Summary
Målet med den föreliggande studien var att utveckla och validera styrkan och säkerheten hos spinal adenoassocierad virus 9 (AAV9) -medierad genavgivning genom att använda en ny sub-gengenleveranssteknik i vuxna möss.
Abstract
Den framgångsrika utvecklingen av en subeniell adenoassocierad virus 9 (AAV9) vektortillförselsteknik hos vuxna råttor och svin har tidigare rapporterats. Med användning av subpellentplacerade polyetenkatetrar (PE-10 eller PE-5) för AAV9-tillförsel har starkt transgenuttryck genom spinalparenchyma (vitt och grått ämne) i subpially-injicerade ryggsegment visat sig. På grund av det brett spektrumet av transgena musmodeller av neurodegenerativa sjukdomar finns det en stark önskan att utveckla en kraftig centreringssystem (CNS) med målinriktade vektorleveranser i vuxna möss. Följaktligen beskriver den föreliggande studien utvecklingen av en spinal subpiell vektoravgivningsanordning och teknik för att möjliggöra säker och effektiv spinal-AAV9-leverans i vuxna C57BL / 6J-möss. I spinalt immobiliserade och bedövade möss skärs pia materen (cervikal 1 och ländryggen 1-2 spinal segmentnivå) med en skarp 34 G nål med användning av en XYZ manipulator. En andra XYZ maNipulatorn användes sedan för att förflytta en trubbig 36G nål till ländryggen och / eller livmoderhalsunderlaget. Den AAV9 vektorn (3-5 pl; 1,2 x 10 13 genomet kopior (gc)) som kodar för grönt fluorescerande protein (GFP) var injicerades sedan subpially. Efter injektioner utvärderades den neurologiska funktionen (motorisk och sensorisk) periodiskt och djur perfusionsfixerades 14 dagar efter AAV9-tillförsel med 4% paraformaldehyd. Analys av horisontella eller transversala ryggmärgsektioner visade transgenuttryck i hela ryggmärgen, både i grå och vit materia. Dessutom sågs intensivt retrogradel-medierat GFP-uttryck i de nedåtgående motoraxonen och neuronerna i motorcortexen, kärnrubbningen och formatio reticularis. Ingen neurologisk dysfunktion noterades i några djur. Dessa data visar att subpialvektortillförselstekniken framgångsrikt kan användas i vuxna möss utan att orsaka procedurrelaterad ryggmärgsskada och är associerad med högeffektiva transgena uttryckSion genom hela ryggmärgsneuraxen.
Introduction
Användningen av AAV-vektorer för att behandla en rad ryggmärgs- och CNS-neurodegenerativa störningar blir en väl accepterad plattform för att effektivt uppreglera eller tysta uttrycket av gen (er) av intresse. En av de viktigaste begränsningarna för det mer effektiva utnyttjandet av denna teknik för behandling av CNS / ryggmärgsstörningar är den begränsade förmågan att leverera AAV-vektor (er) till den djupa hjärnan eller ryggmärgsparenchymen hos vuxna däggdjur.
Det visades exempelvis att den systemiska avgivningen av AAV9 hos vuxna gnagare, katter eller icke-humana primater endast är måttligt effektiv vid inducering av transgenuttryck i neuroner i hjärnan och ryggmärgen 1 , 2 , 3 . Den mer effektiva intratekala leveransen av AAV9-vektorer har också visat sig leda till endast begränsat transgenuttryck i anatomiskt definierade bassänger av neuroner. Mer specifikt har det varit demonerTrated att den cisternal eller lumbo-sacral intratekal AAV9-leveransen i icke-humana primater, grisar eller gnagare leder till en hög nivå av transgenuttryck i spinal-a-motoneuroner och segmentala dorsala rotganglionneuroner. Minst eller inget uttryck i spinalinteruroner eller stigande eller fallande axoner i den vita substansen ses dock 4 , 5 , 6 , 7 . Sammantaget visar dessa data att en hög effektiv biologisk-anatomisk barriär finns, vilket förhindrar diffusion av intratekalt levererad AAV till djupare ryggradsparenchyma.
