Summary
Målet med den foreliggende undersøgelse var at udvikle og validere styrken og sikkerheden af spinal adenoassocieret virus 9 (AAV9) -medieret genafgivelse ved anvendelse af en ny subpielgen-afgivelsesteknik hos voksne mus.
Abstract
Den vellykkede udvikling af en subpiel adenoassocieret virus 9 (AAV9) vektorleveringsteknik hos voksne rotter og svin er tidligere rapporteret. Ved anvendelse af subpelt-placerede polyethylenkatetere (PE-10 eller PE-5) til AAV9-tilførsel, er der vist stærk transgenekspression gennem spinalparenchyma (hvidt og gråt stof) i subpielt-injicerede spinal-segmenter. På grund af den brede vifte af transgene musemodeller af neurodegenerative sygdomme er der et stærkt ønske om udvikling af et kraftigt centralt nervesystem (CNS) -targetet vektorafgivelsesteknik hos voksne mus. Følgelig beskriver den foreliggende undersøgelse udviklingen af en spinal subpielvektorindgivelsesindretning og teknik til at muliggøre sikker og effektiv spinal AAV9-afgivelse i voksne C57BL / 6J mus. I spinalt immobiliserede og bedøvede mus blev pia materen (cervikal 1 og lumbal 1-2 spinal segmental niveau) indsnævret med en skarp 34 G nål ved hjælp af en XYZ manipulator. En anden XYZ maNipulator blev derefter brugt til at fremme en stump 36G nål i lændehvirvlen og / eller cervikal subpial space. AAV9-vektoren (3-5 μl; 1,2 x 10 13 genomekopier (gc)), som koder for grønt fluorescerende protein (GFP) blev derefter injiceret subpielt. Efter injektioner blev neurologisk funktion (motor og sensorisk) vurderet periodisk, og dyr blev perfusionsfastgjort 14 dage efter AAV9-afgivelse med 4% paraformaldehyd. Analyse af vandrette eller tværgående rygmarvsektioner viste transgenekspression gennem hele rygmarven, både i grå og hvidt materiale. Derudover blev intense retrogradel-medierede GFP-ekspression set i de nedadgående motoraxoner og neuroner i motorcortexen, nucleus ruber og formatio reticularis. Ingen neurologisk dysfunktion blev registreret hos nogen dyr. Disse data viser, at subpiavevektorafgivelsesteknikken med succes kan anvendes i voksne mus uden at forårsage procedurerelateret rygmarvsskade og er forbundet med stærkt potente transgenproteserSion gennem hele rygsøjlen.
Introduction
Brugen af AAV-vektorer til behandling af en række rygmarvs- og CNS-neurodegenerative lidelser bliver en velmodtaget platform for effektivt at opregulere eller tavse udtrykket af gen (er) af interesse. En af nøglebegrænsningerne til den mere effektive udnyttelse af denne teknologi til behandling af CNS / rygmarvsforstyrrelser er den begrænsede evne til at levere AAV-vektor (er) til den dybe hjerne eller rygmarvsparenchyma hos voksne pattedyr.
Det blev for eksempel demonstreret, at den systemiske afgivelse af AAV9 hos voksne gnavere, katte eller ikke-humane primater kun er moderat effektiv til at inducere transgenekspression i neuroner i hjernen og rygmarven 1 , 2 , 3 . Den mere effektive intratekale afgivelse af AAV9-vektorer har også vist sig at føre til kun begrænset transgenekspression i anatomisk definerede pools af neuroner. Mere specifikt har det været dæmonerAt den cisternal eller lumbo-sacrale intratekale AAV9-afgivelse i ikke-humane primater, svin eller gnavere fører til et højt niveau af transgenekspression i spinale a-motoneuroner og segmentale dorsale rodganglionneuroner. Imidlertid ses minimal eller ingen ekspression i spinalinteruroner eller stigende eller faldende axoner i det hvide stof 4 , 5 , 6 , 7 . Samlet viser disse data, at der eksisterer en yderst effektiv biologisk-anatomisk barriere, som forhindrer diffusion af intrathecalt afgivet AAV til dybere spinalparenchyma.
