Summary
Das Ziel der vorliegenden Studie war es, die Potenz und Sicherheit der spinalen Adeno-assoziierten Virus 9 (AAV9) -vermittelten Genabgabe zu entwickeln und zu validieren, indem eine neuartige subpiale Genabgabetechnik bei erwachsenen Mäusen verwendet wurde.
Abstract
Die erfolgreiche Entwicklung eines subpialen Adeno-assoziierten Virus 9 (AAV9) Vektor-Delivery-Technik bei erwachsenen Ratten und Schweinen wurde bisher beschrieben. Unter Verwendung von subpial platzierten Polyethylenkathetern (PE-10 oder PE-5) für die AAV9-Abgabe wurde eine starke Transgenexpression durch das Spinalparenchym (weiße und graue Substanz) in sublimial injizierten Wirbelsäulensegmenten nachgewiesen. Wegen des breiten Spektrums der transgenen Mausmodelle von neurodegenerativen Erkrankungen besteht ein starker Wunsch nach der Entwicklung eines starken Nervensystems (ZNS), der in den erwachsenen Mäusen gezielt entwickelt wurde. Dementsprechend beschreibt die vorliegende Studie die Entwicklung einer spinalen Subpial-Vektor-Abgabevorrichtung und Technik, um eine sichere und wirksame Wirbelsäule-AAV9-Abgabe in erwachsenen C57BL / 6J-Mäusen zu ermöglichen. Bei spinell immobilisierten und anästhesierten Mäusen wurde die Pia mater (zervikale 1 und lumbale 1-2 Spinalsegmentstufe) mit einer scharfen 34 G-Nadel unter Verwendung eines XYZ-Manipulators eingeschnitten. Eine zweite XYZ maNipulator wurde dann verwendet, um eine stumpfe 36G-Nadel in den Lenden- und / oder Zervikal-subpialen Raum vorzurücken. Der AAV9-Vektor (3-5 & mgr; l, 1,2 × 10 13 Genomkopien (gc)), der für grünes fluoreszierendes Protein (GFP) kodiert, wurde dann sublimiert. Nach Injektionen wurde die neurologische Funktion (motorisch und sensorisch) periodisch beurteilt und die Tiere wurden 14 Tage nach der AAV9-Abgabe mit 4% Paraformaldehyd perfusionsfest fixiert. Die Analyse von horizontalen oder transversalen Rückenmarksabschnitten zeigte eine transgene Expression während des gesamten Rückenmarks, sowohl in grauer als auch in weißer Substanz. Darüber hinaus wurde eine intensive retrogradvermittelte GFP-Expression in den absteigenden motorischen Axonen und Neuronen in der motorischen Kortex, Kernruber und formatio reticularis beobachtet. Bei jedem Tier wurde keine neurologische Dysfunktion festgestellt. Diese Daten zeigen, dass die Subpial-Vektor-Delivery-Technik erfolgreich bei erwachsenen Mäusen verwendet werden kann, ohne dass eine prozessbedingte Rückenmarksverletzung verursacht wird und mit hochwirksamen Transgenexpres assoziiert istWährend der spinalen Neuraxis.
Introduction
Die Verwendung von AAV-Vektoren zur Behandlung einer Vielzahl von Rückenmark und ZNS-neurodegenerativen Erkrankungen wird zu einer gut akzeptierten Plattform, um die Expression von Gen (en) von Interesse effektiv zu regulieren oder zu stillen. Eine der Schlüsselbeschränkungen für die effektivere Nutzung dieser Technologie zur Behandlung von ZNS- / Rückenmarksstörungen ist die begrenzte Fähigkeit, AAV-Vektoren an das tiefe Gehirn oder das Rückenmark-Parenchym bei erwachsenen Säugetieren zu liefern.
Es wurde zum Beispiel gezeigt, dass die systemische Verabreichung von AAV9 bei adulten Nagetieren, Katzen oder nichtmenschlichen Primaten nur mäßig wirksam bei der Induktion der transgenen Expression in Neuronen im Gehirn und im Rückenmark 1 , 2 , 3 ist . Die effektivere intrathekale Verabreichung von AAV9-Vektoren hat sich auch gezeigt, dass sie nur zu einer begrenzten Transgenexpression in anatomisch definierten Pools von Neuronen führen. Genauer gesagt, es war DämonenDass die cisternal- oder lumbo-sakrale intrathekale AAV9-Abgabe in nichtmenschlichen Primaten, Schweinen oder Nagetieren zu einem hohen Grad an transgener Expression in spinalen α-Motoneuronen und segmentalen Dorsalwurzelganglionneuronen führt. Allerdings ist ein minimaler oder kein Ausdruck in spinalen Interneuronen oder aufsteigenden oder absteigenden Axonen in der weißen Substanz 4 , 5 , 6 , 7 zu sehen . Gemeinsam zeigen diese Daten, dass eine hochwirksame biologisch-anatomische Barriere existiert, die die Diffusion von intrathekal abgegebener AAV in tieferes Spinalparenchym verhindert.