I en tidigare studie med användning av vuxna råttor och grisar utvecklades en ny subpielvektoravgivningsteknik 8 . Med användning av detta tillvägagångssätt demonstrerades starkt och multisegmentalt transgenuttryck efter en subkulär AAV9-leverans med en-bolus. Intensivt GFP-uttryck observerades konsekventI neuroner, glialceller och nedåtgående / stigande axoner genom de injicerade ryggradssegmenten. Denna studie visade för första gången att pia-materen representerar den primära barriärbegränsande effektiva AAV9-diffusionen i ryggradsparenchymen från det intratekala utrymmet. Även om denna tidigare utvecklade teknik och subpialinjektionsanordning är relativt lätt att använda hos stora gnagare (som råttor) eller vuxna grisar, är systemet inte lämpligt för användning i små djur, såsom vuxna möss. På grund av det höga antalet tillgängliga transgena musmodeller av en mängd neurodegenerativa störningar föreligger ett tydligt behov av utveckling av en effektiv spinalparenkymalvektortillverkningsteknik hos möss. Tillgängligheten av en sådan teknik skulle möjliggöra studier av effekten av specifik genavstämning ( t.ex. användning av shRNA) eller uppreglering med användning av cellspecifik ( t.ex. cytomegalovirus-CMV eller Ubiquitin) eller cellspecifik ( t.ex. synapsin eller glial Fibrillärt surtProtein (GFAP)) promotorer under tidig postnatalt utveckling eller under sjuka tillstånd.
Följaktligen har vi i den föreliggande studien utvecklat och validerat ett miniatyr subpulsvektoravgivningssystem som effektivt kan användas i vuxna möss. På samma sätt, som i tidigare råtta och grisstudier, demonstrerar detta arbete starkt transgenuttryck i hela ryggmärgs parenchymen efter en leverans med en-bolus subpial AAV9 hos möss. Enkelheten i detta tillvägagångssätt, den mycket goda toleransen hos injicerade möss till subpiel AAV9-leverans och den höga styrkan hos transgenuttryck i ryggmärgs parenchymen antyder att denna teknik effektivt kan implementeras i vilken laboratorieinställning som helst och användes i experiment som riktar sig mot spinal-genuttryck.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dessa studier genomfördes enligt ett protokoll som godkändes av Institutionen för djurvård och användning av University of California, San Diego och överensstämde med Föreningen för bedömning av laboratorie djurvård riktlinjer för djuranvändning. Alla studier utfördes på ett sådant sätt som att minimera gruppstorlek och djurlidande.
1. Allmän djur- och kirurgisk beredning
- Innan det kirurgiska förfarandet påbörjas, tina viruset (AAV9-UBI-GFP; 5 μl alikvoter) 8 . Förbered en 5% dextran (10 000 MW) lösning genom att blanda dextranpulver i destillerat vatten. Blanda viruslösningen med 5% dextranlösning 1: 1 till en slutlig dextrankoncentration på 2,5%.
- Förvara viruslösningen på is (4 ° C).
- Använd vuxna C57BL / 6J möss (man och kvinna, 20-30 g). Söva de möss med användning av 5% isofluran (i O 2, 1 L / min) och bibehålla dem vid två-3% inhaleras isofluran (i O 2, 1 L / min) genom noskonen under kirurgi, beroende på andningshastigheten och tassens nypa respons.
- Barbera djurens baksida med barberklippare och rengör huden med 2% klorhexidin.
- I kroniska återhämtningsstudier följer en strikt steril teknik.
- Om lumbar subpial injektioner ska utföras, skära huden överlagring av Th8-L1 kotorarna med en skalpell och lossa paravertebral muskeln från Th10-12 ryggvirveler med hjälp av sax.
- Montera djuret i en vanlig stereotaxisk ram med hjälp av muskelspindlar.
- Raka båda sidor av lamellen i Th10-12 ryggkotorna med en tandborrning (borr: 0,9 mm, varvtal: 20 000 rpm) tills sprickor uppträder.
