonsvektor og bruke standard molekylære kloningsteknikker for å transformere kompetente kjemisk (varmesjokk) eller elektrokompetente (elektroporering) Escherichia coli-celler. Plate over natten i medium inneholdende den egnede seleksjonsmarkøren (dvs. ampicillin eller karbenicillin).
- Utføre koloni PCR 12 ved anvendelse av en vektor spesifikk primer og en innsats-spesifikk primer for å identifisere innsats-positive kolonier som er blitt transformert med ekspresjonsplasmidene huse en innsats i 5'-3'-retning. Preparere over-natt kulturer av kolonier generere PCR-produkter med den forventede størrelse.
- Isolere plasmid-DNA ved bruk av et kommersielt tilgjengelig DNA-rensesett ifølge fabrikantens instruksjoner (se Materialer Tabell for det spesifikke settet anvendt i denne protokollen). Valider sekvensen integriteten til hver innsats ved direkte DNA-sekvensering.
- For den første runden av PCR-OE (indikert ved AD og A'-D' på figur 1), bruker et genspesifikke senseprimer (vist med fet skrift i tabell 1), og et kimært antisense-primer (kursiv i tabell 1) som svarer til den endelige 15 bp (uten stoppkodonet) av genet av interesse / subcellulære markør og 15 bp av den 5'-enden av det ønskede fluorescerende protein (EGFP eller mCherry) for å generere et produkt med et 3'-overheng.
Merk: For å opprettholde sterile forhold, å utføre alle celle manipulasjoner som krever åpning av vevskulturkolbe i en laminær strømningshette. Slå på laminær hette UV bakteriedrepende lampe minst en time før celle manipulasjoner. Slitasje nitril hansker og dekontaminere overflaten av benken, pipetter, kasseroller, rør og kolber med 70% etanol før bruk. Kjennskap til grunnleggende celledyrkningsteknikker er anbefalt 13.
- Bruk TNI-celler (en etablert cellekultur-linje avledet fra Trichoplusia ni ovarievev) som er tilpasset til serumfritt medium og opprettholde dem som en adherent monolag-kultur i serumfritt medium insekt ved 28 ° C i T25 vevskulturflasker.
- Oppretthold Sf9-celler (en etablert cellekultur-linje avledet fra Spodoptera frugiperda ovarievev) På lignende måte, men ved anvendelse av TNM-FH insekt kulturmediumsupplemented med 10% føtalt bovint serum (FBS).
- Seed den opprinnelige kultur fra frosset Sf9 eller TNI-celler ved å fjerne lager ampuller fra -80 ° C og tillater dem å tine i et 37 ° C vannbad. Dekontaminere ampullene med 70% etanol etter tining og plassere dem på is.
- Tilsett 4 ml av insektcelle medium til en ny T25-kolbe og overføre 1 ml av den opptinte insektcellesuspensjon. Plasser flasken i en 28 ° C, ikke-fuktet inkubator og la cellene feste seg i 30-45 min.
- Sett på seeding medium med 5 ml medium og overføre flaskene til en 28 ° C ikke-fuktet inkubator. Overvåk celle samløpet daglig. Passage cellene når de når 90% konfluens.
Merk: Komplett dekning av T25 kolbe tilsvarer ~ 5 x 10 6 celler. - Insektcellepassasje.
- For å passasje cellene, først ta bort det brukte mediet fra kolben inneholdende sammenflytende celler ved anvendelse av en steril 5 ml serologisk pipette.Vippe kolben slik at mediet strømmer til et hjørne, bort fra cellenes monolag. Fjern forsiktig medium ved hjelp av en pipette uten å forstyrre cellene.
- Løsne TNI-celler ved forsiktig skylling av T25-kolber inneholdende det sammenflytende monolag med 4 ml serumfritt medium ved hjelp av insekt ny, steril, 5 ml serologisk pipette. Beveg pipettespissen på tvers av kolben og langsomt vanne for å fjerne celler løst festet til kolben bunnen.
- Kontroller for tilstrekkelig løsgjøring av celler ved å fjerne all media, snu flasken i løpet av, og observere at bunnen av kolben er klar.
- For Sf9-celler, som festes fastere, tilsett 4 ml frisk TNM-FH-medium og bruke en celleskraper for å løsne de festede celler. Bruke en 5 ml serologisk pipette til forsiktig blande og redusere celleklumping.