I en tidligere undersøgelse under anvendelse af voksne rotter og svin blev der udviklet en ny subpielvektor-afgivelsesteknik 8 . Ved anvendelse af denne fremgangsmåde blev meget potent og multisegmental transgenekspression påvist efter en single-bolus subpial AAV9-afgivelse. Intenst GFP-udtryk blev konsekvent setI neuroner, glialceller og nedadgående / stigende axoner gennem de injicerede spinale segmenter. Denne undersøgelse viste for første gang, at pia mater repræsenterer den primære barriere, der begrænser effektiv AAV9 diffusion i spinalparenchyma fra det intratekale rum. Mens denne tidligere udviklede teknik og subpielinjektionsanordning er relativt nem at anvende hos store gnavere (som rotter) eller voksne grise, er systemet ikke egnet til brug i små dyr, såsom voksne mus. På grund af det høje antal tilgængelige transgene musemodeller af en række neurodegenerative lidelser er der et klart behov for udviklingen af en effektiv spinalparenkymalvektor-afgivelsesteknik hos mus. Tilgængeligheden af en sådan teknik vil muliggøre undersøgelse af virkningen af specifik gentympning ( f.eks. Ved anvendelse af shRNA) eller opregulering ved anvendelse af celle-ikke-specifikke ( f.eks. Cytomegalovirus-CMV eller ubiquitin) eller cellespecifikke ( f.eks. Synapsin eller glial Fibrillær sureProtein (GFAP)) promotorer under tidlig udvikling efter fødslen eller under syge tilstande.
I den foreliggende undersøgelse har vi derfor udviklet og valideret et miniature subpulsvektorafgivelsessystem, der effektivt kan anvendes i voksne mus. På samme måde demonstrerer dette arbejde, som i tidligere rotte- og grisundersøgelser, kraftig transgenekspression gennem hele spinalparenchymen efter en enkelt-bolus subpiel AAV9-afgivelse i mus. Denne fremgangsmådes enkelhed, den meget gode tolerabilitet for injicerede mus til subpiel AAV9-afgivelse og den høje styrke af transgenekspression i spinalparenchymen antyder, at denne teknik effektivt kan implementeres i en hvilken som helst laboratorieindstilling og anvendes i eksperimenter rettet mod spinalgenekspression.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Disse undersøgelser blev udført i henhold til en protokol godkendt af Instituttet for Dyrpleje og Brug af University of California, San Diego og var i overensstemmelse med Association for Assessment of Laboratory Animal Care retningslinjer for dyrebrug. Alle undersøgelser blev udført på en sådan måde at minimere gruppestørrelse og dyre lidelse.
1. Generel dyr og kirurgisk præparation
- Inden den kirurgiske procedure påbegyndes, tøs viruset (AAV9-UBI-GFP; 5 μl alikvoter) 8 . Forbered en 5% dextran (10.000 MW) opløsning ved at blande dextranpulver i destilleret vand. Bland virusopløsningen med 5% dextranopløsning 1: 1 til en endelig dextrankoncentration på 2,5%.
- Opbevar virusopløsningen på is (4 ° C).
- Brug voksne C57BL / 6J mus (mand og kvinde, 20-30 g). Bedøver de mus ved anvendelse af 5% isofluran (i O2, 1 l / min) og fastholde dem ved 2-3% inhaleret isofluran (i O 2 , 1 L / min) ved næse kegle under operationen, afhængigt af vejrtrækningsraten og paw nippel respons.
- Barber ryggen af dyrene med barberklipper og rengør huden med 2% chlorhexidin.
- I kroniske genopretningsstudier følger en streng steril teknik.
- Hvis lumbal subpial injektioner skal udføres, skære huden overlejre Th8-L1 ryghvirvlerne med en skalpel og løsne paravertebrale muskler fra Th10-12 ryggvirvler ved hjælp af saks.
- Monter dyret i en standard stereotaxisk ramme ved hjælp af musespinalklemmer.
