Summary
وكان الهدف من هذه الدراسة لتطوير والتحقق من صحة وسلامة فيروس العمود الفقري الغدة المرتبطة 9 (AAV9) تسليم الجينات بوساطة باستخدام تقنية تسليم الجينات دون المستوى الرواية في الفئران البالغة.
Abstract
وقد تم الإبلاغ عن التطور الناجح للفيروس الفرعي الغدة المرتبطة فيروس 9 (AAV9) تقنية نقل ناقلات في الفئران البالغة والخنازير في السابق. باستخدام القسطرة البولي ايثيلين وضعت تحت مكان (بي-10 أو بي-5) لتسليم AAV9، وقد تجلى التعبير التحوير قوي من خلال لحمة في العمود الفقري (المادة البيضاء والرمادية) في أجزاء العمود الفقري حقنه بشكل جزئي. بسبب مجموعة واسعة من نماذج الماوس المعدلة وراثيا من أمراض الاعصاب، وهناك رغبة قوية لتطوير الجهاز العصبي المركزي قوية (نس) -Ttargeted تقنية تسليم ناقلات في الفئران البالغة. وبناء على ذلك، تصف هذه الدراسة تطوير جهاز تسليم ناقلات تحت القشرة العمود الفقري وتقنية للسماح آمنة وفعالة تسليم العمود الفقري AAV9 في الفئران C57BL / 6J الكبار. في الفئران يجمد بشكل جماعي وتخدير الفئران، والقطن الحنون (عنق الرحم 1 والقطني 1-2 مستوى القطني الشوكي) تم شقه مع إبرة حادة 34 G باستخدام مناور شيز. الثانية شيز ماثم استخدم نيبولاتور للمضي قدما إبرة حادة 36G في القطني و / أو عنق الرحم الفضاء تحت السطحية. و AAV9 ناقلات (3-5 ميكرولتر؛ 1.2 × 10 13 نسخ الجينوم (غ)) تم ترميز البروتين الأخضر الفلورسنت (غفب) ثم حقن سوباليالي. بعد الحقن، تم تقييم وظيفة عصبية (المحرك والحسية) بشكل دوري، وكانت الحيوانات نضح ثابتة بعد 14 يوما من تسليم AAV9 مع بارافورمالدهيد 4٪. أظهر تحليل أقسام الحبل الشوكي الأفقي أو المستعرض التعبير التحوير في جميع أنحاء الحبل الشوكي بأكمله، في كل من المواد الرمادي والأبيض. وبالإضافة إلى ذلك، شوهد التعبير غفب بوساطة مكثفة ريتروغراديلي في المحاور الحركية الهبوطية والخلايا العصبية في القشرة الحركية، نواة روبر، وشكلية شبكية. لم يلاحظ أي خلل عصبي في أي الحيوانات. وتظهر هذه البيانات أن تقنية تسليم ناقلات تحت القفص يمكن أن تستخدم بنجاح في الفئران البالغة، دون التسبب في إصابة الحبل الشوكي ذات الصلة بالإجراء، ويرتبط مع تجانس قوي للغاية إكسبريسسيون، عبر، ال التعريف، شوكي، نيوراكسيس.
Introduction
استخدام ناقلات آف لعلاج مجموعة متنوعة من الحبل الشوكي واضطرابات الجهاز العصبي المركزي العصبية أصبحت منصة مقبولة بشكل جيد ل أوبغريغولات بفعالية أو إسكات التعبير عن الجينات (ق) من الفائدة. واحدة من القيود الرئيسية على استخدام أكثر فعالية لهذه التكنولوجيا لعلاج اضطرابات الجهاز العصبي المركزي / العمود الفقري الحبل هو القدرة المحدودة على تقديم ناقلات آف (ق) إلى الدماغ العميق أو حبل الشوكي حمة في الثدييات الكبار.
وقد ثبت، على سبيل المثال، أن تسليم النظامية من AAV9 في القوارض الكبار والقطط، أو الرئيسيات غير البشرية هي فقط فعالة بشكل معتدل في إحداث التعبير التحوير في الخلايا العصبية في الدماغ والحبل الشوكي 1 ، 2 ، 3 . وقد تبين أيضا أن تسليم أكثر فعالية داخل القراب من ناقلات AAV9 أن يؤدي إلى التعبير التحوير محدود فقط في مجموعات تعرف تشريحيا من الخلايا العصبية. وبشكل أكثر تحديدا، فقد كان الشياطينتراتد أن قاطعة أو قطني العجزية داخل القراب AAV9 التسليم في الرئيسيات غير البشرية، والخنازير، أو القوارض يؤدي إلى مستوى عال من التعبير التحوير في العمود الفقري α- الحركات العصبية والخلايا العصبية الجذرية الظهري العقدية. ومع ذلك، الحد الأدنى أو أي تعبير في إنترنيورونس الشوكي أو محاور صاعدة أو تنازلي في المادة البيضاء ينظر 4 ، 5 ، 6 ، 7 . بشكل جماعي، وتظهر هذه البيانات أن وجود حاجز البيولوجية التشريحية فعالة للغاية، مما يمنع نشر آف تسليمها داخل إنتراثيكالي إلى حمة الشوكي أعمق.