- Ta bort knäckta benfragment med pincett och exponera dorsala ytan på ryggmärgen.
- Klipp upp dura ca 1 cm med en 30 G rostfritt stål nål och pincett.
- Ta bort det atlanto-occipitala membranet i cisterna magna med hjälp av en 23G rostfritt stål nål och tång.
- Rengör snittstället för eventuellt vävnads- och benavfall genom att använda bomullspinne.
- Klipp upp dura ca 2-3 mm med en 30 G rostfritt stål nål och pincett.
2. Öppning av pialmembranen och infogning av undernål för AAV9-leverans
- Montera den 34 G-penetrerande nålen i Z-armen på en XYZ-manipulator med en glaskapillärhållare ( Figur 1A och B ).
ANMÄRKNING: För att tillverka den pia-penetrerande nålen skärps den ursprungliga fasade spetsen av 34G-nålen med en glaskapillärformare med diamantslipplatta - grov (5,0 μm till 50 μm spetsstorlekar) och slipvinkel av15-20 °. Nålens spets (1 mm längd, uppmätt från spetsen) böjes försiktigt till ca 90 ° ( Figur 1B , vänster insats). - Genom att använda ett kirurgiskt dissekeringsområde, inställt på 8-10 X förstoring, penetrera pia med den pia-penetrerande nålen med ca 1 mm ( Figur 1C ) med hjälp av X-armen.
- Håll vinkeln på den penetrerande nålen till vävnadsytan vid 5-10 °.
- Efter piaöppningen, ta bort den pia-penetrerande nålen horisontellt från underområdet ( Figur 1 D) med hjälp av X-armen.
OBS! Kom ihåg den penetrerade platsen med ett landmärke, som ett blodkärl. - Ladda en slumpig 36G-injektionsnål med AAV9-UBI-GFP-virus med en 50 μl mikrospruta ansluten till injektionsnålen med PE-10 eller PE-20-rör.
- Montera nålen i Z-armen på en andra XYZ-manipulator ( Figur 1A B ) med en glaskapillärhållare ( Figur 1B , höger insats).
ANMÄRKNING: För att tillverka subspiel AAV9-injektionsnål, poleras den stumma spetsen av en 36 G-nål med en glaskapillärhuggare med diamantslipplatta - grova (5,0 μm till 50 μm spetsstorlekar) för att avlägsna skarpa kanter. Nålens spets (2-3 mm längd, uppmätt från spetsen) böjes försiktigt till ca 90 °. De pia-penetrerande och subpiala injektionsnålarna införs i 1-2 cm långa 20G slang av rostfritt stål av rostfritt stål (10 mm från nålens ände) och limmade med epoxi. Användningen av 20 G (0.91 mm diameter) rör är nödvändig för en säker fastsättning på glaskapillärhållaren. - Genom att manipulera den andra manipulatorns X-, Y- och Z-armar placerar du spetsen av AAV9-injektionsnålen i den pia-penetrerade platsen och fördjupar sedan den ca 2-3 mm in i underrummet genom föregående membranöppning med hjälp av X-arm( Figur 1E och F ).
ANMÄRKNING: 1) AAV9-UBI-GFP bereds enligt tidigare rapporterade protokoll 9 , 10 , och de slutliga titrarna justeras till 1,2 x 10 13 genomkopior per ml (gc / ml). 2) Det är inte nödvändigt att markera platsen för pialöppningen eftersom den är lätt identifierbar ( Figur 1D ). - Injicera AAV9-UBI-GFP (1,5, 3 eller 5 μL) i subpellutrymmet med en 50 μl mikrosprutning (se tabell 1 för experimentella grupper).
- Ta bort injektionsnålen från underrummet efter att AAV9-UBI-GFP-injektionen är klar.
- Stäng muskeln och huden med 4,0 monofilament sutur och kirurgiska klämmor.
OBS! Det är inte nödvändigt att försegla den öppna kotan. - Låt djuren återhämta sig på en värmepanna.