- Barber begge sider af lamellerne på Th10-12-hvirvlerne ved hjælp af en tandboremaskine (bor: 0,9 mm, hastighed: 20.000 omdr./min.), Indtil der forekommer revner.
- Fjern knækede knoglefragmenter med pincet og eksponér den dorsale overflade af lændehvirvelsøjlen.
- Klipp duraen op omkring 1 cm ved hjælp af en 30 G rustfri stålnål og tang.
- Fjern den atlanto-occipitale membran i cisterna magna ved hjælp af en 23 G rustfri stål nål og pincet.
- Rengør snitstedet for væv og knoglerester ved brug af bomuldspindler.
- Klipp duraen op omkring 2-3 mm ved hjælp af en 30 G rustfri stålnål og tang.
2. Åbning af pialmembranen og indsættelse af undernål for AAV9-levering
- Monter den 34 G pia-penetrerende nål i Z-armen af en XYZ-manipulator ved hjælp af en glaskapillærholder ( figur 1A og B ).
BEMÆRK: For at fremstille den pia-penetrerende nål skærpes den oprindelige afskårne spids af 34G-nålen ved hjælp af en glaskapillarformator med diamantslibeplade - groft (5,0 μm til 50 μm tipstørrelser) og slibevinkel på15 - 20 °. Nålens spids (1 mm længde målt fra spidsen) bøjes forsigtigt til ca. 90 ° ( figur 1B , venstre indsats). - Ved hjælp af et kirurgisk dissekeringsområde, der er sat til 8-10 X forstørrelse, trænger du ind i pia med den pia-penetrerende nål med ca. 1 mm ( figur 1C ) ved hjælp af X-armen.
- Hold vinklen på den penetrerende nål til vævsoverfladen ved 5-10 °.
- Efter pia-åbningen skal du fjerne den pia-penetrerende nål vandret fra underområdet ( figur 1 D) ved hjælp af X-armen.
BEMÆRK: Husk det gennemtrængte sted ved et vartegn, såsom et blodkar. - Indlæs en blunt 36G injektionsnål med AAV9-UBI-GFP virus ved hjælp af en 50 μl mikrosprøjte forbundet til injektionsnålen med PE-10 eller PE-20 rør.
- Monter nålen i Z-armen af en anden XYZ-manipulator ( Figur 1A B ) ved hjælp af en glaskapillærholder ( figur 1B , højre indsats).
BEMÆRK: For at fremstille subspiel AAV9 injektionsnål, poleres den stumpe spids af en 36 G nål ved hjælp af en glaskapillær beveller med diamant slibeplade - groft (5,0 μm til 50 μm spidsstørrelser) for at fjerne skarpe kanter. Nålens spids (2-3 mm længde målt fra spidsen) bøjes forsigtigt til ca. 90 °. De pia-penetrerende og subpielinjektionsnåle indsættes i 1-2 cm lange 20G slave rustfrit stålrør (10 mm fra nålens ende) og limes med epoxy. Brug af 20 G (0.91 mm diameter) rør er nødvendig for sikker fastgørelse til glaskapillærholderen. - Ved at manipulere den anden manipulators X, Y og Z arme, anbringes spidsen af AAV9-injektionsnålen i det pia-penetrerede sted og derefter forskydes den ca. 2-3 mm ind i underrummet gennem den tidligere pialmembranåbning ved hjælp af X-arm( Figur 1E og F ).
BEMÆRK: 1) AAV9-UBI-GFP'et fremstilles i overensstemmelse med tidligere rapporterede protokol 9 , 10 , og de endelige titere justeres til 1,2 x 10 13 genomkopier pr. ML (gc / mL). 2) Der er ikke behov for at markere stedet for pial åbningen, fordi det er let identificerbart ( Figur 1D ). - Injicer AAV9-UBI-GFP (1,5, 3 eller 5 μL) i subpielrummet ved anvendelse af en 50 μl mikrosprøjte (se tabel 1 for eksperimentelle grupper).
- Fjern injektionsnålen fra underrummet efter at AAV9-UBI-GFP-injektionen er afsluttet.