في دراسة سابقة باستخدام الفئران البالغة والخنازير، تم تطوير تقنية تسليم ناقلات سوببيال رواية 8 . باستخدام هذا النهج، وقد أثبتت قوية جدا ومتعدد القطاعات التحوير التعبير بعد واحد بلعة تحت السطحية تسليم AAV9. وكان ينظر إلى التعبير غفب مكثفة باستمرارفي الخلايا العصبية والخلايا الدبقية، والمحاور الهبوطية / الصاعدة من خلال أجزاء العمود الفقري حقن. وأظهرت هذه الدراسة لأول مرة أن الأم الحنون يمثل الحاجز الأساسي الذي يحد من انتشار AAV9 فعالة في لحمة في العمود الفقري من الفضاء داخل القراب. في حين أن هذه التقنية التي تم تطويرها سابقا وجهاز حقن تحت الجلد من السهل نسبيا للاستخدام في القوارض الكبيرة (مثل الفئران) أو الخنازير الكبار، والنظام ليست مناسبة للاستخدام في الحيوانات الصغيرة، مثل الفئران الكبار. ونظرا لارتفاع عدد نماذج الماوس المعدلة وراثيا المتاحة من مجموعة متنوعة من الاضطرابات العصبية، وهناك حاجة واضحة لتطوير فعالة النخاع متني متجه تقنية تسليم ناقلات في الفئران. توافر مثل هذه التقنية من شأنه أن يسمح لدراسة تأثير إسكات الجينات محددة (على سبيل المثال، باستخدام شرنا) أو أوبريغولاتيون باستخدام خلية غير محددة (على سبيل المثال، الفيروس المضخم للخلايا-سمف أو أوبيكيتين) أو خلية محددة (على سبيل المثال، سينابسين أو غليال الحمضية الليفيةالبروتين (غفاب)) المروجين خلال مرحلة ما بعد الولادة في مرحلة مبكرة أو تحت ظروف مريضة.
وبناء على ذلك، في هذه الدراسة، قمنا بتطوير والتحقق من صحة نظام تسليم ناقلات تحت القشرية مصغرة التي يمكن استخدامها على نحو فعال في الفئران الكبار. وبالمثل، كما هو الحال في الدراسات الفئران والخنازير السابقة، ويوضح هذا العمل التعبير التحوير قوية في جميع أنحاء الحمة الشوكي بعد واحد البلعة تحت الجلد تسليم AAV9 في الفئران. بساطة هذا النهج، والتحمل جيد جدا من الفئران حقن إلى تسليم AAV9 تحت السطحية، وفعالية عالية للتعبير التحوير في حمة الشوكي تشير إلى أن هذه التقنية يمكن تنفيذها على نحو فعال في أي إعداد المختبر واستخدامها في التجارب التي تستهدف التعبير الجيني في العمود الفقري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أجريت هذه الدراسات في إطار بروتوكول وافقت عليه لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية من جامعة كاليفورنيا، سان دييغو وكانت في الامتثال مع جمعية لتقييم المبادئ التوجيهية رعاية الحيوان المختبر للاستخدام الحيوان. وقد أجريت جميع الدراسات بطريقة تقلل إلى أدنى حد حجم المجموعة والمعاناة الحيوانية.
1. عام الحيوان وإعداد الجراحية
- قبل البدء في الإجراء الجراحي، ذوبان الجليد الفيروس (AAV9-UBI- غفب، 5 قسامات ميكرولتر) 8 . إعداد 5٪ ديكستران (10000 ميغاواط) الحل عن طريق خلط مسحوق ديكستران في الماء المقطر. مزيج من حل الفيروس مع 5٪ حل ديكستران 1: 1 إلى تركيز ديكستران النهائي من 2.5٪.
- تخزين محلول فيروس على الجليد (4 درجة مئوية).
- استخدام الكبار C57BL / 6J الفئران (الذكور والإناث، 20-30 ز). تخدير الفئران باستخدام 5٪ إيسوفلوران (في O 2 ، 1 لتر / دقيقة) والحفاظ عليها في 2-3٪ استنشاق إيسوفلوران (في O 2 ، 1 لتر / دقيقة) بواسطة مخروط الأنف أثناء الجراحة، وهذا يتوقف على معدل التنفس واستجابة قرصة مخلب.
- يحلق الجزء الخلفي من الحيوانات مع كليبرز الحلاقة وتنظيف الجلد مع 2٪ الكلورهيكسيدين.