In einer früheren Studie mit erwachsenen Ratten und Schweinen wurde eine neuartige Subpial-Vektor-Delivery-Technik entwickelt 8 . Unter Verwendung dieses Ansatzes wurde eine hochwirksame und multisegmentale Transgenexpression nach einer Ein-Bolus-Subpial-AAV9-Abgabe nachgewiesen. Intensive GFP-Expression wurde konsequent gesehenIn Neuronen, Gliazellen und absteigenden / aufsteigenden Axonen durch die injizierten Wirbelsäulensegmente. Diese Studie zeigte zum ersten Mal, dass die Pia mater die primäre Barriere darstellt, die die effektive AAV9-Diffusion in das Spinalparenchym aus dem intrathekalen Raum begrenzt. Während diese zuvor entwickelte Technik und die subpiale Injektionsvorrichtung bei großen Nagetieren (wie Ratten) oder erwachsenen Schweinen relativ einfach zu verwenden ist, ist das System nicht für den Einsatz bei kleinen Tieren, wie z. B. erwachsenen Mäusen, geeignet. Wegen der hohen Anzahl verfügbarer transgener Mausmodelle einer Vielzahl von neurodegenerativen Erkrankungen besteht ein klarer Bedarf an der Entwicklung einer wirksamen Spinal-Parenchym-Vektor-Verabreichungstechnik bei Mäusen. Die Verfügbarkeit einer solchen Technik würde die Untersuchung der Wirkung eines spezifischen Gen-Silens ( z. B. unter Verwendung von shRNA) oder einer Hochregulation unter Verwendung von zell-unspezifischen ( z. B. Cytomegalovirus-CMV oder Ubiquitin) oder zellspezifischen ( z. B. Synapsen oder Glia) ermöglichen Fibrillär sauerProtein (GFAP)) Promotoren während der frühen postnatalen Entwicklung oder unter kranken Bedingungen.
Dementsprechend haben wir in der vorliegenden Studie ein Miniatur-Subpial-Vektor-Delivery-System entwickelt und validiert, das effektiv bei erwachsenen Mäusen verwendet werden kann. Ähnlich wie bei früheren Ratten- und Schweinestudien zeigt diese Arbeit eine starke Transgenexpression während des gesamten Wirbelsäulenparenchyms nach einer Ein-Bolus-Subpial-AAV9-Abgabe bei Mäusen. Die Einfachheit dieses Ansatzes, die sehr gute Verträglichkeit von injizierten Mäusen zur subpialen AAV9-Abgabe und die hohe Potenz der Transgenexpression im Spinalparenchym deuten darauf hin, dass diese Technik in jeder Laborumgebung effektiv umgesetzt und in Experimenten verwendet werden kann, die auf die Spinalgenexpression abzielen.
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Protocol
Diese Studien wurden im Rahmen eines Protokolls durchgeführt, das vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of California, San Diego, genehmigt wurde und in Übereinstimmung mit der Vereinigung für die Bewertung von Labortierpflegerichtlinien für Tiernutzung war. Alle Studien wurden so durchgeführt, dass Gruppengröße und Tierleiden minimiert wurden.
1. Allgemeine tierische und chirurgische Vorbereitung
- Vor Beginn des chirurgischen Eingriffs das Virus auftauen (AAV9-UBI-GFP; 5 μl Aliquote) 8 . Eine 5% Dextran (10.000 MW) Lösung durch Mischen von Dextranpulver in destilliertem Wasser vorbereiten. Mischen Sie die Viruslösung mit 5% Dextranlösung 1: 1 auf eine endgültige Dextrankonzentration von 2,5%.
- Die Viruslösung auf Eis (4 ° C) aufbewahren.
- Verwenden Sie erwachsene C57BL / 6J Mäuse (männlich und weiblich, 20-30 g). Die Mäuse mit 5% Isofluran (in O 2 , 1 L / min) betäubt und bei 2 aufbewahren-3% inhaliertes Isofluran (in O 2 , 1 L / min) durch Nasenkonus während der Operation, abhängig von der Atemfrequenz und der Tatzendruckreaktion.