- Luk muskler og hud ved hjælp af 4,0 monofilament sutur og kirurgiske klip.
BEMÆRK: Det er ikke nødvendigt at forsegle den åbne hvirvel. - Lad dyrene komme sig på en varmepude.
- Til smertekontrol injiceres buprenorphin 0,05 mg / kg / sc hver 12. time2-3 dage efter operationen.
3. Perfusion-fixation, vævscryoprotektion og immunfluorescensfarvning
- På et forudbestemt tidspunkt efter subspiel AAV9-injektionerne bedøves musene med eutanasiopløsning (se Materialetablet 0,3 ml) og transkartisk perfuserer dem med 20 ml hepariniseret saltopløsning efterfulgt af 20 ml 4% paraformaldehyd i PBS.
- Dissect rygmarv og hjerner ved hjælp af en knoglerør og efterfiks dem i 4% formaldehyd i PBS natten over ved 4 ° C.
- Cryoprotect rygsøjlen og hjernen med 30% saccharose i PBS i mindst 5-7 dage.
- Skær koronal, tværgående eller langsgående / vandrette frosne sektioner (30 μm-tykke) på en kryostat og opbevar dem i PBS ved 4 ° C.
4. Immunofluorescens Farvning af rygmarv og hjerneafsnit (Se Materialebordet)
- Inkubér fritflydende sektioner i primarY antistoffer natten over.
- Efter inkubation med primære antistoffer vaskes sektionerne tre gange i PBS og inkuberes med fluorescens-konjugeret æsel-anti-kanin, æsel-anti-kylling og æsel-anti-gede sekundære antistoffer.
- Monter sektionerne på mikroskopi dias, tør dem ved stuetemperatur og dække dem med et anti-fade medium.
- Fang billeder ved brug af epifluorescensfluorescensmikroskop (mål: 10X, NA-0.3, 20X, NA-0.8 og 63X, NA-1.4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Potent Transgen Expression i SubPolly AAV9-injicerede Segmenter:
Analysen af transgen (GFP) -ekspression i rygmarvsektioner efter 14 dage efter AAV9-afgivelse viste AAV9-dosisafhængig GFP-ekspression gennem hele rygsøjlens parenchyma. For det første var to bilaterale 3 μL injektioner af AAV9-UBI-GFP injiceret i det øvre lumbal subpialrum forbundet med den næsten fuldstændige infektion af det hvide og grå stof i hele lændehvirvelsøjlen, der strækker sig til de øvre brystkroppssegmenter ( figur 2A Og 2B , venstre og midterste kolonner). To bilaterale 1,5 μL injektioner af AAV9-UBI-GFP i det øvre lumbal subpialrum blev associeret med en lignende næsten fuldstændig infektion af det hvide og grå stof i hele lændehvirvelsøjlen (som set efter injektioner på 3 μl); Midter thorax segmenterne viste dog kun lejlighedsvis inficerede neuroner (Ass = "xfig"> Figur 2B, højre kolonne). Farvning med α-motoneuronspecifikke (ChAT) og neuronspecifikke (NeuN) antistoffer udviste konsistent GFP-ekspression i hele populationen af lumbal α-motoneuroner ( Figur 2C ) og interneuroner lokaliseret i dorsalhornet ( Figur 2D ), mellemzone ( Figur 2E ) og ventralhorn ( figur 2F ). For det andet førte to bilaterale livmoderhalske injektioner af AAV9 (5 μL for hver injektion) til en lignende GFP-ekspression i det hvide og grå stof i hele cervikal rygmarven (grå og hvid stof) og i de øvre brystsegmenter ( Figur 3A og 3B ) . Analyse af lændehvirvelsøjlen i de samme dyr udviste en høj densitet af GFP + nedadgående axoner, der afsluttede i nærheden af lumbal GFP-negative α-motoneuroner og interneuroner ( Figur 3COg 3D ). Leveringen af to bilaterale cervicale og to bilaterale øvre lumbalinjektioner af AAV9 (5 μl for hver injektion) var forbundet med GFP-ekspression i hele rygmarven, fra de øvre cervikale til sakrale segmenter og var homogent til stede i det hvide og grå stof ( Figur 3E- 3H ).