- في دراسات الانتعاش المزمن تتبع تقنية معقمة صارمة.
- إذا الحقن القطنية تحت القشرية التي يتعين القيام بها، وقطع الجلد تراكب الفقرات TH8-L1 مع مشرط وفصل العضلات الفقرية من الفقرات العمود الفقري TH10-12 باستخدام مقص.
- جبل الحيوان في إطار التجسيمي القياسية باستخدام المشابك العمود الفقري الماوس.
- يحلق كلا الجانبين من الصفيحة من الفقرات TH10-12 باستخدام الحفر الأسنان (مثقاب: 0.9 ملم، والسرعة: 20،000 دورة في الدقيقة) حتى تظهر الشقوق.
- إزالة شظايا العظام متصدع مع ملقط وفضح السطح الظهري من الحبل الشوكي القطني.
- قطع فتح الجافية حوالي 1 سم باستخدام 30 G الفولاذ المقاوم للصدأ إبرة وملقط.
- إزالة الغشاء أتلانتو القذالي من الصهريج ماجنا باستخدام 23G إبرة الفولاذ المقاوم للصدأ وملقط.
- تنظيف موقع شق من أي الأنسجة والحطام العظام باستخدام مسحات القطن.
- قطع فتح الجافية حوالي 2-3 ملم باستخدام 30 G الفولاذ المقاوم للصدأ إبرة وملقط.
2. فتح غشاء بيال وإدراج إبرة سوبالي ل AAV9 التسليم
- جبل 34 G بيا اختراق إبرة في Z- الذراع من مناور شيز باستخدام حامل الزجاج الشعرية ( الشكل 1A و B ).
ملاحظة: لتصنيع إبرة اختراق بيا، وشحذ مشطوف الأصلي من إبرة 34G وشحذ باستخدام بيفيلر الزجاجية الشعر مع لوحة الماس جلخ - الخشنة (5.0 ميكرون إلى 50 ميكرون الأحجام نصيحة) وزاوية طحن15 - 20 °. غيض من الإبرة (1 مم طول، يقاس من طرف) ثم عازمة بلطف إلى حوالي 90 درجة ( الشكل 1B ، إدراج اليسار). - باستخدام نطاق تشريح الجراحي، وتعيين إلى 8-10 X التكبير، اختراق الحنون مع إبرة اختراق حنون عن طريق 1 ملم ( الشكل 1C ) باستخدام X- الذراع.
- الحفاظ على زاوية إبرة اختراق على سطح الأنسجة في 5-10 درجة.
- بعد افتتاح حنون، وإزالة إبرة اختراق حفرة بين أفقيا من الفضاء القزح ( الشكل 1 D) باستخدام X- الذراع.
ملاحظة: تذكر الموقع الذي تم اختراقه من قبل معلم، مثل الأوعية الدموية. - تحميل إبرة الحقن 36G حادة مع فيروس AAV9-UBI- غفب باستخدام ميكروسيرينج 50 ميكرولتر متصلة إبرة الحقن مع بي-10 أو بي-20 الأنابيب.
- جبل الإبرة في Z- الذراع من مناور شيز الثاني ( الشكل 1A B ) باستخدام حامل الزجاج الشعرية ( الشكل 1B ، إدراج الحق).
ملاحظة: لتصنيع إبرة حقن AAV9 تحت السطحية، يتم مصقول غيض حادة من إبرة 36 G باستخدام الزجاج الشعيرات الشعرية مع الماس جلخ لوحة - الخشنة (5.0 ميكرون إلى 50 ميكرون الأحجام نصيحة) لإزالة حواف حادة. غيض من الإبرة (2-3 ملم طول، يقاس من طرف) ثم عازمة بلطف إلى حوالي 90 درجة. يتم إدخال إبر الحقن اختراق و سوبتيال في 1-2 سم طويلة 20G الرقيق أنابيب الفولاذ المقاوم للصدأ (10 ملم من نهاية الإبرة) وصقها مع الايبوكسي. مطلوب استخدام 20 G (0.91 مم قطرها) أنابيب لمرفق آمن إلى حامل الزجاجية الشعرية. - من خلال التلاعب X، Y، Z الأسلحة من مناور الثاني، وضع غيض من إبرة الحقن AAV9 في الموقع اختراق بيا ثم تقدمه حوالي 2-3 ملم في الفضاء تحت القاع من خلال افتتاح غشاء بيال السابق باستخدام X-الذراع( الشكل 1E و F ).
ملاحظة: 1) يتم إعداد AAV9-UBI- غفب وفقا لبروتوكولات ذكرت سابقا 9 ، 10 ، ويتم تعديل التتر النهائية إلى 1.2 × 10 13 نسخ الجينوم لكل مل (غ / مل). 2) ليست هناك حاجة لوضع علامة على موقع افتتاح بيال لأنه يمكن التعرف عليها بسهولة ( الشكل 1D ). - حقن AAV9-UBI- غفب (1.5، 3، أو 5 ميكرولتر) في الفضاء تحت القاع باستخدام ميكروسيرينج 50 ميكرولتر (انظر الجدول 1 للمجموعات التجريبية).