- Rasieren Sie die Rückseite der Tiere mit Rasierklammern und reinigen Sie die Haut mit 2% Chlorhexidin.
- In chronischen Erholungsstudien folgen eine strenge sterile Technik.
- Wenn lumbale subpiale Injektionen durchgeführt werden sollen, schneide die Haut über die Th8-L1 Wirbel mit einem Skalpell und löst den paravertebralen Muskel von Th10-12 Wirbelsäule mit Schere.
- Montieren Sie das Tier in einen Standard-Stereotax-Rahmen mit Maus-Wirbelsäulen-Klemmen.
- Rasieren Sie die beiden Seiten der Lamellen der Th10-12 Wirbel mit einem Zahnbohrer (Bohrer: 0,9 mm, Geschwindigkeit: 20.000 U / min), bis Risse auftreten.
- Entfernen Sie geknackte Knochenfragmente mit einer Pinzette und setzen Sie die dorsale Oberfläche des Lendenwirbels ab.
- Die Dura ca. 1 cm mit einer 30 G Edelstahl Nadel und Pinzette aufschneiden.
- Entfernen Sie die atlanto-occipital Membran der cisterna magna mit einer 23G Edelstahl Nadel und Pinzette.
- Reinigen Sie die Inzisionsstelle von Gewebe- und Knochenschutt mit Wattestäbchen.
- Die Dura ca. 2-3 mm mit einer 30 G Edelstahl Nadel und Pinzette aufschneiden.
2. Eröffnung der Pial Membran und Einsetzen der Subpial Nadel für AAV9 Lieferung
- Montieren Sie die 34 G-Pia-penetrierende Nadel in den Z-Arm eines XYZ-Manipulators mit einem Glas-Kapillar-Halter ( Abbildung 1A und B ).
HINWEIS: Zur Herstellung der Pia-penetrierenden Nadel wird die ursprüngliche, abgeschrägte Spitze der 34G-Nadel mit einem Glas-Kapillar-Beveller mit Diamant-Schleifteller - grob (5,0 μm bis 50 μm Spitzengrößen) und Schleifwinkel von geschärft15 - 20 °. Die Spitze der Nadel (1 mm Länge, gemessen von der Spitze) wird dann sanft auf etwa 90 ° gebogen ( Abbildung 1B , linker Einsatz). - Unter Verwendung eines chirurgischen Sektionsbereichs, der auf eine 8-10-fache Vergrößerung eingestellt ist, durchdringen die Pia mit der Pia-penetrierenden Nadel um etwa 1 mm ( Abbildung 1C ) mit dem X-Arm.
- Halten Sie den Winkel der durchdringenden Nadel auf die Gewebeoberfläche bei 5-10 °.
- Nach der Pia-Öffnung die Pia-Penetrationsnadel horizontal aus dem subpialen Raum ( Abbildung 1 D) mit dem X-Arm entfernen.
HINWEIS: Denken Sie daran, die durchdringte Stelle durch ein Wahrzeichen, wie ein Blutgefäß. - Legen Sie eine stumpfe 36G Injektionsnadel mit AAV9-UBI-GFP-Virus mit einer 50-μL-Mikrospritze, die mit der Injektionsnadel mit PE-10 oder PE-20-Schlauch verbunden ist.
- Montieren Sie die Nadel in den Z-Arm eines zweiten XYZ-Manipulators ( Abbildung 1A B ) unter Verwendung eines Glaskapillarenhalters ( Bild 1B , rechter Einsatz).
HINWEIS: Zur Herstellung der subpialen AAV9-Injektionsnadel wird die stumpfe Spitze einer 36 G-Nadel mit einem Glas-Kapillar-Beveller mit Diamant-Schleifteller - grob (5,0 μm bis 50 μm Spitzengrößen) poliert, um die scharfen Kanten zu entfernen. Die Spitze der Nadel (2-3 mm Länge, gemessen von der Spitze) wird dann sanft auf etwa 90 ° gebogen. Die pia-penetrierenden und subpialen Injektionsnadeln werden in 1-2 cm lange 20G-Slave-Edelstahlrohre (10 mm vom Ende der Nadel) eingefügt und mit Epoxy verklebt. Für die sichere Befestigung am Glaskapillarenhalter ist die Verwendung von 20 G (0,91 mm Durchmesser) Rohr erforderlich. - Durch die Manipulation der X-, Y- und Z-Arme des zweiten Manipulators positionieren Sie die Spitze der AAV9-Injektionsnadel in die pia-durchdringte Stelle und führen sie dann etwa 2-3 mm in den subpialen Raum durch die vorherige Pialmembranöffnung mit dem X-arm( Abbildung 1E und F ).