- För smärta kontroll injicera Buprenorphine 0,05 mg / kg / sc var 12: e timme för2-3 dagar efter operationen.
3. Perfusion-fixering, vävnadskryoprotektion och immunfluorescensfärgning
- Vid en förutbestämd tidpunkt efter sub-AAV9-injektionerna bedövar djuparna mössen med eutanasi-lösningen (se Materialetabell , 0,3 ml) och perfekterar dem med 20 ml hepariniserad saltlösning följt av 20 ml 4% paraformaldehyd i PBS.
- Dissektera ryggmärgen och hjärnorna med hjälp av en benrongeur och eftermontera dem i 4% formaldehyd i PBS över natten vid 4 ° C.
- Kryoprotera ryggrad och hjärnor med 30% sackaros i PBS i minst 5-7 dagar.
- Klipp koronal, tvärgående eller longitudinell / horisontell frusen sektioner (30 μm tjock) på en kryostat och förvara dem i PBS vid 4 ° C.
4. Immunofluorescensfärgning av ryggrad och hjärnavsnitt (se materialetabletten)
- Inkubera fritt flytande sektioner i primarY antikroppar över natten.
- Efter inkubation med primära antikroppar, tvätta sektionerna tre gånger i PBS och inkubera med fluorescens-konjugerad åsna-anti-kanin, åsna-anti-kyckling och åsna-anti-get sekundära antikroppar.
- Montera sektionerna på mikroskopglas, torka dem vid rumstemperatur och täcka dem med ett antikvättmedium.
- Fånga bilder med hjälp av epifluorescensfluorescensmikroskop (mål: 10X, NA-0.3, 20X, NA-0.8 och 63X, NA-1.4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Potentisk transgenuttryck i subspektiva AAV9-injicerade segment:
Analysen av transgen (GFP) -uttryck i ryggmärgsektioner vid 14 dagar efter AAV9-leverans visade AAV9-dosberoende GFP-uttryck i hela ryggmärgs parenchymen. Först associerades två bilaterala 3 | jL-injektioner av AAV9-UBI-GFP som injicerades i det övre ländrygsspaltutrymmet med den nästan fullständiga infektionen av den vita och gråa substansen i hela ryggmärgen, som sträckte sig till de övre bröstkroppssegmenten ( Figur 2A Och 2B , vänster och mitten kolumner). Två bilaterala 1,5 μL-injektioner av AAV9-UBI-GFP i det övre ländrygsunderutrymmet var associerade med en liknande nästan fullständig infektion av den vita och gråa substansen i hela ryggmärgen i ryggradsledningen (ses efter injektioner av 3 jil); De mid-thoracic segmenten visade emellertid endast ibland infekterade neuroner (Ass = "xfig"> Figur 2B, höger kolumn). Färgning med α-motoneuronspecifika (ChAT) och neuronspecifika (NeuN) antikroppar visade konsekvent GFP-uttryck i hela populationen av ländryg-a-motoneuroner ( Figur 2C ) och interneuroner lokaliserade i dorsalhornet ( Figur 2D ), mellanzon ( Figur 2E ) och ventralhorn ( Figur 2F ). För det andra ledde två bilaterala livmoderhalsinjektioner av AAV9 (5 μl för varje injektion) till ett liknande GFP-uttryck i den vita och gråa substansen i hela cervikal ryggmärgen (grå och vit substans) och i de övre borsegmenten ( Figur 3A och 3B ) . Analys av ländryggen i samma djur uppvisade en hög densitet av GFP + nedåtgående axoner som slutar i närheten av ländryggen GFP-negativa a-motoneuroner och interneuroner ( Figur 3COch 3D ). Leveransen av två bilaterala livmoderhals- och två bilaterala övre ländstångsinjektioner av AAV9 (5 | il för varje injektion) associerades med GFP-uttryck i hela ryggmärgen, från de övre cervikala till sakrala segmenten och var homogent närvarande i den vita och gråa substansen ( Figur 3E- 3H ).