- إزالة إبرة الحقن من الفضاء تحت القاع بعد حقن AAV9-UBI- غفب كاملة.
- إغلاق العضلات والجلد باستخدام 4.0 خيط حيدة ومقاطع الجراحية.
ملاحظة: ليست هناك حاجة لختم فقرة مفتوحة. - السماح للحيوانات لاسترداد على وسادة التدفئة.
- للسيطرة على الألم حقن البوبرينورفين 0.05 ملغ / كغ / سك كل 12 ساعة ل2-3 أيام بعد الجراحة.
3. التروية التثبيت، الأنسجة كريوبروتكتيون، و المناعي تلطيخ
- في وقت محدد سلفا بعد الحقن AAV9 سوبالي، تخدير عميق الفئران مع القتل الرحيم حل (انظر جدول المواد ، 0.3 مل) وترانسكارديالي يروي لهم 20 مل من الهيبارينيز المالحة تليها 20 مل من بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني.
- تشريح الحبل الشوكي والعقول باستخدام رونجور العظام وبعد إصلاحها في 4٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- كريوبروتيكت الحبل الشوكي والعقول مع 30٪ السكروز في برنامج تلفزيوني لمدة لا تقل عن 5-7 أيام.
- قطع الاكليلية، عرضية، أو طولية / أقسام المجمدة الأفقية (30 ميكرون سميكة) على ناظم البرد وتخزينها في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية.
4. المناعي تلطيخ الحبل الشوكي وأقسام الدماغ (انظر جدول المواد)
- احتضان أقسام العائمة الحرة في بريمارy بين عشية وضحاها.
- بعد الحضانة مع الأجسام المضادة الأولية، وغسل المقاطع ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني واحتضان مع مضان مترافق حمار مكافحة الأرنب، حمار مكافحة الدجاج، والحمار المضادة للماعز الأجسام المضادة الثانوية.
- تركيب المقاطع على الشرائح المجهرية، وتجفيفها في درجة حرارة الغرفة، وتغطيتها مع المتوسطة المضادة للتلاشي.
- التقاط الصور باستخدام المجهر مضان إبيفلورزنس (الأهداف: 10X، نا-0.3؛ 20X، نا-0.8؛ و 63 X، نا-1.4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
التعبير عن التحوير القوي في قطاعات حقن AAV9 تحت الأفرع:
أظهر تحليل التحوير (غفب) التعبير في أقسام الحبل الشوكي في 14 يوما بعد تسليم AAV9 AAV9 جرعة التعبير غفب تعتمد في جميع أنحاء الحمة الشوكي. أولا، تم ربط اثنين من ثلاثة حقن 3 ميكرولتر من AAV9-UBI- غفب حقن في الجزء السفلي من الطابق السفلي تحت القاحلة مع العدوى شبه كاملة من المادة البيضاء والرمادية في الحبل الشوكي القطني كله، وتمتد إلى الجزء العلوي من الصدر ( الشكل 2A و 2 B ، الأعمدة اليسرى والمتوسطة). واثنين من ثنائي 1.5 حقن ميكرولتر من AAV9-UBI- غفب في الجزء العلوي من الطابق السفلي تحت القاعية الفضاء مع نفس العدوى شبه كاملة من المادة البيضاء والرمادية في الحبل الشوكي القطني كله (كما رأينا بعد حقن 3 ميكرولتر). ومع ذلك، أظهرت شرائح منتصف الصدر فقط الخلايا العصبية المصابة في بعض الأحيان (أس = "زفيغ"> الشكل 2B، العمود الأيمن). أظهر تلطيخ مع α- موتونورون محددة (تشات) والأجسام المضادة الخاصة الخلايا العصبية (نيون) التعبير غفب ثابت في جميع السكان من الخلايا القطنية α-موتورنورونس ( الشكل 2C ) و إنترنيورونس المترجمة في القرن الظهري ( الشكل 2D )، منطقة وسيطة ( الشكل 2E )، والقرن بطني ( الشكل 2F ). ثانيا، اثنين من حقن عنق الرحم الثنائي من AAV9 (5 ميكرولتر لكل حقن) أدى إلى التعبير غفب مماثل في المادة البيضاء والرمادية في الحبل الشوكي عنق الرحم كله (المادة الرمادي والأبيض) وفي الجزء العلوي من الصدر ( الشكل 3A و 3 B ) . وأظهر تحليل أقسام الحبل الشوكي القطني في نفس الحيوانات كثافة عالية من غفب + محاور تنازلي تنتهي في محيط القطني غفب سلبية α موتورونورونس و إنترنيورونس ( الشكل 3Cو 3D ). وكان تسليم اثنين من عنق الرحم الثنائي واثنين من الثنائي القطني العلوي الحقن من AAV9 (5 ميكرولتر لكل حقنة) ارتبط مع التعبير غفب في الحبل الشوكي بأكمله، من عنق الرحم العلوي إلى أجزاء العجزية، وكان موجودا الحاضر في المادة البيضاء والرمادية ( الشكل 3E- 3H ).