- Bruke et automatisk celleteller for å anslå antallet av levedyktige insektceller pr volum medium. Overfør 0,1 ml celle / mediumblandingen til en 1,5 mLmikrofuge-rør. I et separat 0,5 ml mikrofuge-rør, tilsett 10 pl av celle / mediumblandingen til 10 ul av trypanblått.
- Fjerne en celleteller kammer lysbilde fra emballasjen og tilsett 10 pl av celle / medium / trypanblått-blanding til hver side av telle sleiden. Sett lysbilde i celleteller og bestemme celletetthet og levedyktighet.
- Ved hjelp av celletettheten, beregne og legge til riktig volum av insektcellemedium (opp til 5 ml) for å ny, steril T25-kolber.
- Overfør ca. 1-1,5 x 10 6 celler til T25-kolber med frisk media; merke kolbene med cellelinje, dato, medium som benyttes, antall celler tilsatt, og passasje nummer (P n + 1 generasjon, hvor P n er passasjen tall for forrige generasjons-celler); og plasserer flaskene i en 28 ° C inkubator i opp til 72 timer.
Merk: Insektceller kan være kontinuerlig formeres, selv om cellene kan være mindre mottakelige for transfeksjon og / eller heterologeproteinekspresjon etter 30 passasjer. Behandle alle forkastet celler / medium med 10% blekemiddel og autoklaveres engangs plast ware før avhending.
3. Insect Cell Transfeksjon
- Seed en T25-kolbe med opp til 1 x 10 6 TNI eller Sf9-celler i et passende insektcellemedium (serumfritt medium for insekt TNI og TNM-FH for Sf9) og vokse til sammenflytning i 72 timer ved 28 ° C.
- Fjern og kast det gamle mediet og løsne cellene med 4 ml friskt serumfritt medium insekt (se trinn 2.6.2 og 2.6.3, ovenfor).
- Estimer celletettheten ved hjelp av en automatisk celleteller (se trinn 2.6.4, ovenfor).
- Tilsett ca. 7 x 10 5 celler til individuelle 35 mm glassbunn retter og la cellene feste seg i 20-25 min ved 28 ° C.
- For hver transfeksjon, tilsett 2 ug plasmid-DNA (enten fra et plasmid for enkelttransfeksjoner eller 2 ug fra hver av de to plasmider for gjørÜble transfeksjoner) til 0,1 ml av serumfritt insekt medium (uten FBS for både Sf9 og TNI transfeksjoner) i en steril 1,5 ml mikrofuge-rør.
- I et separat rør, bland 8 ul transfeksjon reagens med 0,1 ml serumfritt medium insekt og deretter overføre denne løsning til røret som inneholdt plasmid-DNA av interesse. Lett vortex og inkuber ved romtemperatur i 20 - 30 For min.
- Fortynn den plasmid-transfeksjon blandingen fra trinn 3.5 og 3.6 med 0,8 ml av serumfritt medium insekt, slik at det totale volum er lik 1 ml.
- fjerne mediet forsiktig fra glass-skåler inneholdende sammenheftede celler. Overlegg av festede celler med den fortynnede plasmid-transfeksjon medium.
- Cellene inkuberes ved 28 ° C i 5 timer.
Merk: Betingelsene for transfeksjon krever empirisk optimalisering for maksimal transfeksjonseffektiviteten (for eksempel, natten over transfeksjon i stedet for 5 timer, er mengden av plasmid DNA anvendt, kjemien i transfeksjon reagensbrukt, osv.). - Fjern og kast transfeksjonsmediet og forsiktig vask av cellene med 1 ml serum-fritt medium insekt, være forsiktig for å løsne cellene.
- Tilsett 2 ml nytt insektcellemedium (serumfritt medium for insekt TNI og TNM-FH for Sf9) og inkuber ved 28 ° C i 48-72 timer.
Merk: Igjen, forholdene krever empirisk optimalisering for maksimal heterologe protein uttrykk.
4. Confocal Fluorescensmikroskopi
- Ved 48 til 72 timer etter transfeksjon, vaskes cellene én gang med 1 ml av IPL-41 insekt medium og deretter dekke med 2 ml IPL-41 for avbildning.