HINWEIS: 1) Das AAV9-UBI-GFP wird nach den zuvor gemeldeten Protokollen 9 , 10 hergestellt und die endgültigen Titer werden auf 1,2 x 10 13 Genomkopien pro ml (gc / ml) eingestellt. 2) Es besteht keine Notwendigkeit, die Stelle der Pialöffnung zu markieren, weil sie leicht identifizierbar ist ( Abbildung 1D ). - Injizieren Sie die AAV9-UBI-GFP (1,5, 3 oder 5 μl) in den subpialen Raum mit einer 50 μl Mikrospritze (siehe Tabelle 1 für Versuchsgruppen).
- Entfernen Sie die Injektionsnadel aus dem subpialen Raum, nachdem die AAV9-UBI-GFP-Injektion abgeschlossen ist.
- Schließen Sie den Muskel und die Haut mit 4,0 Monofilament Naht und chirurgischen Clips.
HINWEIS: Es besteht keine Notwendigkeit, den offenen Wirbel zu versiegeln. - Lassen Sie die Tiere auf einem Heizkissen erholen.
- Für Schmerzkontrolle injizieren Buprenorphin 0,05 mg / kg / sc alle 12 h für2-3 Tage nach der Operation.
3. Perfusionsfixierung, Tissue Cryoprotection und Immunfluoreszenzfärbung
- Zu einem vorgegebenen Zeitpunkt nach den subpialen AAV9-Injektionen werden die Mäuse mit einer Euthanasie-Lösung (siehe Tabelle der Materialien , 0,3 ml) tief betäubt und sie mit 20 ml heparinisiertem Salzlösung transkutiv perfundiert, gefolgt von 20 ml 4% Paraformaldehyd in PBS.
- Die Wirbelsäule und das Gehirn mit einem Knochenrongeur zerkleinern und in 4% Formaldehyd in PBS über Nacht bei 4 ° C nachfüllen.
- Kryoprotekt die Wirbelsäule und Gehirne mit 30% Saccharose in PBS für mindestens 5-7 Tage.
- Schneiden Sie koronale, transversale oder longitudinale / horizontale gefrorene Abschnitte (30 μm dick) auf einem Kryostaten und speichern Sie sie in PBS bei 4 ° C.
4. Immunfluoreszenz-Färbung von Rückenmark und Gehirn-Sektionen (siehe Tabelle der Materialien)
- Inkubieren Sie frei schwebende Abschnitte in PrimarY-Antikörper über Nacht.
- Nach der Inkubation mit primären Antikörpern, waschen Sie die Schnitte dreimal in PBS und inkubieren Sie mit fluoreszenzkonjugierten Esel-Anti-Kaninchen, Esel-Antihuhn und Esel-Anti-Ziegen-Sekundärantikörpern.
- Montieren Sie die Abschnitte auf Mikroskopie-Objektträgern, trocknen Sie sie bei Raumtemperatur und decken Sie sie mit einem Anti-Fade-Medium ab.
- Erfassen von Bildern mit Epifluoreszenz-Fluoreszenzmikroskop (Ziele: 10X, NA-0.3; 20X, NA-0.8 und 63X, NA-1.4).