الوراء و إنتيروغريد التعبير بوساطة النقل التحوير في السيارات فوق النخاعي ومراكز الحسية:
وقد ارتبط التعبير غفب على نطاق واسع في الحبل الشوكي القطني أو عنق الرحم بعد تسليم AAV9 القروية مع رجعية قوية و إنتيروغريد بوساطة الإيجابية غفب العدوى في المحاور النازل فوق الصوتية المتسعة والخلايا العصبية الإسقاط وفي المحاور والمحطات من تصاعدي المسالك ( الشكل 4 ). وهكذا، كان ينظر إيجابية قوية غفب في الخلايا العصبية المترجمة في تشكيل شبكية (رف)، نواة روبر (نر)، والقشرة الحركية (ماك) ( الشكل 4B- 4D ). وبالمثل، كان ينظر واضحة مناعية غفب المناعية في محطات من المخيخ النخاعي (سكت)، سبينوريتيكولار، و سبينوثالاميك المسالك (ست) ( الشكل 4B- 4D ).
الشكل 1 : الإعداد التجريبي لتنفيذ الحقن الشوكي في العمود الفقري في الماوس الكبار. ( A ) لأداء الحقن في العمود الفقري الشوكي في الفئران الكبار، وتستخدم اثنين من المتلاعبين شيز منفصلة (الأول والثاني). ( B ) Z- الذراع من كل مناور يحمل حامل الزجاج الشعرية. حامل الشعرية واحد يحمل حفرة بيا إبرة 34 G الإبرة، والثاني يحمل حادة إبرة الحقن 36 G تحت الجلد. ( C و D و E و F) الصور التي تصور موقف إبرة اختراق حفرة بعد ثقب الحفرة البازلاء ( C ؛ تم إزالة المادة الجافية بالفعل)، بعد إزالة إبرة اختراق بيا ( D )، بعد إدراج طرف إبرة الحقن تحت الجلد ( E )، وبعد التقدم إبرة الحقن تحت 3 ملم في الفضاء تحت القاع ( F ). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 : قوية العمود الفقري متني غفب التعبير بعد القطني سوببيال AAV9-UBI- غفب التسليم في الفئران الكبار. ( A ) تم تسليم اثنين من الحقن الثنائية من AAV9-UBI- غفب (1.5 أو 3 حقن ميكرولتر لكل منهما) في الجزء السفلي القطنيوبيبيال الفضاء، وكانت الحيوانات نضح ثابتة 14 يوما بعد تسليم AAV9. ( B ) التعبير غفب مكثفة في الرمادي (داخل منطقة منقط) والمواد البيضاء، وتمتد من أسفل الظهر إلى الجزء العلوي من الصدر، ويمكن أن ينظر إليه في الحيوانات حقن 3 + 3 ميكرولتر من AAV9 (الأعمدة اليسرى والمتوسطة). ( C، D، E، F ) تلطيخ مشترك من أقسام الحبل الشوكي عرضية مأخوذة من توسيع القطني في الحيوانات حقن مع 3 + 3 ميكرولتر من AAV9 تظهر التعبير غفب في جميع تقريبا تشات (α- موتونورون علامة) -positive α- ( C و F ) و إنترنيورونس نيون إيجابية في القرن الظهرية ( D ) ومنطقة وسيطة ( E ). الحانات مقياس = 1،000 ميكرون (B). 30 ميكرون (C)؛ 100 ميكرون (دف). د: الظهرية القرن. لف: الصفيحة V؛ ف: القرن البطني. الرجاء انقر هنا لعرض أكبررسيون من هذا الرقم.