Retrograd og anterograd Transport-medieret transgenudtryk i supraspinal motor og sensoriske centre:
Udbredt GFP-ekspression i lændehvirvlen eller cervikal rygmarven efter subpial AAV9-afgivelse var forbundet med robust retrograd- og anterogradinfektion-medieret GFP-positivitet i de supraspinale nedadgående axoner og deres fremspringende neuroner og i axoner og terminaler af stigende kanaler ( figur 4 ). Således blev intens GFP positivitet set i neuroner lokaliseret i retikulære dannelse (RF), Nucleus ruber (NR) og motor cortex (MC) ( figur 4B- 4D ). Tilsvarende blev klar GFP-immunreaktivitet set i terminalerne af spinocerebellar (SCT), spinoretikulære og spinotalamiske kanaler (STT) ( Figur 4B- 4D ).
Figur 1 : Eksperimentel opsætning til at udføre spinale subpielle injektioner i en voksen mus. ( A ) For at udføre spinale subpielinjektioner hos voksne mus anvendes to separate XYZ manipulatorer (I og II). ( B ) Z-armen af hver manipulator har en glaskapillærholder. En kapillærholder holder den pia-penetrerende 34 G nål, og den anden holder den blanke 36 G subpielinjektionsnål. ( C , D , E og F) Billeder, der viser positionen af pia-penetrationsnålen lige efter pia-punkteringen ( C ; dura-materien er allerede fjernet) efter fjernelse af den pia-penetrerende nål ( D ) efter indsættelse af spidsen af subjektionsnålen ( E ) og efter at have ført indsprøjtningsnålen 3 mm ind i underrummet ( F ). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2 : Potent spinal parenchymal GFP ekspression efter lumbal subpial AAV9-UBI-GFP levering i voksne mus. ( A ) To bilaterale injektioner af AAV9-UBI-GFP (1,5 eller 3 μl injektioner hver) blev leveret ind i den øvre lændehals sUbspialt rum og dyr perfusion-fikseret 14 dage efter AAV9-afgivelse. ( B ) Intensiv GFP-ekspression i det grå (inden for det prikkede område) og det hvide stof, der strækker sig fra lændehvirvlen til de øvre brystsegmenter, kan ses hos dyr injiceret med 3 + 3 μL AAV9 (venstre og midterste kolonner). ( C, D, E og F ) Co-farvning af tværgående rygmarvsektioner taget fra lændehalsforstørrelsen hos dyr injiceret med 3 + 3 μL AAV9 viser GFP-ekspression i stort set alle ChAT- (a-motoneuronmarkør) -positive α- Motoneuroner ( C og F ) og NeuN-positive interneuroner i dorsalhornet ( D ) og mellemzonen ( E ). Skalestænger = 1000 μm (B); 30 μm (C); 100 μm (DF). DH: dorsal horn; LV: lamina V; VH: ventral horn. Klik her for at se en større veRsion af denne figur.