Merk: Dette vasketrinn reduserer bakgrunnen auto-fluorescens ble observert med insektcellemedium som brukes i normal celle vedlikehold. - Tilsett 4 dråper Hoechst levende celle-fargereagens (se tabellen av materialer for det spesifikke kjernefarge anvendt i denne protokollen) til mediet og inkuberes ved 28 ° C i 20-25 min.
Merk: Ytterligere NUCLear flekker kan være substituert, selv om fargestoffet bør ha en fluoresenceprofil unik fra EGFP og mCherry. - Plasser en 35 mm skål i det selv-omsluttende laser scanning konfokalt mikroskop (se tabellen av materialer for den bestemte instrument som brukes i denne protokoll).
- Juster mikroskop for Hoechst, EGFP, og mCherry observasjonsbetingelser: Hoechst eksitasjon / emisjon - 359/461 nm; EGFP eksitasjon / emisjon - 489/510 nm; mCherry eksitasjon / emisjon - 580/610 nm.
- Utføre den første skanning ved hjelp av et 10x objektiv for å bekrefte fluoriserende uttrykk, og deretter bytte til skannemodus ved hjelp av en 60X fasekontrast vann-nedsenking objektiv.
- Juster lasereffekt (5-7%), detektorfølsomhet (47-49%), skannehastighet, Z-aksen dybde, og digital zoom for å optimalisere bildet kontrast og oppløsning. Bilde cellene på 1,5 ganger digital zoom for å gi totalt 90X forsterkning.
Merk: Mikroskop parametre empirisk justering for optimalbildesamlingen og kan være spesifikke for instrumentet i bruk. - Eksportere rådata som TIFF-bildefiler og modifisere (crop og overlay) for figuren generasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
OE-PCR
OE-PCR gjør det mulig for syntese av chimeriske DNA-produkter som, når de settes inn i en ekspresjonsvektor, tillate produksjon av rekombinante kimære proteiner som korresponderer til et hvilket som helst test genet av interesse og fluorescerende markørprotein. Figur 1 viser et generelt skjema for fremstilling av PIB-ekspresjonsvektorer inneholdende B. tabaci aquaporin kodende sekvenser (BtDrip1 og BtDrip2_v1) i-ramme med den fluorescerende protein markør EGFP. I dette tilfellet ble to BtDrip chimeriske proteiner som inneholder EGFP ved sine karboksylgrupper termini produsert. Denne protokollen også vist fremgangsmåter for å utvikle to insekt subcellulære markørproteiner, DmSPR og PLA2G15 (figur 1), fremstilt som kimærer med mCherry ved sin karboksyl termini. EGFP og mCherry ble valgt fordi deres emisjonsspektrene er tilstrekkelig divergerende, slik at for than uavhengig detektering og lokalisering av signaler fra prøveproteiner (f.eks., BtDrip-EGFP) og den DmSPR- og PLA2G15-mCherry-merkede markørproteiner. Alle PCR reaksjoner produsert band av de forventede størrelser og ble vellykket klonet inn PiB. Alle plasmider ble bekreftet ved DNA-sekvensering å inneholde de aktuelle innsatser i korrekt orientering og i leseramme med fluorescerende protein markører.
Transient rekombinant protein ekspresjon i insektcellekultur
Etter konstruksjon av ekspresjonsvektorer som svarer til PIB / BtDrip1-EGFP, PIB / BtDrip2_v1-EGFP, PIB / DmSPR-mCherry, og PIB / PLA2G15-mCherry ble cellene transfektert og ekspresjon av rekombinante proteiner i levende celler ble visualisert ved anvendelse av konfokal fluorescens mikroskopi (figur 2). Vellykket transfeksjon og ekspresjon av rekombinant BtDrip1-EGFP er tydelig by nærvær av grønn fluorescens på overflaten av TNI-celler (figur 2B, 2F). Grønn fluorescens observeres innenfor TNI-celler transfektert med BtDrip2_v1-EGFP (figur 2J, 2N), som indikerer den intracellulære ekspresjon av BtDrip2_v1. Likeledes, TNI celler transfektert med PIB / DmSPR-mCherry (figur 2C, 2K) eller PIB / PLA2G15-mCherry (figur 2G, 2O) viser rød fluorescens, noe som indikerer at ekspresjon av de respektive kimærer.