الشكل 3: مقارنة التعبير غفب العمود الفقري بعد العمود الفقري العنقي في العمود الفقري مقابل العمود الفقري العنقي سوببيال سوببيال قطني AAV9-UBI- غفب التسليم في الفئران الكبار. ( A، B، C و D ) قسم الأفقي قطع من خلال طول كامل من الحبل الشوكي في حيوان التي تلقت في وقت سابق حقن عنق الرحم العلوي سوببيال من AAV9-UBI- غفب (5 + 5 ميكرولتر). ويمكن رؤية التعبير غفب مكثفة في المادة البيضاء والرمادية في منطقة عنق الرحم ( B ). في الحبل الشوكي القطني، وكثافة عالية من غفب + محاور تنازلي في فونيكولوس الجانبي (لف) والمادة الرمادية بين نيون إيجابية ولكن الخلايا العصبية غفب سلبية يمكن تحديد ( C و D ). ( E، F، G، H الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4
| المجموعات التجريبية | موقع / مستوى تسليم AAV9 (*) | حجم الجين AAV9، معدل التسريب | بقاء الوقت | تحليل الأنسجة |
| المجموعة أ (ن = 7) | C2 (ثنائي) | 5 ميكرولتر / 5 دقائق | 14 يوما | الدماغ + الحبل الشوكي |
| المجموعة ب (ن = 12) | L1-L2 (ثنائي) | 1.5 ميكرولتر أو 3μL، 60 ثانية / ميكرولتر | 14 يوما | الدماغ + الحبل الشوكي |
| المجموعة C (العدد = 6) | C2 + L1-L2 (ثنائي في كل مستوى) | 5 ميكرولتر / 5 دقائق | 14 يوما | الحبل الشوكي |
| * - ثنائي= اثنين من الحقن تحت الباطن واحد تسليمها إلى اليمين واحد إلى اليسار الفضاء الفرعي من قطاع حقن (ق) يتم تنفيذها. | ||||
الجدول 1: المجموعات التجريبية. أجريت جميع التجارب في الكبار C57BL / 6J الفئران.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وتصف الدراسة الحالية تقنية ناقلات تحت القفص (AAV9) تسليم الفئران البالغة. كما هو مبين في الفيديو المصاحب، يمكن استخدام هذا النهج والتقنية على نحو فعال، شريطة أن يتم تصنيع الأدوات المطلوبة والإبرة اختراق بيا إبرة وحقن تحت الجلد بشكل صحيح، وفقا للمواصفات المعمول بها واختبارها.
المتغيرات التقنية الحرجة في أداء الحقن السماوي ثابت وآمن في الفئران:
كما هو موضح، يمكن إجراء الحقن تحت الباطن بسهولة في الفئران تخدير الكبار بعد الظهرية عنق الرحم أو استئصال الصفائح القطنية. هناك العديد من المتغيرات التقنية الهامة التي تحدد نجاح تقنية الحقن تحت الباطن. أولا، غيض من 34 G بيا اختراق إبرة يحتاج إلى شحذ باستمرار باستخدام بيفيلر لضمان ثقب على نحو سلس من الحنون. أي تناقضات في تقنية حول كيفية شحذ إبرة يمكن أن يؤدي إلى ديفيكواللتيس خلال اختراق الحنون و / أو يمكن أن يسبب إصابة في العمود الفقري باستخدام الكثير من القوة لثقب الحنون. في ظل الظروف العادية (كما هو مبين في الفيديو وفي الشكل 1C و D )، وموقع افتتاح بيا لم يظهر أي علامة على إصابة الحبل الشوكي أو نزيف تحت السطحية. في بعض الحالات، يمكن أن ينظر إلى بعض النزيف تحت القحف، ولكن تم العثور على هذا لا يمكن أن تترافق مع ضعف عصبي أو تغيير التعبير الجيني بعد تسليم AAV9. ثانيا، من المهم للحفاظ على الموقع الجراحي خالية من الدم بعد إزالة الجافية باستخدام كهربي. أي بقايا الدم المتقطعة يمكن أن تحجب تحديد موثوق بها من سطح حنون، حتى لو تم استخدام المجهر الجراحي. كما هو مبين في الشكل 1C-F ، خالية من الدم موقع استئصال الصفائح الدموية يمكن الحفاظ على نحو فعال باستخدام قطع هلام صغيرة الرغوة لتغطية الفقرات لامينكتوميزد والأنسجة الرخوة المحيطة بها. ثالثا، يجب إيلاء اهتمام خاص لوضع مناسب للحيوانات تخدير فيالإطار الشوكي، وتجميد العمود الفقري باستخدام المشابك في العمود الفقري. استخدام الكثير من الضغط أثناء وضع المشابك العمود الفقري يمكن أن يسبب تمزق الفقري. باستخدام ضغط غير كاف يمكن أن يؤدي إلى تخفيف التدريجي للفقرة يجمد، والذي يحدث عادة مرة واحدة يتم استخدام الحفر الأسنان لأداء استئصال الصفح.