Figur 3: Sammenligning af spinal GFP-ekspression efter spinal subpial cervical versus spinal subpial cervical plus subpial lumbar AAV9-UBI-GFP-levering i voksne mus. ( A, B, C og D ) Horisontal sektion skåret gennem hele længden af rygmarven i et dyr, der tidligere har modtaget øvre cervikale subpialinjektioner af AAV9-UBI-GFP (5 + 5 μl). Intenst GFP-udtryk i det hvide og grå stof i cervikalområdet kan ses ( B ). I lændehvirvelsøjlen kan en høj densitet af GFP + nedadgående axoner i lateral funiculus (LF) og det grå stof mellem NeuN-positive, men GFP-negative neuroner identificeres ( C og D ). ( E, F, G og H Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4
| Eksperimentelle grupper | Websted / niveau for levering af AAV9 (*) | Volumen af AAV9 inj, infusionshastighed | Overlevelsestid | Vævsanalyse |
| Gruppe A (n = 7) | C2 (bilaterale) | 5 μl / 5 min | 14 dage | Hjerne + rygmarv |
| Gruppe B (n = 12) | L1-L2 (bilaterale) | 1,5 μl eller 3 μl, 60 sek / μl | 14 dage | Hjerne + rygmarv |
| Gruppe C (n = 6) | C2 + L1-L2 (bilaterale på hvert niveau) | 5 μl / 5 min | 14 dage | Rygrad |
| * - bilateralt= To subpuljeinjektioner, der leveres til højre og et til venstre subpielrum for indsprøjtede segment (er) udføres. | ||||
Tabel 1: Eksperimentelle grupper. Alle forsøg blev udført i voksne C57BL / 6J mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den foreliggende undersøgelse beskriver en teknik med subpiel vektor (AAV9) levering i voksne mus. Som det fremgår af den medfølgende video, kan denne fremgangsmåde og teknik effektivt anvendes, forudsat at de krævede instrumenter og pia-penetrerende nål og subpielindsprøjtningsnål fremstilles korrekt i overensstemmelse med de etablerede og testede specifikationer.
Kritiske tekniske variabler i udførelse af en konsistent og sikker subpielinjektion hos mus:
Som vist kan en subpielinjektion let udføres i voksne bedøvede mus efter en dorsal cervikal eller lumbal laminektomi. Der er flere kritiske tekniske variabler, der definerer succesen med subpielinjektionsteknikken. For det første skal spidsen af 34 G pia-penetrerende nål konsistent skærpes ved hjælp af en beveller for at sikre glat punktering af pia. Eventuelle uoverensstemmelser i teknikken til hvordan nålen skærpes kan føre til difficuLette under pia penetration og / eller kan forårsage spinale skade ved at bruge for meget kraft til at punktere pia. Under normale omstændigheder (som vist i videoen og i figur 1C og D ) viser stedet for pia-åbningen intet tegn på rygmarvsskade eller subpielblødning. I nogle tilfælde kan nogle subpielblødninger ses, men det viste sig ikke at være forbundet med neurologisk dysfunktion eller ændret genekspression efter AAV9-afgivelse. For det andet er det vigtigt at holde det kirurgiske sted fri for blod efter at dura er fjernet ved hjælp af elektrocautery. Enhver plettet blodrest kan skjule den pålidelige identifikation af piaoverfladen, selvom et kirurgisk mikroskop anvendes. Som vist i figur 1C-F kan et blodfri laminektomi-site effektivt opretholdes under anvendelse af små gelskumstykker til at dække den laminektomiserede hvirvel og omgivende blødt væv. For det tredje skal der lægges særlig vægt på korrekt placering af bedøvede dyr iSpinalramme og til immobilisering af rygsøjlen ved hjælp af spinalklemmer. Brug af for meget tryk under placeringen af rygklemmer kan forårsage rygsygdomme; Brug af utilstrækkeligt tryk kan føre til en progressiv løsning af den immobiliserede hvirvel, hvilket typisk sker, når en tandboremaskine anvendes til at udføre laminektomi.