Ko-lokalisering av rekombinante proteiner BtDrip og subcellulære markører
Den doble transfeksjon av TNI celler gjør det mulig for den ko-ekspresjon av to fluorescensmerkede proteiner. Overleggsbildene av transfekterte celler som er TNI orange / gul tyder på at celler som havn plasmider som produserer både EGFP og mCherry og antyder at proteinene er co-lokalisert innenfor det samme subcellular strukturer (figur 2D, 2E, 2L og 2P). Dette bekrefter tidligere resultater som BtDrip1 og DmSPR uttrykkes på celleoverflaten 14, 15, 16. En overlapping av TNI celler dobbelt-transfektert med PIB / BtDrip1-EGFP og PIB / DmSPR-mCherry viser overlapping av de grønne og røde fluorescens-signaler (figur 2D), noe som tyder på ko-lokalisering av BtDrip1-EGFP og DmSPR-mCherry på celleoverflaten . Tidligere Maroniche et al. 17 viste at PLA2G15 er en markør for intercellulære lysosomer når den blir uttrykt i Sf9-celler som en kimær med mCherry. Selv om det ble forutsagt at den rekombinante BtDrip2_v1-EGFP-protein ville translokere til celleoverflaten, ble det tidligere vist at det kimære protein ble primært lokalisert intracellulært i transfekterte celler TNI 15. Til støtte for dette, var det lite evidningen for den ko-lokalisering av grønne og røde fluorescerende signaler når BtDrip2_v1-EGFP ble co-uttrykt med PIB / DmSPR-mCherry (Figur 2L). I motsetning til dette, ko-ekspresjon av PIB / BtDrip2_v1-EGFP og PIB / PLA2G15-mCherry resulterte i en betydelig overlapping i cytoplasmatiske grønne og røde fluorescerende signaler (fig 2P), Dette tyder på at BtDrip2_v1 er sannsynlig trafikkert til intracellulære lysosomer.
Figur 1: Skjematisk oppbygging ekspresjonskonstruksjoner ved hjelp av overlappforlengelse-PCR (OE-PCR). OE-PCR anvendes for å bygge PIB ekspresjonsvektorer inneholdende den Bemisia tabaci aquaporin-1 / EGFP (BtDrip1-EGFP), B. tabaci aquaporin-2_variant 1 / EGFP (BtDrip2_v1-EGFP), Drosophila melanogaster kjønn peptid reseptor / mCherry (DmSPR- mCherry), og Homo sapiens fosfolipase-A2 / mCherry(HsPLA2G15-mCherry) produkter. Den første runden med OE-PCR genererer fragmenter som korresponderer til full-lengde cDNA av interesse, BtDrip1 (A), BtDrip2_v1 (B), DmSPR (C), og HsPLA2G15 (D), som inneholder en liten 3'-overlappende området som tilsvarer den 5'-enden av enten EGFP eller mCherry fluorescerende markørproteiner. Samtidig full-lengde cDNA fra EGFP og mCherry er PCR amplifisert og inneholder en liten 5' overlappende området som svarer til 3'-endene av BtDrip1 (A '), BtDrip2_v1 (B'), DmSPR (C'), eller HsPLA2G15 ( D'). Legg merke til at alle primere anvendt for å amplifisere cDNA av interesse (dvs. BtDrip1, BtDrip2_v1, DmSPR, og HsPLA2G15) i den første runden av PCR-OE mangler de stoppkodon normalt finnes i 3'-enden av hver kodende sekvens. Alle første runde OE-PCR-produktene blir forsterket, separert ved agarosegel utvalgterophoresis, og gel-renset. Den andre runden med OE-PCR anvender samlede par av de gelrensede PCR-produkter fra den første runden av PCR-OE som templater for forsterkningen av de full-lengde kimære produkter. For hver reaksjon tilsvarer sense-primer for 5'-enden av cDNA av interesse kodende sekvensene og antisense-primer er komplementær til 3'-enden av EGFP eller mCherry, med sin stopp-kodon intakt (A '', B' 'C'' og D ''). De fire andre-runde OE-PCR produktene er gel-renset, adenylated med Taq-polymerase, og ligert inn i PIB / V5-His-ekspresjonsvektor. Plasmider blir propagert i E. coli og renset plasmid-DNA blir anvendt for å transfektere insektceller. B. tabaci aquaporins BtDrip1 og BtDrip2_v1 er vist i mørk blå og cyan, henholdsvis, og de subcellulære markører DmSPR og PLA2G15 er vist i oransje og rosa, henholdsvis. EGFP er shhånd i grønt og mCherry er i rødt. Fargede Pilene viser retningen (sense primere i retning fremover og antisens primere i motsatt retning) og plassering av genspesifikke primere (fargen på