يرتبط حجم AAV9 تحت سوباليالي مع حجم التعبير روسترو-كودال التحوير. وهكذا، كان استخدام اثنين من قطني الثنائي حقن AAV9 تحت الجلد (3 + 3 ميكرولتر أو 5 + 5 ميكرولتر) مع التعبير غفب ثابت في الرمادي القطني كله والمواد البيضاء، وتمتد تصل إلى الجزء العلوي من الصدر. كان هناك تباين ضئيل بين الحيوانات المستخدمة. AAV9 أحجام حقن 1.5 + 1.5 ميكرولتر أدى إلى التعبير غفب مماثل في قطاعات المترجمة في محيط الحقن. ومع ذلك، كان انتشار الفيروس وما ينتج عنها من التعبير غفب محدودة في القطاعات الصدرية ( الحد من الجيني سوببيال تقنية التسليم: تطبيقات المستقبل من سوببيالجين تقنية التوصيل: على سبيل المثال، من خلال استخدام ناقلات شرنا إسكات، فمن المتوقع أن انخفاض فعال للغاية في التعبير عن الجينات تحور (على سبيل المثال، الهيئة العامة للسدود في حالة الشكل الموروثة من ألس) سيتم تحقيقه في جميع أنحاء الحبل الشوكي وكذلك في سبينالي - تطوير نوى المحرك الدماغ. ثانيا،بسبب العدوى فعالة للغاية من محاور عصبية المادة العمود الفقري، والجينات العلاجية (على سبيل المثال، عوامل النمو ترميز) يمكن أوبريغولاتد لتعزيز محور عصبي تنتشر في الحيوانات المصابة الصدمة الصدمة. ثالثا، من خلال التلاعب في حجم أو عيار من الفيروس تسليمها تحت سطحيا وكذلك موقع الحقن تحت الباطن، والتعبير عن التحوير يمكن أن تستهدف منطقة منفصلة من الحبل الشوكي (على سبيل المثال، قرن الظهرية من جانب واحد). يمكن استخدام تعبير التحوير الموضعي في الألم أو التشنج العضلي - تعديل العلاج عن طريق أوبريغولاتينغ أنظمة الناقلات العصبية المثبطة (على سبيل المثال، غابا) أو تثبيط نظم مثيرة (على سبيل المثال، نظام مستقبلات الغلوتامات المقترنة). رابعا، بالإضافة إلى تسليم آف، جزيئات أخرى أو ناقلات مع ضعف الدم في الدماغ حاجز نفاذية (على سبيل المثال، الرنا الصغير) من المرجح أن يتم تسليمها بشكل أكثر فعالية في حمة الشوكي بعد الولادة القروية. هذه يمكن اختبارها بشكل فعال من قبل أوسينg التقنية الموصوفة في هذه المخطوطة. وأخيرا، كما هو مبين في الدراسة الحالية، يمكن أن تستخدم تقنية سوببيال بنجاح في الفئران الكبار مع متوسط وزن الجسم (بو) بين 20 و 30 ز. وبالتالي، فمن المرجح أن نفس التقنية والإعداد التجريبي يمكن استخدامها في الأنواع الحيوانية الأخرى مع بو مماثلة (على سبيل المثال، الجراء سبراغ-داولي (سد) الفئران). بو من P6 و P21 سد الفئران حوالي 17 و 62 غرام، على التوالي. استخدام الجراء الفئران خلال المرحلة المبكرة من مرحلة ما بعد الولادة يمكن أن تكون أداة مفيدة لدراسة دور جين معين يصل أو دونريغولاتيون في تطوير الدوائر العصبية في العمود الفقري والمعالجة الحسية والحركية.
واحدة من القيود النسبية لتقنية الحقن تحت الباطن (بالمقارنة مع التسليم داخل القراب) هو طبيعة أكثر الغازية من هذا النهج عندما يجب إجراء استئصال الصفح الظهرية للسماح بالوصول إلى السطح الظهري من الحبل الشوكي. ومع ذلك، فإن التعبير التحوير قوية ينظر في جميع أنحاء الحبل الشوكي وفي مراكز الدماغ فوق الكتف تظهر للتدليل على ميزة واضحة على تسليم آف داخل القراب، والذي يتميز التعبير التحوير الانتقائي في مجموعة فرعية من α- موتورنورونس و أفيرنتس الأولية (ولكن ليس حاضرا في الخلايا العصبية في أعماق الحبل الشوكي المصفي) 8 .
وبالمثل، كما هو مبين في الدراسات السابقة في الفئران والخنازير الكبار، يمكن تحقيق التعبير التحوير فعالة للغاية في المادة الشوكية البيضاء والرمادية في الفئران الكبار باستخدام تسليم AAV9 سوبتيال. وبالإضافة إلى ذلك، بسبب أبعاد أصغر نسبيا (ولا سيما طول) من الحبل الشوكي الماوس، وتسليم AAV9 في اثنين فقط من مستويات الحبل الشوكي (العلوي عنق الرحم والجزء السفلي من الظهر) كافية لتؤدي إلى شبه كاملة التهاب الحبل الشوكي. هذه الخاصية يمكن أن يكون لها تأثير هام في تصميم محددة نهج العلاج تعديل المرض إما عن طريق إسكات الجينات المستهدفة أو أوبريغولاتيون.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
مارتن مارسالا هو المؤسس المشارك لشركة نيورجين تكنولوجيز، وشركة (سان دييغو، الولايات المتحدة الأمريكية).