Volumenet af subpially-injiceret AAV9 korrelerer med størrelsen af rostro-kaudal transgenekspression. Anvendelsen af to lumbal bilaterale subpiale AAV9-injektioner (3 + 3 μL eller 5 + 5 μL) blev således associeret med konsistent GFP-ekspression i hele lumbalgrå og hvidt stof, der strækker sig op til de øvre brystsegmenter. Der var minimal variabilitet på tværs af de anvendte dyr. AAV9 indsprøjtningsvolumener på 1,5 + 1,5 μl førte til tilsvarende GFP-ekspression i segmenterne lokaliseret i nærheden af injektioner; Spredningen af viruset og den resulterende GFP-ekspression var imidlertid begrænset i brystsegmenterne ( Begrænsning af sub-gengen leveringsteknik: Fremtidige applikationer af SubpiAl Gene Leveringsteknik: For eksempel forventes det ved anvendelse af shRNA-silerende vektorer, at et yderst effektivt fald i ekspressionen af muterede gener ( fx SOD i tilfælde af den arvede form af ALS) opnås gennem hele rygmarven såvel som i spinalt -projektive hjernemotorkerner. Anden,På grund af den stærkt effektive infektion af spinalhvide-stof-axonerne kan terapeutiske gener ( fx kodende for vækstfaktorer) opreguleres for at fremme axonal spiring i spinal-traume-skadede dyr. For det tredje ved at manipulere volumenet eller titeren af subpiel-leveret virus såvel som stedet for subpielinjektion, kan transgenet udtrykkes til et diskret område af rygmarven ( f.eks. Det ensidige dorsalhorn). Lokaliseret transgenekspression kan potentielt anvendes til smerte- eller muskelspasticitetsmodificerende behandling ved opregulerende inhibitoriske neurotransmittersystemer ( f.eks. GABA) eller hæmmende excitatoriske systemer ( fx det glutamat-koblede receptorsystem). For det fjerde vil der i tillæg til AAV-afgivelse sandsynligvis mere effektivt leveres til spinalparenchyma efter subpial-afgivelse andre molekyler eller vektorer med dårlig blod-hjernebarrierepermeabilitet ( f.eks. Mikro-RNA). Disse kan effektivt testes af usinG teknikken beskrevet i dette manuskript. Endelig, som demonstreret i den nuværende undersøgelse, kan subpielteknikken med succes anvendes til voksne mus med gennemsnitlige kropsvægt (BW) mellem 20 og 30 g. Det er således sandsynligt, at den samme teknik og eksperimentelle opsætning kan anvendes i andre dyrearter med lignende BW ( f.eks. Sprague-Dawley (SD) rottepupper). BW af P6 og P21 SD rotter er henholdsvis 17 og 62 g. Brug af rottepupperne i den tidlige fase af postnatal udvikling kan være et nyttigt redskab til at studere rollen som specifik gen up- eller downregulation i udviklingen af spinal neurale kredsløb og sensorisk og motorisk behandling.
En af de relative begrænsninger af subpialinjektionsteknikken (i sammenligning med intratekal levering) er den mere invasive karakter af denne fremgangsmåde, når en dorsal laminektomi skal udføres for at give adgang til rygsøjlens dorsale overflade. Imidlertid synes det kraftige transgenudtryk, der ses gennem rygmarven og i de supraspinale hjernecentre, at demonstrere den klare fordel i forhold til intratekal AAV-afgivelse, som er karakteriseret ved selektiv transgenekspression i en subpopulation af a-motoneuroner og primære afferenter (men er ikke til stede I neuroner i den dybere rygmarvslaminat) 8 .
På samme måde, som det fremgår af tidligere undersøgelser hos voksne rotter og svin, kan høj effektiv transgenekspression opnås i spinalhvid og gråstof i voksne mus ved anvendelse af subpiel AAV9-tilførsel. På grund af de relativt mindre dimensioner (især længden) af muses rygmarv er tilførslen af AAV9 på kun to rygmarvsniveauer (øvre halshvirvel og øvre lumbal) tilstrækkelig til at føre til næsten fuldstændig rygmarvsinfektion. Denne karakteristika kan have en vigtig implikation i udformningen af specifikke sygdomsmodificerende behandlingsmetoder ved enten målrettet gentympning eller opregulering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Martin Marsala er medstifter af Neurgain Technologies, Inc. (San Diego, USA).