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Representative Results
Potente Transgenexpression in subpialen AAV9-injizierten Segmenten:
Die Analyse der Transgen- (GFP) -Expression in den Rückenmarksabschnitten an 14 Tagen nach der AAV9-Abgabe zeigte eine AAV9-dosisabhängige GFP-Expression während des Spinalparenchyms. Zuerst wurden zwei bilaterale 3 & mgr; l Injektionen von AAV9-UBI-GFP, die in den oberen lumbalen subpialen Raum injiziert wurden, mit der nahezu vollständigen Infektion der weißen und grauen Substanz in dem gesamten lumbalen Rückenmark verbunden, die sich bis zu den oberen Thoraxsegmenten erstreckte ( 2A Und 2B , linke und mittlere Säulen). Zwei bilaterale 1,5 & mgr; l Injektionen von AAV9-UBI-GFP in den oberen lumbalen subpialen Raum wurden mit einer ähnlichen nahezu vollständigen Infektion der weißen und grauen Substanz in dem gesamten Lendenwirbelsäule (wie nach Injektionen von 3 & mgr; l gesehen) assoziiert; Die mittleren Thoraxsegmente zeigten jedoch nur gelegentlich infizierte Neuronen (Ass = "xfig"> Abbildung 2B, rechte Spalte). Die Färbung mit α-Motoneuronspezifischen (ChAT) und neuronspezifischen (NeuN) Antikörpern zeigte eine konsistente GFP-Expression in der gesamten Population von lumbalen α-Motoneuronen ( Abbildung 2C ) und Interneuronen, die im Dorsalhorn lokalisiert wurden ( Abbildung 2D ), Zwischenzone ( Abbildung 2E ) und ventrales Horn ( Abbildung 2F ). Zweitens führten zwei bilaterale zervikale Injektionen von AAV9 (5 μl für jede Injektion) zu einer ähnlichen GFP-Expression in der weißen und grauen Substanz im gesamten Halswirbelsäule (graue und weiße Substanz) und in den oberen Thoraxsegmenten ( Abbildung 3A und 3B ) . Die Analyse von Lendenwirbelsäulenabschnitten in denselben Tieren zeigte eine hohe Dichte von GFP + absteigenden Axonen, die in der Nähe der lumbalen GFP-negativen α-Motoneuronen und Interneuronen enden ( Fig. 3CUnd 3D ). Die Auslieferung von zwei bilateralen zervikalen und zwei bilateralen oberen Lendenwirbelsinjektionen von AAV9 (5 μl für jede Injektion) wurde mit der GFP-Expression im gesamten Rückenmark, vom oberen Zervikal- bis zum Sakralsegment, assoziiert und war homogen in der weißen und grauen Substanz vorhanden ( Fig. 3E- 3H ).
Retrograde und anterograde Transport-vermittelte Transgenexpression in supraspinalen Motoren und Sensorischen Zentren:
Die weit verbreitete GFP-Expression im lumbalen oder zervikalen Rückenmark nach der subpialen AAV9-Verabreichung war mit einer robusten retrograden und anterograde Infektions-vermittelten GFP-Positivität in den supraspinalen absteigenden Axonen und ihren projizierten Neuronen sowie in Axonen und Terminals von aufsteigenden Traktaten assoziiert ( Abbildung 4 ). So wurde eine intensive GFP-Positivität in Neuronen beobachtet, die in der retikulären Formation (RF) lokalisiert waren,, Nucleus ruber (NR) und Motorkortex (MC) ( Abbildung 4B- 4D ). Ähnlich wurde eine deutliche GFP-Immunreaktivität in den Terminals der Spinocerebellären (SCT), Spinoretikulären und Spinothalamus (STT) beobachtet ( Abbildung 4B- 4D ).
Abbildung 1 : Experimentelle Einrichtung, um Spinal Subpial Injektionen in einer erwachsenen Maus durchzuführen. ( A ) Zur Durchführung von spinalen subpialen Injektionen bei erwachsenen Mäusen werden zwei getrennte XYZ-Manipulatoren verwendet (I und II). ( B ) Der Z-Arm jedes Manipulators hält einen Glas-Kapillarenhalter. Ein Kapillarhalter hält die pia-durchdringende 34 G-Nadel und die zweite hält die stumpfe 36 G-Subpial-Injektionsnadel. ( C , D , E und F) Bilder, die die Position der Pia-Penetrationsnadel unmittelbar nach der Pia-Punktion ( C ; Dura-Materie bereits entfernt) nach Entfernung der Pia-Penetrationsnadel ( D ) nach dem Einsetzen der Spitze der sublimialen Injektionsnadel ( E ) und nach dem Vorrücken der subpialen Injektionsnadel 3 mm in den subpialen Raum ( F ). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2 : Potente spinale parenchymale GFP-Expression nach Lenden-Subpial AAV9-UBI-GFP-Lieferung in erwachsenen Mäusen. ( A ) Zwei bilaterale Injektionen von AAV9-UBI-GFP (1,5 oder 3 μl Injektionen jeweils) wurden in die obere Lendenwirbelsäule abgegebenUbpialer Raum, und Tiere wurden perfusion-fixiert 14 Tage nach AAV9 Lieferung. ( B ) In Tieren, die mit 3 + 3 μl AAV9 (linke und mittlere Säulen) injiziert wurden, ist eine intensive GFP-Expression im Grau (innerhalb des punktierten Bereichs) und der weißen Substanz, die sich von der Lendenwirbelsäule bis zu den oberen Thoraxsegmenten erstreckt, zu sehen. ( C, D, E und F ) Co-Färbung von transversalen Rückenmarksabschnitten aus der Lendenvergrößerung bei Tieren, die mit 3 + 3 μl AAV9 injiziert wurden, zeigen die GFP-Expression in praktisch allen ChAT- (α-Motoneuron-Marker) -positiven α- Motoneuronen ( C und F ) und NeuN-positiven Interneuronen im Dorsalhorn ( D ) und Zwischenzone ( E ). Maßstäbe = 1.000 μm (B); 30 μm (C); 100 μm (DF). DH: dorsales Horn; LV: Lamina V; VH: ventrales Horn. Bitte klicken Sie hier, um ein größeres ve anzuzeigenRsion dieser Figur