Acknowledgments
وقد دعمت هذه الدراسة من قبل مؤسسة سانبورك ومنحة مؤسسة ألسا (مارتن مارسالا)؛ البرنامج الوطني للاستدامة، رقم المشروع LO1609 (وزارة التعليم التشيكية والشباب والرياضة)؛ و رفو: 67985904 (ستيفان جوهاس وجانا جوهاسوفا).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J Mice | Jackson Labs | 664 | |
| Lab Standard Stereotaxic for Mice | Harvard Apparatus | 72-9568 | |
| Mouse Spinal Adaptor | Harvard Apparatus | 72-4811 | |
| XYZ Manipulator | Stoelting | 51604 | |
| Manual Infusion Pump | Stoelting | 51218 | |
| 34G Beveled Nanofill Needle | World Precision Instruments | NF34BV-2 | |
| 36G Blunt Nanofill needle | World Precision Instruments | NF-36BL-2 | |
| Fluriso, Isoflurane | MWI Veterinary Supply | 502017 | |
| Chlorhexidine Solution | MWI Veterinary Supply | 501027 | |
| 20G Stainless Steel Needle | Becton-Dickinson | 305175 | |
| 23G Stainless Steel Needle | Becton-Dickinson | 305145 | |
| 30G Stainless Steel Needle | Becton-Dickinson | 305128 | |
| Cotton Tipped Applicator | MWI Veterinary Supply | 27426 | |
| Glass Capillary Beveller | Narishige International | SM-25B | |
| Slide Microscope Superfrost | Leica Microsystems | M80 | |
| 50 μL Microsyringe | Hamilton | 81242 | |
| BD Intramedic PE-20 Tubing | Becton, Dickinson | 427406 | |
| BD Intramedic PE-10 Tubing | Becton, Dickinson | 427401 | |
| 4-0 monofilament suture | VetOne | V1D397 | |
| Glass Capillary Beveller | Narishige | Pipet Micro Grinder EG-40 | |
| 5 min Epoxy (Epoxy Clear) | Devcon | 14310 | |
| Euthanasia Solution | MWI Veterinary Supply | 11168 | |
| Heparin Inj 1,000 U/mL | MWI Veterinary Supply | 54254 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Anti NeuN Antibody | EMD-Millipore | ABN78 | Primary Rabbit Polyclonal Antibody, 1:1000 |
| Anti-Choline Acetyltransferase (CHAT) Antibody | EMD-Millipore | AB144P | Primary Goat Polyclonal Antibody, 1:100 |
| Anti GFP Antibody | Aves Labs | GFP-1020 | Primary Chicken Polyclonal Antibody, 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A21207 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 680 | ThermoFisher Scientific | A10043 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Donkey anti-Chicken IgY Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Jackson Immunoresearch Labs | 703-545-155 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Donkey Anti-Goat IgG H&L (Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150131 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Slide Microscope Superfrost | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Fisher Scientific | P36930 | |
| Epifluorescence Microscope | Zeiss | Zeiss AxioImager M2 | |
| Fluorescence Confocal Microscope | Olympus | Olympus FV1000 | |
| Dextran | Polysciences, Inc | 19411 | |
| AAV9-UBC-GFP | UCSD Viral Vector Core Laboratory |
References
- Foust, K. D., et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2009).
- Duque, S., et al. Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons. Mol Ther. 17 (7), 1187-1196 (2009).
- Gray, S. J., et al. Preclinical differences of intravascular AAV9 delivery to neurons and glia: a comparative study of adult mice and nonhuman primates. Mol Ther. 19 (6), 1058-1069 (2011).
- Meyer, K., et al. Improving single injection CSF delivery of AAV9-mediated gene therapy for SMA: a dose-response study in mice and nonhuman primates. Mol Ther. 23 (3), 477-487 (2015).
- Foust, K. D., et al. Therapeutic AAV9-mediated suppression of mutant SOD1 slows disease progression and extends survival in models of inherited ALS. Mol Ther. 21 (12), 2148-2159 (2013).
- Passini, M. A., et al. Translational fidelity of intrathecal delivery of self-complementary AAV9-survival motor neuron 1 for spinal muscular atrophy. Hum Gene Ther. 25 (7), 619-630 (2014).
- Bell, P., et al. Motor neuron transduction after intracisternal delivery of AAV9 in a cynomolgus macaque. Hum Gene Ther Methods. 26 (2), 43-44 (2015).
- Miyanohara, A., et al. Potent spinal parenchymal AAV9-mediated gene delivery by subpial injection in adult rats and pigs. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16046 (2016).
- Xu, Q., et al. In vivo gene knockdown in rat dorsal root ganglia mediated by self-complementary adeno-associated virus serotype 5 following intrathecal delivery. PLoS One. 7 (3), 32581 (2012).
- Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus. J Virol. 72 (3), 2224-2232 (1998).