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af SANPORC og ALSA Foundation grant (Martin Marsala); Det nationale bæredygtighedsprogram, projektnummer LO1609 (Tjekkisk Ministerium for Uddannelse, Ungdom og Sport); Og RVO: 67985904 (Stefan Juhas og Jana Juhasova).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J Mice | Jackson Labs | 664 | |
| Lab Standard Stereotaxic for Mice | Harvard Apparatus | 72-9568 | |
| Mouse Spinal Adaptor | Harvard Apparatus | 72-4811 | |
| XYZ Manipulator | Stoelting | 51604 | |
| Manual Infusion Pump | Stoelting | 51218 | |
| 34G Beveled Nanofill Needle | World Precision Instruments | NF34BV-2 | |
| 36G Blunt Nanofill needle | World Precision Instruments | NF-36BL-2 | |
| Fluriso, Isoflurane | MWI Veterinary Supply | 502017 | |
| Chlorhexidine Solution | MWI Veterinary Supply | 501027 | |
| 20G Stainless Steel Needle | Becton-Dickinson | 305175 | |
| 23G Stainless Steel Needle | Becton-Dickinson | 305145 | |
| 30G Stainless Steel Needle | Becton-Dickinson | 305128 | |
| Cotton Tipped Applicator | MWI Veterinary Supply | 27426 | |
| Glass Capillary Beveller | Narishige International | SM-25B | |
| Slide Microscope Superfrost | Leica Microsystems | M80 | |
| 50 μL Microsyringe | Hamilton | 81242 | |
| BD Intramedic PE-20 Tubing | Becton, Dickinson | 427406 | |
| BD Intramedic PE-10 Tubing | Becton, Dickinson | 427401 | |
| 4-0 monofilament suture | VetOne | V1D397 | |
| Glass Capillary Beveller | Narishige | Pipet Micro Grinder EG-40 | |
| 5 min Epoxy (Epoxy Clear) | Devcon | 14310 | |
| Euthanasia Solution | MWI Veterinary Supply | 11168 | |
| Heparin Inj 1,000 U/mL | MWI Veterinary Supply | 54254 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Anti NeuN Antibody | EMD-Millipore | ABN78 | Primary Rabbit Polyclonal Antibody, 1:1000 |
| Anti-Choline Acetyltransferase (CHAT) Antibody | EMD-Millipore | AB144P | Primary Goat Polyclonal Antibody, 1:100 |
| Anti GFP Antibody | Aves Labs | GFP-1020 | Primary Chicken Polyclonal Antibody, 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A21207 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 680 | ThermoFisher Scientific | A10043 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Donkey anti-Chicken IgY Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Jackson Immunoresearch Labs | 703-545-155 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Donkey Anti-Goat IgG H&L (Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150131 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Slide Microscope Superfrost | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Fisher Scientific | P36930 | |
| Epifluorescence Microscope | Zeiss | Zeiss AxioImager M2 | |
| Fluorescence Confocal Microscope | Olympus | Olympus FV1000 | |
| Dextran | Polysciences, Inc | 19411 | |
| AAV9-UBC-GFP | UCSD Viral Vector Core Laboratory |
References
- Foust, K. D., et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2009).
- Duque, S., et al. Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons. Mol Ther. 17 (7), 1187-1196 (2009).
- Gray, S. J., et al. Preclinical differences of intravascular AAV9 delivery to neurons and glia: a comparative study of adult mice and nonhuman primates. Mol Ther. 19 (6), 1058-1069 (2011).
- Meyer, K., et al. Improving single injection CSF delivery of AAV9-mediated gene therapy for SMA: a dose-response study in mice and nonhuman primates. Mol Ther. 23 (3), 477-487 (2015).
- Foust, K. D., et al. Therapeutic AAV9-mediated suppression of mutant SOD1 slows disease progression and extends survival in models of inherited ALS. Mol Ther. 21 (12), 2148-2159 (2013).
- Passini, M. A., et al. Translational fidelity of intrathecal delivery of self-complementary AAV9-survival motor neuron 1 for spinal muscular atrophy. Hum Gene Ther. 25 (7), 619-630 (2014).
- Bell, P., et al. Motor neuron transduction after intracisternal delivery of AAV9 in a cynomolgus macaque. Hum Gene Ther Methods. 26 (2), 43-44 (2015).
- Miyanohara, A., et al. Potent spinal parenchymal AAV9-mediated gene delivery by subpial injection in adult rats and pigs. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16046 (2016).
- Xu, Q., et al. In vivo gene knockdown in rat dorsal root ganglia mediated by self-complementary adeno-associated virus serotype 5 following intrathecal delivery. PLoS One. 7 (3), 32581 (2012).
- Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus. J Virol. 72 (3), 2224-2232 (1998).