Abbildung 3: Vergleich der spinalen GFP-Expression nach der Wirbelsäule Subpial Cervical gegen die Wirbelsäule Subpial Cervical plus Subpial Lumbale AAV9-UBI-GFP Lieferung in erwachsenen Mäusen. ( A, B, C und D ) Horizontaler Schnitt durch die gesamte Länge des Rückenmarks in einem Tier, das zuvor obere zervikale subpiale Injektionen von AAV9-UBI-GFP (5 + 5 μL) erhielt. Intensive GFP-Expression in der weißen und grauen Substanz im Zervikalbereich ist zu sehen ( B ). Im lumbalen Rückenmark kann eine hohe Dichte von GFP + absteigenden Axonen im lateralen Funiculus (LF) und die graue Substanz zwischen NeuN-positiven aber GFP-negativen Neuronen identifiziert werden ( C und D ). ( E, F, G und H Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4
| Experimentelle Gruppen | Site / Ebene der AAV9 Lieferung (*) | Volumen der AAV9 inj, Infusionsrate | Überlebenszeit | Gewebeanalyse |
| Gruppe A (n = 7) | C2 (bilateral) | 5 & mgr; l / 5 min | 14 Tage | Gehirn + Rückenmark |
| Gruppe B (n = 12) | L1-L2 (bilateral) | 1,5 & mgr; l oder 3 & mgr; l, 60 s / & mgr; l | 14 Tage | Gehirn + Rückenmark |
| Gruppe C (n = 6) | C2 + L1-L2 (bilateral auf jeder Ebene) | 5 & mgr; l / 5 min | 14 Tage | Rückenmark |
| * - bilateral= Zwei subpiale Injektionen, die man in den rechten und einen nach links subpialen Raum des injizierten Segments (s) ausführt. | ||||
Tabelle 1: Experimentelle Gruppen. Alle Experimente wurden bei erwachsenen C57BL / 6J-Mäusen durchgeführt.
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Discussion
Die aktuelle Studie beschreibt eine Technik der subpialen Vektor (AAV9) Lieferung bei erwachsenen Mäusen. Wie in dem begleitenden Video gezeigt, kann dieser Ansatz und die Technik effektiv genutzt werden, vorausgesetzt, dass die benötigten Instrumente und die pia-penetrierende Nadel und die subpiale Injektionsnadel entsprechend den etablierten und getesteten Spezifikationen ordnungsgemäß hergestellt werden.
Kritische technische Variablen bei der Durchführung einer konsistenten und sicheren Subpial Injektion bei Mäusen:
Wie gezeigt, kann eine subpiale Injektion leicht bei erwachsenen anästhesierten Mäusen nach einer dorsalen zervikalen oder lumbalen Laminektomie durchgeführt werden. Es gibt mehrere kritische technische Variablen, die den Erfolg der subpialen Injektionstechnik definieren. Zuerst muss die Spitze der 34 G-Pia-penetrierenden Nadel mit einem Beveller konsequent geschärft werden, um die glatte Punktion der Pia zu gewährleisten. Irgendwelche Inkonsistenzen in der Technik, wie die Nadel geschärft wird, kann zu difficu führenWährend der Pia-Penetration und / oder kann eine Wirbelsäulenverletzung verursachen, indem man zu viel Kraft benutzt, um die Pia zu punktieren. Unter normalen Umständen (wie im Video und in Abbildung 1C und D gezeigt ), zeigt die Stelle der Pia-Öffnung kein Zeichen von Rückenmarksverletzungen oder subpialen Blutungen. In einigen Fällen können einige subpiale Blutungen gesehen werden, aber dies wurde nicht mit neurologischen Dysfunktion oder veränderten Genexpression nach AAV9-Verabreichung assoziiert. Zweitens ist es wichtig, die chirurgische Stelle frei von Blut zu halten, nachdem die Dura durch Elektrokauterie entfernt wurde. Jeder fleckige Blutrückstand kann die zuverlässige Identifizierung der Pia-Oberfläche verdecken, auch wenn ein chirurgisches Mikroskop verwendet wird. Wie in Fig. 1C-F gezeigt , kann eine blutfreie Laminektomie-Stelle effektiv unter Verwendung von kleinen Gel-Schaum-Stücken gehalten werden, um den laminktomierten Wirbel und das umgebende Weichgewebe zu bedecken. Drittens muss besonderes Augenmerk auf die ordnungsgemäße Platzierung von betäubten Tieren gelenkt werdenWirbelsäulenrahmen und zur Immobilisierung der Wirbelsäule mit Wirbelsäulenschellen. Die Verwendung von zu viel Druck während der Platzierung von Wirbelsäulenklemmen kann zu einem Wirbelbruch führen. Mit unzureichendem Druck kann zu einer fortschreitenden Lockerung des immobilisierten Wirbels führen, was typischerweise passiert, wenn ein Zahnbohrer zur Durchführung der Laminektomie verwendet wird.