Retrograd och anterogradtransportmedierad transgenuttryckning i supraspinalmotor och sensoriska centra:
Utbredd GFP-uttryck i ländryggen eller livmoderhalsnärmen efter sub-AAV9-leverans var associerad med robust retrograd och anterogradinfektion-medierad GFP-positivitet i de supraspinala nedåtgående axonerna och deras utskjutande neuroner och i axoner och terminaler av stigande områden ( Figur 4 ). Sålunda sågs intensiv GFP-positivitet i neuroner lokaliserade i retikulärbildning (RF), Nuklearruber (NR) och motorcortex (MC) ( Figur 4B- 4D ). På samma sätt sågs tydlig GFP-immunreaktivitet i terminalerna hos de spinocerebellära (SCT), spinoretikulära och spinotalamiska kanalerna (STT) ( Figur 4B- 4D ).
Figur 1 : Experimentell inställning för att utföra spinal subpialinjektioner i en vuxenmus. ( A ) För att utföra spinal subpialinjektioner hos vuxna möss används två separata XYZ-manipulatorer (I och II). ( B ) Z-armen hos varje manipulator håller en glaskapillärhållare. En kapillärhållare håller den pia-penetrerande 34 G-nålen och den andra håller den stumma 36 G-subjektionsnålen. ( C , D , E och F) Bilder som avbildar positionen för pia-penetrationsnålen strax efter pia-punkteringen ( C ; dura-materien är redan borttagen) efter avlägsnande av den pia-penetrerande nålen ( D ) efter införandet av spetsen av subjektionsnålen ( E ), och efter att subpialinjektionsnålen har ökat 3 mm in i underrummet ( F ). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2 : Potentiell spinalparenkymal GFP-expression efter lumbar subpial AAV9-UBI-GFP-leverans i vuxna möss. ( A ) Två bilaterala injektioner av AAV9-UBI-GFP (1,5 eller 3 | jL-injektioner vardera) levererades till övre ländryggen sUbspialt utrymme och djur perfusionfixerades 14 dagar efter AAV9-tillförsel. ( B ) Intensivt GFP-uttryck i grått (inuti det prickade området) och vitt ämne, som sträcker sig från ländryggen till övre bröstkroppssegmenten, kan ses hos djur injicerade med 3 + 3 μL AAV9 (vänster och mellanskolumner). ( C, D, E och F ) Co-färgning av transversala ryggmärgsektioner som tagits från ländryggsförstoringen hos djur injicerade med 3 + 3 | il av AAV9 visar GFP-uttryck i praktiskt taget alla ChAT- (a-motoneuronmarkör) Motoneuroner ( C och F ) och NeuN-positiva internuroner i dorsalhornet ( D ) och mellanzonen ( E ). Skalstänger = 1000 μm (B); 30 | im (C); 100 | im (DF). DH: dorsalhorn; LV: lamina V; VH: ventral horn. Vänligen klicka här för att se en större veRsion av denna figur.
Figur 3: Jämförelse av spinalt GFP-uttryck efter ryggradssubstans Cervical Versus Spinal Subpial Cervical Plus Subpial Lumbar AAV9-UBI-GFP-leverans i vuxna möss. ( A, B, C och D ) Horisontell sektion skuren genom hela längden på ryggmärgen i ett djur som tidigare fått övre cervikala subpialinjektioner av AAV9-UBI-GFP (5 + 5 μl). Intensivt GFP-uttryck i den vita och gråa substansen i livmoderhalsområdet kan ses ( B ). I ländryggen kan en hög densitet av GFP + nedåtgående axoner i lateral funiculus (LF) och den gråa substansen mellan NeuN-positiva men GFP-negativa neuroner identifieras ( C och D ). ( E, F, G och H Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4
| Experimentella grupper | Webbplats / nivå för leverans av AAV9 (*) | Volym av AAV9 inj, infusionshastighet | Överlevnadstid | Vävnadsanalys |
| Grupp A (n = 7) | C2 (bilaterala) | 5 | il / 5 min | 14 dagar | Hjärna + ryggmärg |
| Grupp B (n = 12) | L1-L2 (bilaterala) | 1,5 pi eller 3 pi, 60 sek / pi | 14 dagar | Hjärna + ryggmärg |
| Grupp C (n = 6) | C2 + L1-L2 (bilaterala på varje nivå) | 5 | il / 5 min | 14 dagar | Ryggrad |
| * - Bilateral= Två subpial-injektioner som levereras till höger och ett till vänster delområde av injicerade segment (er) utförs. | ||||
Tabell 1: Experimentella grupper. Alla experiment utfördes i vuxna C57BL / 6J möss.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den aktuella studien beskriver en teknik för subpiell vektor (AAV9) leverans hos vuxna möss. Såsom visas i den medföljande videon kan detta tillvägagångssätt och teknik effektivt användas, under förutsättning att de nödvändiga instrumenten och den pia-penetrerande nålen och subpialinjektionsnålen tillverkas korrekt enligt de fastställda och testade specifikationerna.