en primer indikerer kilden for primersekvensen). Se tabell 1 for primer detaljer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Lever Imaging of Double-transfekterte TNI-celler som uttrykker rekombinant BtDrip1-EGFP, BtDrip2_v1-EGFP, DmSPR-mCherry, og PLA2G15-mCherry proteiner. Trichoplusia ni (TNI) celler ble dobbelt-transfektert med PIB / BtDrip1-EGFP og PIB / DmSPR-mCherry (AD), PIB / BtDrip1-EGFP og PIB / PLA2G15-mCherry (EH), PIB / BtDrip2_v1-EGFP og PIB / DmSPR -mCherry (<strong> IL), eller PIB / BtDrip2_v1-EGFP og PIB / PLA2G15-mCherry (MP). Bildene ble tatt med et laser scanning konfokalt mikroskop ved anvendelse av en 60X fasekontrast vann-nedsenking objektiv (NA 1,2) ved 90X forsterkning. Hoechst panelene viser representative levende celle bilder av farvede cellekjerner (ex / em = 359/461 nm). EGFP panelene viser fluorescens ekspresjonen av celler transfektert med EGFP-kimærer (ex / em = 489/510 nm). De mCherry panelene viser fluorescens ekspresjonen av celler transfektert med mCherry-kimærer (ex / em = 580/610 nm). Flettingen panelet viser overlapping av alle tre fluoriserende kanaler (det vil si Hoechst, EGFP, og mCherry). Skala bar = 10 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Heterologe protein ekspresjonssystemer er viktige verktøy for produksjon av rekombinante proteiner som benyttes i tallrike anvendelser nedstrøms 4. Velge fra de ulike uttrykks systemer tilgjengelig, avhenger av det endelige målet for proteinet av interesse. Flere insektscelle-ekspresjonssystemer er tilgjengelige som gir bøyelige alternativer til prokaryote og eukaryote celleekspresjonsvektorer systemer 5, 6. Insektsystemer som krever baculovirus infeksjon for å drive proteinekspresjon er langt den mest populære og vidt brukt insekt system, med mange slike proteiner som brukes i forskning og terapeutiske anvendelser 1, 2, 3. Baculovirus ekspresjonssystem gjør det, men har begrensninger, blant annet at: 1) den virale livssyklus omfatter lysering av vertscellen; 2) vertscellene som er lysert vanligvis frigi høy amounts av nedbrytende enzymer; 3) generering av stabile cellelinjer som er tidkrevende og kan ikke være mulig for cytotoksiske proteiner; 4) diskontinuerlig ekspresjon krever hyppig vedlikehold; 5) vektorgenerering krever ofte multiple kloningstrinn; 6) insektcelletettheter ofte er omvendt proporsjonal med viral infeksjon; og 7) rekombinante proteiner primært trafikkert ved høye nivåer til celleoverflaten eller utskilles 3, 7, 9, 10. Nonlytic transient genekspresjon basert på insektcelle transfeksjon med plasmid-DNA som gir en alternativ metode for fremstilling av rekombinante proteiner, uten at noen av de spesielle utfordringer forbundet med baculovirus 7, 8. Nemlig, transient ekspresjon insektcelle har kortere turn-around på vektorkonstruksjon og proteinsyntese, unngår challeng es assosiert med viral infeksjon og cellelyse, og gir en robust anordning for å observere den cellulære handel med proteiner.
Her ble to validerte ekspresjonskonstruksjoner som brukes til å bestemme den subcellulære lokalisering av B. tabaci aquaporin proteiner BtDrip1 og BtDrip2_v1. DmSPR-mCherry er en markør for den plasmacellemembran 16, og PLA2G15-mCherry lokaliseres innenfor cellulære lysosomer 17. Figur 2 viser verdien av slike markører for vurdering av plasseringene av proteiner av interesse i dette tilfellet, det ko-lokalisering av BtDrip1-EGFP med DmSPR-mCherry på celleoverflaten og BtDrip2_v1-EGFP med PLA2G15-mCherry i lysosomene. Derfor, som vist her og på tidligere undersøkelser 14, 15, 16, 18, 19,ass = "ekstern referanse"> 20, kan denne metoden bli anvendt for raskt å fastslå protein handel innenfor insektceller. Selv proteinekspresjon og handel innen TNI celler er vist her (figur 2), er det viktig å merke seg at protokollen kan optimaliseres og like godt anvendes på andre insektcellelinjer (Sf9, Sf21, BM-N, S2, etc.) .