Das Volumen der sublimial injizierten AAV9 korreliert mit der Größe des rostro-caudalen Transgen-Ausdrucks. So wurde die Verwendung von zwei lumbalen bilateralen subpialen AAV9-Injektionen (3 + 3 μl oder 5 + 5 μl) mit einer konsistenten GFP-Expression in der ganzen lumbalen grauen und weißen Substanz assoziiert, die sich bis zu den oberen Thoraxsegmenten erstreckte. Es gab eine minimale Variabilität gegenüber den verwendeten Tieren. AAV9-Injektionsvolumina von 1,5 + 1,5 & mgr; l führten zu einer ähnlichen GFP-Expression in den Segmenten, die in der Nähe von Injektionen lokalisiert waren; Die Ausbreitung des Virus und die daraus resultierende GFP-Expression war jedoch in den Thoraxsegmenten begrenzt ( Einschränkung der Subpial Gen Lieferung Technik: Zukünftige Anwendungen der SubpiAl Gen Lieferung Technik: Beispielsweise wird durch die Verwendung von shRNA-Silencing-Vektoren erwartet, dass eine hochwirksame Abnahme der Expression von mutierten Genen ( z. B. SOD im Falle der ererbten Form von ALS) sowohl im Rückenmark als auch im Spinally erreicht wird -projektierende Gehirnmotorkerne. Zweite,Aufgrund der hochwirksamen Infektion der Spinal-Weiß-Materie-Axone können therapeutische Gene ( z. B. kodierende Wachstumsfaktoren) hochreguliert werden, um das axonale Keimen in spinalen Trauma-verletzten Tieren zu fördern. Drittens kann durch die Manipulation des Volumens oder des Titers des sublimial gelieferten Virus sowie der Stelle der subpialen Injektion die Expression des Transgens auf eine diskrete Region des Rückenmarks ( z. B. das einseitige Dorsalhorn) gerichtet werden. Die lokalisierte Transgenexpression kann potentiell in der Schmerz- oder Muskelspastizität modifizierenden Behandlung durch Hochregulierung von inhibitorischen Neurotransmittersystemen ( z. B. GABA) oder zur Hemmung von exzitatorischen Systemen ( z. B. dem Glutamat-gekoppelten Rezeptorsystem) verwendet werden. Viertens werden neben der AAV-Abgabe auch andere Moleküle oder Vektoren mit schlechter Blut-Hirn-Barriere-Permeabilität ( z. B. Mikro-RNA) nach der Subpial-Zuführung effektiver in das Spinalparenchym abgegeben. Diese können effektiv von usin getestet werdenG die in diesem Manuskript beschriebene Technik. Schließlich kann, wie in der aktuellen Studie gezeigt, die subpiale Technik erfolgreich bei erwachsenen Mäusen mit durchschnittlichen Körpergewichten (BW) zwischen 20 und 30 g verwendet werden. Somit ist es wahrscheinlich, dass die gleiche Technik und der experimentelle Aufbau in anderen Tierarten mit ähnlichen BW ( z. B. Sprague-Dawley (SD) Ratten-Welpen verwendet werden können). Die BW von P6 und P21 SD Ratten sind etwa 17 bzw. 62 g. Die Verwendung der Rattenwelpen während des frühen Stadiums der postnatalen Entwicklung kann ein nützliches Instrument sein, um die Rolle der spezifischen Gen-Up- oder Downregulation bei der Entwicklung von spinalen neuronalen Schaltungen und sensorischen und motorischen Verarbeitung zu untersuchen.