Kritiska tekniska variabler vid utförande av en konsekvent och säker subpialinjektion hos möss:
Som visat sig kan en subpialinjektion enkelt utföras hos vuxna bedövade möss efter en dorsal cervikal eller ländrymmelektomi. Det finns flera kritiska tekniska variabler som definierar framgången med subpielinsprutningstekniken. Först måste spetsen på den 34 G pia-penetrerande nålen konsekvent skärpas med hjälp av en hylsa för att säkerställa en jämn punktering av pia. Eventuella inkonsekvenser i tekniken på hur nålen skärps kan leda till difficuSläpper under pia penetration och / eller kan orsaka ryggskada genom att använda för mycket kraft för att punktera pia. Under normala omständigheter (som visas i videon och i Figur 1C och D ) visar platsen för piaöppningen inget tecken på ryggmärgsskada eller sub-blödning. I vissa fall kan en viss subpial blödning ses, men det visade sig inte vara associerat med neurologisk dysfunktion eller förändrat genuttryck efter AAV9-tillförsel. För det andra är det viktigt att hålla den kirurgiska platsen fri från blod efter att dura har tagits bort med hjälp av elektrocautery. Varje spottig blodrest kan dölja den tillförlitliga identifieringen av piaytan, även om ett kirurgiskt mikroskop används. Såsom visas i Figur 1C-F , kan en blodfri laminektomi-plats effektivt upprätthållas med användning av små gelskumstycken för att täcka den laminektomiserade ryggkotan och omgivande mjukvävnad. För det tredje måste särskild uppmärksamhet ägnas åt korrekt placering av bedövade djur iRyggrad och till immobilisering av ryggraden med hjälp av ryggmärgsklämmor. Användning av för mycket tryck under placering av ryggmärgsklämmor kan orsaka ryggradsbrott; Användning av otillräckligt tryck kan leda till en progressiv lossning av den immobiliserade ryggkotan, vilket vanligtvis inträffar när en tandborr används för att utföra laminektomi.