Som alle heterologe protein ekspresjonssystemer, er det begrensninger i forbigående proteinproduksjon i dyrkede insektceller. Nemlig, er prosentandelen av celler som er positive for plasmid-avledede uttrykk vanligvis lavere enn det som oppnås fra baculovirus eller fra bruk av stabile cellelinjer. Således er mengden av rekombinant protein (er) som fremstilles kan være lavere i en forbigående system; Imidlertid kan bruken av forskjellige promotorer og innlemmelsen av genetiske enhancers overvinne dette potensielle begrensningen 7, 21, 22. Tsin protokoll demonstrerer ko-transfeksjon av TNI-celler med to PIB vektorer, hver husing forskjellig protein-kodende sekvenser (Figur 2). Selv om lignende transfeksjonseffektiviteten ble observert for alle fire ekspresjonsvektorer anvendt for å transfektere TNI-celler (data ikke vist), er dette ikke alltid mulig. Derfor kan forsøk med slike forbigående ekspresjonsvektorer krever omfattende empiriske optimalisering (f.eks variasjon i mengden av hver vektor, transfeksjon tid, transfeksjon reagens kjemi, etc.) for å oppnå ekvivalente transfeksjonseffektivitet og / eller nivåer av rekombinant proteinekspresjon. Videre er det mulig at tilsetningen av et fluorescerende protein kan påvirke eller begrense subcellulære handel med protein er rettet mot 23, 24. Identifiseringen av den subcellulære lokalisering av to proteiner ved observasjon av fluorescens med markørproteiner ikke necessarily viser ingen direkte protein-protein interaksjoner mellom proteiner av interesse 24, 25. Derfor kreves forsiktighet ved tolkning av slike co-lokalisering resultater.
Transient genekspresjon, medfører flere fordeler i forhold til for tiden tilgjengelige baculovirus-ekspresjonssystemer. Transient ekspresjon krever mindre tid og arbeidskraft for konstruksjon av vektorer, og for syntese av rekombinante proteiner, blir forbigående ekspresjon ikke involverer cellelysering assosiert med den patogene livsløpet til baculovirus, og transient ekspresjon kan gi en bedre undersøkelse system for den subcellulære handel med proteiner 3, 7, 9. Denne protokollen fremhever den enkle og raske å bygge konstruksjoner ved direkte inkorporering av et gen av interesse til PIB-ekspresjonsvektoren ved hjelp av overlappforlengelse-PCR (Figur 1 26. Videre, selv om EGFP 27 og mCherry 28 ble inkorporert her ved den karboksyl-terminale ender av to B. tabaci aquaporin proteiner, kunne OE-PCR også brukes til å plassere mange andre variant fluorescerende markørproteiner 26 ved aminoendene av disse proteinene. Det er bemerkelsesverdig at i tillegg til en rekke ekspresjonsplasmider som er bygget med OE-PCR, ble mange tradisjonelle ekspresjonskloning kassetter fremstilt og kan anvendes for å fremstille praktisk talt et hvilket som helst protein av interesse i-ramme med de fluorescerende proteiner EGFP, Venus, og mCherry, smeltet ved enten amino- eller terminale ender. Slike ekspresjonskassetter er tilgjengelig på forespørsel.