Eine der relativen Einschränkungen der subpialen Injektionstechnik (im Vergleich zur intrathekalen Verabreichung) ist die invasivere Natur dieses Ansatzes, wenn eine dorsale Laminektomie durchgeführt werden muss, um den Zugang zur Rückenfläche des Rückenmarks zu ermöglichen. Allerdings scheint der starke transgene Ausdruck, der im gesamten Rückenmark und in den supraspinalen Hirnzentren gesehen wird, den klaren Vorteil gegenüber der intrathekalen AAV-Abgabe zu zeigen, die durch selektive Transgenexpression in einer Subpopulation von α-Motoneuronen und primären Afferenzen charakterisiert ist (aber nicht vorhanden ist In Neuronen im tieferen Rückenmark laminae) 8 .
Ähnlich, wie in früheren Studien bei erwachsenen Ratten und Schweinen gezeigt, kann eine hochwirksame Transgenexpression in der spinalen weißen und grauen Substanz bei erwachsenen Mäusen unter Verwendung einer subpialen AAV9-Abgabe erreicht werden. Darüber hinaus reicht wegen der relativ kleineren Abmessungen (insbesondere der Länge) des Maus-Rückenmarks die Abgabe von AAV9 an nur zwei Rückenmarkniveaus (obere Hals- und Oberlumse) aus, um zu einer nahezu vollständigen Rückenmarksinfektion zu führen. Diese Eigenschaft kann eine wichtige Implikation bei der Gestaltung spezifischer krankheitsmodifizierender Behandlungsansätze entweder durch gezielte Gen-Silencing oder Hochregulation haben.
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Disclosures
Martin Marsala ist Mitbegründer von Neurgain Technologies, Inc. (San Diego, USA).
Acknowledgments
Diese Studie wurde von der Stiftung SANPORC und ALSA Foundation (Martin Marsala) unterstützt; Das Nationale Nachhaltigkeitsprogramm, Projektnummer LO1609 (tschechisches Ministerium für Bildung, Jugend und Sport); Und RVO: 67985904 (Stefan Juhas und Jana Juhasova).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J Mice | Jackson Labs | 664 | |
| Lab Standard Stereotaxic for Mice | Harvard Apparatus | 72-9568 | |
| Mouse Spinal Adaptor | Harvard Apparatus | 72-4811 | |
| XYZ Manipulator | Stoelting | 51604 | |
| Manual Infusion Pump | Stoelting | 51218 | |
| 34G Beveled Nanofill Needle | World Precision Instruments | NF34BV-2 | |
| 36G Blunt Nanofill needle | World Precision Instruments | NF-36BL-2 | |
| Fluriso, Isoflurane | MWI Veterinary Supply | 502017 | |
| Chlorhexidine Solution | MWI Veterinary Supply | 501027 | |
| 20G Stainless Steel Needle | Becton-Dickinson | 305175 | |
| 23G Stainless Steel Needle | Becton-Dickinson | 305145 | |
| 30G Stainless Steel Needle | Becton-Dickinson | 305128 | |
| Cotton Tipped Applicator | MWI Veterinary Supply | 27426 | |
| Glass Capillary Beveller | Narishige International | SM-25B | |
| Slide Microscope Superfrost | Leica Microsystems | M80 | |
| 50 μL Microsyringe | Hamilton | 81242 | |
| BD Intramedic PE-20 Tubing | Becton, Dickinson | 427406 | |
| BD Intramedic PE-10 Tubing | Becton, Dickinson | 427401 | |
| 4-0 monofilament suture | VetOne | V1D397 | |
| Glass Capillary Beveller | Narishige | Pipet Micro Grinder EG-40 | |
| 5 min Epoxy (Epoxy Clear) | Devcon | 14310 | |
| Euthanasia Solution | MWI Veterinary Supply | 11168 | |
| Heparin Inj 1,000 U/mL | MWI Veterinary Supply | 54254 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Anti NeuN Antibody | EMD-Millipore | ABN78 | Primary Rabbit Polyclonal Antibody, 1:1000 |
| Anti-Choline Acetyltransferase (CHAT) Antibody | EMD-Millipore | AB144P | Primary Goat Polyclonal Antibody, 1:100 |
| Anti GFP Antibody | Aves Labs | GFP-1020 | Primary Chicken Polyclonal Antibody, 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A21207 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 680 | ThermoFisher Scientific | A10043 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Donkey anti-Chicken IgY Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Jackson Immunoresearch Labs | 703-545-155 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Donkey Anti-Goat IgG H&L (Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150131 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Slide Microscope Superfrost | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Fisher Scientific | P36930 | |
| Epifluorescence Microscope | Zeiss | Zeiss AxioImager M2 | |
| Fluorescence Confocal Microscope | Olympus | Olympus FV1000 | |
| Dextran | Polysciences, Inc | 19411 | |
| AAV9-UBC-GFP | UCSD Viral Vector Core Laboratory |
References
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