Volymen av subpially-injicerad AAV9 korrelerar med storleken av rostro-caudalt transgenuttryck. Således associerades användningen av två lumbal bilaterala subaviala AAV9-injektioner (3 + 3 | il eller 5 + 5 | jL) med konsekvent GFP-uttryck i hela ländryggrå och vit materia, som sträckte sig upp till de övre bröstkroppssegmenten. Det var minimal variation mellan djur som användes. AAV9-injektionsvolymer på 1,5 + 1,5 jil ledde till liknande GFP-uttryck i segmenten lokaliserade i närheten av injektioner; Spridningen av viruset och det resulterande GFP-uttrycket var emellertid begränsat i bröstsegmenten ( Begränsning av delleveransmetoden: Framtida tillämpningar av SubpiAl Gene Delivery Technique: Exempelvis, med hjälp av shRNA-silerande vektorer förväntas en hög effektiv minskning av uttrycket av muterade gener ( t.ex. SOD vid den ärftliga formen av ALS) uppnås genom ryggmärgen såväl som i spinalt -projektion av hjärnmotorkärnor. Andra,På grund av den högaktiva infektionen av ryggmärgsämnesaxonen kan terapeutiska gener ( t.ex. kodande tillväxtfaktorer) uppregleras för att främja axonal spridning i ryggradsskadade djur. För det tredje, genom att man manipulerar volymen eller titern hos subpell-levererad virus såväl som platsen för subpielinjektion, kan transgenets uttryck riktas till en diskret region i ryggmärgen ( t.ex. det ensidiga dorsala hornet). Lokalt transgenuttryck kan potentiellt användas vid smärta eller muskelspasticitetsmodifierande behandling genom uppreglerande inhiberande neurotransmittorsystem ( t.ex. GABA) eller inhiberande excitatoriska system ( t.ex. det glutamatkopplade receptorsystemet). För det fjärde, förutom AAV-leverans, kommer andra molekyler eller vektorer med dålig blod-hjärnbarriärpermeabilitet (t ex mikro-RNA) sannolikt att levereras mer effektivt till ryggradsparenchymen efter subpialleverans. Dessa kan effektivt testas av usinG tekniken som beskrivs i detta manuskript. Slutligen, som visat i den aktuella studien, kan subpialtekniken framgångsrikt användas i vuxna möss med genomsnittlig kroppsvikt (BW) mellan 20 och 30 g. Det är sålunda troligt att samma teknik och experimentell inställning kan användas i andra djurarter med liknande BW ( t.ex. Sprague-Dawley (SD) råttor). BW av P6 och P21 SD-råttor är ca 17 respektive 62 g. Att använda råttapparna under det tidiga skedet av utvecklingen efter natalet kan vara ett användbart verktyg för att studera rollen av specifik gen upp- eller nedreglering i utvecklingen av ryggradssystemet och sensorisk och motorisk bearbetning.
En av de relativa begränsningarna av subpialinjektionstekniken (i jämförelse med intratekal leverans) är den mer invasiva karaktären av detta tillvägagångssätt när en dorsal laminektomi måste utföras för att tillåta åtkomst till ryggmärgs dorsala yta. Det potenta transgenuttrycket som ses i hela ryggmärgen och i supraspinalhjärncentra tycks dock visa den klara fördelen jämfört med intratekal AAV-leverans, vilken kännetecknas av selektivt transgenuttryck i en subpopulation av a-motoneuroner och primära afferenser (men är inte närvarande I neuroner i djupare ryggradslina) 8 .
På liknande sätt kan, såsom visas i tidigare studier i vuxna råttor och grisar, högt effektivt transgenuttryck uppnås i ryggvitt och grått ämne hos vuxna möss genom användning av sub-AAV9-leverans. På grund av de relativt mindre dimensionerna (i synnerhet längden) hos musmärgen är dessutom leveransen av AAV9 vid endast två ryggmärgsnivåer (övre cervikal och övre ländrygg) tillräcklig för att leda till nästan fullständig ryggmärgsinfektion. Denna egenskap kan ha en viktig implikation vid utformning av specifika sjukdomsmodifierande behandlingsmetoder genom antingen riktade genavstängning eller uppreglering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Martin Marsala är medstifter av Neurgain Technologies, Inc. (San Diego, USA).