En periode med "genomics" har gitt en enestående volum av og tilgang til meningsfylt data. Imidlertid fortsetter å utvide gapet mellom genet oppdagelse og tilordningen av funksjonen til genprodukter; dermed blir ytterligere empiriske verktøy desperat behov for å akselerere funksjonell genomforskning. Mens, gen-redigering og andre in vivo genmanipulering systemer kan bidra til et typiske fremgangsmåter for å tilordne genfunksjon, vil heterologe protein ekspresjonssystemer sannsynligvis være av stor betydning for den biomanufacture av verdifulle proteiner og for dechiffrering proteinstruktur og funksjon. Denne protokollen beskriver en fremgangsmåte til den forbedrede konstruksjon av ekspresjonsplasmider og den forbigående ekspresjon av rekombinante proteiner i insektceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi takker Lynn Forlow-Jech og Dannialle LeRoy for teknisk assistanse. Dette arbeidet ble støttet av basen CRIS midler til USDA ARS, National Program 304 - Crop Protection og karantene [Prosjekt # 2020-22620-022-00D] til JAF og JJH Omtale av varemerker eller kommersielle produkter i denne artikkelen er utelukkende for å gi spesifikk informasjon og innebærer ikke en anbefaling eller godkjenning av US Department of Agriculture. USDA er en lik mulighet leverandør og arbeidsgiver.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KOD DNA Polymerase | EMD Millipore | 71085-3 | High-fidelity DNA polymerase used for PCR amplification of overlap extension PCR products |
| ExTaq DNA Polymerase | TaKaRa-Clontech | RR001B | DNA polymerase used for A-tailing of PCR products |
| EconoTaq PLUS GREEN 2x DNA Polymerase Master Mix | Lucigen | 30033-1 | DNA polymerase used for bacterial colony PCR |
| Biometra TProfessional Gradient Thermocycler | Biometra/LABRepCo | 070-851 | |
| Agarose LE | Benchmark Scientific | A1705 | |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher | S33102 | |
| Montage DNA Gel Extraction Kit | EMD Millipore | LSKGEL050 | |
| pIB/V5-His TOPO TA Expression Kit | ThermoFisher | K89020 | Contains components needed to clone overlap extension PCR products, including linearized and topoisomerase I-activated pIB/V5-His-TOPO vector, One Shot TOP10 chemically competent E. coli, and salt solution. |
| QIAprep Spin MiniPrep Kit | Qiagen | 27104 | |
| QIAcube Robotic Workstation | Qiagen | 9001292 | |
| Purifier Vertical Clean Bench | Labconco | 3970401 | |
| Tni cultured insect cell Line | Allele Biotech | ABP-CEL-10005 | |
| Sf9 cultured insect cell Line | Allele Biotech | ABP-CEL-10002 | |
| Serum-Free Insect Culture Medium | Allele Biotech | ABP-MED-10002 | |
| TNM-FH Insect Culture Medium | Allele Biotech | ABP-MED-10001 | |
| IPL-41 Insect Medium | ThermoFisher | 11405081 | |
| Cellfectin II Transfection Reagent | ThermoFisher | 10362100 | |
| 16 cm Disposable Cell Scrapers | Sarstedt | 83.1832 | Cell scrapers with two-position blade |
| 25 cm2 (T25) Tissue Culture Flasks with Vent Filter Caps | Life Science Products | CT-229331 | |
| Transfer Pipets | Fisher | 1371120 | |
| Sterile, 50 mL Bio-Reaction Tubes | Life Science Products | CT-229475 | |
| PipetteBoy | VWR | 14222-180 | |
| 5 mL Serological Pipettes | Sarstedt | 86.1253.001 | |
| 0.5 mL Flat-Cap PCR Tubes | Fisher | 14230200 | |
| Polypropylene Biohazard Autoclave Bags | Fisher | 01828C | |
| 35 mm #1.5 Glass Bottom Dishes | Matsunami Glass | D35-14-1.5-U | 35 mm dish diameter, 14 mm glass diameter, 1.5 mm glass thickness, uncoated |
| Incubator, Model 1510E | VWR | 35823-961 | |
| Countess II FL Cell Counter | ThermoFisher | AMQAF1000 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides with 0.4% Trypan Blue Reagent | ThermoFisher | C10228 | |
| Fluoview FV10i-LIV Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | FV10i-LIV | |
| HsPLA2/pCS6 plasmid DNA | transOMIC Technologies | TCH1303 | |
| pmCherry Vector | Clontech | 632522 | |
| NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) | ThermoFisher | R37605 |
References
- Kost, T. A., et al. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat. Biotechnol. 23 (5), 567-575 (2005).
- van Oers, M. M., et al. Thirty years of baculovirus-insect cell protein expression: from dark horse to mainstream technology. J. Gen. Virol. 96 (1), 6-23 (2015).