Acknowledgments
Denna studie stöddes av SANPORC och ALSA Foundation grant (Martin Marsala); Det nationella hållbarhetsprogrammet, projektnummer LO1609 (tjeckiska ministeriet för utbildning, ungdom och idrott); Och RVO: 67985904 (Stefan Juhas och Jana Juhasova).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J Mice | Jackson Labs | 664 | |
| Lab Standard Stereotaxic for Mice | Harvard Apparatus | 72-9568 | |
| Mouse Spinal Adaptor | Harvard Apparatus | 72-4811 | |
| XYZ Manipulator | Stoelting | 51604 | |
| Manual Infusion Pump | Stoelting | 51218 | |
| 34G Beveled Nanofill Needle | World Precision Instruments | NF34BV-2 | |
| 36G Blunt Nanofill needle | World Precision Instruments | NF-36BL-2 | |
| Fluriso, Isoflurane | MWI Veterinary Supply | 502017 | |
| Chlorhexidine Solution | MWI Veterinary Supply | 501027 | |
| 20G Stainless Steel Needle | Becton-Dickinson | 305175 | |
| 23G Stainless Steel Needle | Becton-Dickinson | 305145 | |
| 30G Stainless Steel Needle | Becton-Dickinson | 305128 | |
| Cotton Tipped Applicator | MWI Veterinary Supply | 27426 | |
| Glass Capillary Beveller | Narishige International | SM-25B | |
| Slide Microscope Superfrost | Leica Microsystems | M80 | |
| 50 μL Microsyringe | Hamilton | 81242 | |
| BD Intramedic PE-20 Tubing | Becton, Dickinson | 427406 | |
| BD Intramedic PE-10 Tubing | Becton, Dickinson | 427401 | |
| 4-0 monofilament suture | VetOne | V1D397 | |
| Glass Capillary Beveller | Narishige | Pipet Micro Grinder EG-40 | |
| 5 min Epoxy (Epoxy Clear) | Devcon | 14310 | |
| Euthanasia Solution | MWI Veterinary Supply | 11168 | |
| Heparin Inj 1,000 U/mL | MWI Veterinary Supply | 54254 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Anti NeuN Antibody | EMD-Millipore | ABN78 | Primary Rabbit Polyclonal Antibody, 1:1000 |
| Anti-Choline Acetyltransferase (CHAT) Antibody | EMD-Millipore | AB144P | Primary Goat Polyclonal Antibody, 1:100 |
| Anti GFP Antibody | Aves Labs | GFP-1020 | Primary Chicken Polyclonal Antibody, 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A21207 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 680 | ThermoFisher Scientific | A10043 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Donkey anti-Chicken IgY Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Jackson Immunoresearch Labs | 703-545-155 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Donkey Anti-Goat IgG H&L (Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150131 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Slide Microscope Superfrost | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Fisher Scientific | P36930 | |
| Epifluorescence Microscope | Zeiss | Zeiss AxioImager M2 | |
| Fluorescence Confocal Microscope | Olympus | Olympus FV1000 | |
| Dextran | Polysciences, Inc | 19411 | |
| AAV9-UBC-GFP | UCSD Viral Vector Core Laboratory |
References
- Foust, K. D., et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2009).
- Duque, S., et al. Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons. Mol Ther. 17 (7), 1187-1196 (2009).
- Gray, S. J., et al. Preclinical differences of intravascular AAV9 delivery to neurons and glia: a comparative study of adult mice and nonhuman primates. Mol Ther. 19 (6), 1058-1069 (2011).
- Meyer, K., et al. Improving single injection CSF delivery of AAV9-mediated gene therapy for SMA: a dose-response study in mice and nonhuman primates. Mol Ther. 23 (3), 477-487 (2015).
- Foust, K. D., et al. Therapeutic AAV9-mediated suppression of mutant SOD1 slows disease progression and extends survival in models of inherited ALS. Mol Ther. 21 (12), 2148-2159 (2013).
- Passini, M. A., et al. Translational fidelity of intrathecal delivery of self-complementary AAV9-survival motor neuron 1 for spinal muscular atrophy. Hum Gene Ther. 25 (7), 619-630 (2014).
- Bell, P., et al. Motor neuron transduction after intracisternal delivery of AAV9 in a cynomolgus macaque. Hum Gene Ther Methods. 26 (2), 43-44 (2015).
- Miyanohara, A., et al. Potent spinal parenchymal AAV9-mediated gene delivery by subpial injection in adult rats and pigs. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16046 (2016).
- Xu, Q., et al. In vivo gene knockdown in rat dorsal root ganglia mediated by self-complementary adeno-associated virus serotype 5 following intrathecal delivery. PLoS One. 7 (3), 32581 (2012).
- Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus. J Virol. 72 (3), 2224-2232 (1998).