- Contreras-Gòmez, A., et al. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnol. Progr. 30 (1), 1-18 (2014).
- Hunt, I. From gene to protein: a review of new and enabling technologies for multi-parallel protein expression. Protein Expres. Purif. 40 (1), 1-22 (2005).
- Kollewe, C., Vilcinskas, A. Production of recombinant proteins in insect cells. Am. J. Biochem. Biotechnol. 9 (3), 255-271 (2013).
- Altmann, F., et al. Insect cells as hosts for the expression of recombinant glycoproteins. Glycotechnology. Berger, E. G., Clausen, H., Cummings, R. D. , Springer. Boston, MA. 29-43 (1999).
- Shen, X., et al. A simple plasmid-based transient gene expression method using High Five cells. J. Biotechnol. 216, 67-75 (2015).
- Chen, H., et al. Rapid screening of membrane protein expression in transiently transfected insect cells. Protein Expres. Purif. 88 (1), 134-142 (2013).
- Shen, X., et al. Virus-free transient protein production in Sf9 cells. J. Biotechnol. 171, 61-70 (2014).
- Loomis, K. H., et al. InsectDirect System: rapid, high-level protein expression and purification from insect cells. J. Struct. Funct. Genomics. 6 (2), 189-194 (2005).
- Wurch, T., et al. A modified overlap extension PCR method to create chimeric genes in the absence of restriction enzymes. Biotechnol. Tech. 12 (9), 653-657 (1998).
- Woodman, M. E. Direct PCR of intact bacteria (colony PCR). Curr. Protoc. Microbiol. 9 (3), 1-6 (2008).
- Cell Culture Basics Handbook. , ThermoFisher Scientific. Available from: http://www.thermofisher.com/us/en/home/references/gibco-cell-culture-basics.html?cid=fl-cellculturebasics, Pub. no. MAN0002734 Rev A.0 (2014).
- Mathew, L. G., et al. Identification and characterization of functional aquaporin water channel protein from alimentary tract of whitefly, Bemisia tabaci. Insect Biochem. Mol. Biol. 41 (3), 178-190 (2011).
- Van Ekert, E., et al. Molecular and functional characterization of Bemisia tabaci aquaporins reveals the water channel diversity of hemipteran insects. Insect Biochem. Mol. Biol. 77, 39-51 (2016).
- Hull, J. J., Brent, C. S. Identification and characterization of a sex peptide receptor-like transcript from the western tarnished plant bug Lygus hesperus. Insect Mol. Biol. 23 (3), 301-319 (2014).
- Maroniche, G. A., et al. Development of a novel set of Gateway-compatible vectors for live imaging in insect cells. Insect Mol. Biol. 20 (5), 675-685 (2011).
- Hull, J. J., et al. Identification of the western tarnished plant but (Lygus hesperus) olfactory co-receptor ORCO: Expression profile and confirmation of atypical membrane topology. Arch. Insect Biochem. 81 (4), 179-198 (2012).
- Lee, J. M., et al. Re-evaluation of the PBAN receptor molecule: Characterization of PBANR variants expressed in the pheromone glands of moths. Front. Endocrinol. 3 (6), 1-12 (2012).
- Fabrick, J. A., et al. Molecular and functional characterization of multiple aquaporin water channel proteins from the western tarnished plant bug, Lygus hesperus. Insect Biochem. Mol. Biol. 45, 125-140 (2014).
- Lu, M., et al. A baculovirus (Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus) repeat element functions as a powerful constitutive enhancer in transfected insect cells. J. Biol. Chem. 272, 30724-30728 (1997).
- Ren, L., et al. Comparative analysis of the activity of two promoters in insect cells. African J. Biotechnol. 10, 8930-8941 (2011).
- Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide. Trends Cell Biol. 19, 649-655 (2009).
- Kohnhorst, C. L., et al. Subcellular functions of proteins under fluorescence single-cell microscopy. Biochim. Biophys. Acta. 1864, 77-84 (2016).
- Zinchuk, V., Grossenbacher-Zinchuk, O. Recent advances in quantitative colocalization analysis: focus on neuroscience. Prog. Histochem. Cytochem. 44, 125-172 (2009).
- Shaner, N. C., et al. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat. Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
- Chalfie, M., et al. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotech. 22 (12), 1567-1572 (2004).
