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Neuroscience

成体マウスにおける子宮頸部アデノ随伴ウイルス9(AAV9)ベクター送達

doi: 10.3791/55770 Published: July 13, 2017

Summary

本研究の目的は、成体マウスにおける新規な遺伝子サブ送達技術を用いて、脊髄アデノ随伴ウイルス9(AAV9)媒介遺伝子送達の効力および安全性を開発および検証することであった。

Abstract

成体ラットおよびブタにおける亜麻痺性アデノ随伴ウイルス9(AAV9)ベクター送達技術の成功した開発は以前に報告されている。 AAV9送達のために下位に配置されたポリエチレンカテーテル(PE-10またはPE-5)を使用して、脊髄実質を介した潜在的なトランスジーン発現(白人および灰白質)が、浅部注射された脊髄セグメントにおいて実証されている。神経変性疾患のトランスジェニックマウスモデルの広い範囲のため、成体マウスにおける強力な中枢神経系(CNS)標的化ベクター送達技術の開発に対する強い要望がある。したがって、本研究は、成体C57BL / 6Jマウスにおいて安全かつ有効な脊髄AAV9送達を可能にする脊髄小脳ベクター送達装置および技術の開発を記載する。脊椎固定化および麻酔したマウスでは、XYZマニピュレータを用いて、脊髄(頚部1および腰部1-2の脊髄分節レベル)を鋭利な34Gの針で切開した。第2のXYZma次いで、鈍い36G針を腰部および/または頸部の胸部空間に進めるために、ニプレーターを使用した。次いで、緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードするAAV9ベクター(3-5μL; 1.2×10 13ゲノムコピー(gc))を皮下注射した。注射後、神経機能(運動および感覚)を定期的に評価し、4%パラホルムアルデヒドでAAV9送達してから14日後に動物を灌流固定した。水平または横断脊髄切片の分析は、灰白質および白質の両方において、脊髄全体にわたって導入遺伝子発現を示した。さらに、強く逆行的に媒介されるGFP発現は、運動皮質、核破裂部および網様体における下行運動軸およびニューロンにおいて見られた。いずれの動物においても神経学的機能障害は認められなかった。これらのデータは、小児ベクター送達技術が、処置関連の脊髄損傷を引き起こすことなく、成体マウスにおいて首尾よく使用され得、非常に強力な導入遺伝子発現に関連することを示す脊髄神経叢全体にわたって

Introduction

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多様な脊髄およびCNS神経変性疾患を治療するためのAAVベクターの使用は、関心のある遺伝子の発現を効果的にアップレギュレートまたはサイレンシングするための十分に容認されたプラットフォームとなっている。 CNS /脊髄障害を治療するためのこの技術のより有効な利用に対する重要な制限の1つは、成人哺乳動物の深部脳または脊髄実質にAAVベクターを送達する能力が限られていることである。

それは大人の齧歯類、ネコ、または非ヒト霊長類におけるAAV9の全身送達は、脳や脊髄の1、2、3のニューロンに導入遺伝子発現を誘導することでのみ適度に有効であること、例えば、実証されました。 AAV9ベクターのより効果的な髄腔内送達は、解剖学的に定義されたニューロンのプールにおいて限られたトランスジーン発現しかもたらさないことも示されている。より具体的には、それは悪魔非ヒト霊長類、ブタ、またはげっ歯類におけるcisternalまたはlumbo-sacralの髄腔内髄腔内AAV9送達が、脊髄α-運動ニューロンおよび部分的な背根神経節ニューロンにおいて高レベルのトランスジーン発現をもたらすことを示している。しかし、脊髄介在ニューロン又は昇順または白質における下降軸索における最小または全く発現は、4、5、6、7見ています。まとめると、これらのデータは、髄腔内に送達されたAAVのより深い脊柱実質への拡散を防止する、非常に有効な生物学的 - 解剖学的障壁が存在することを示す。

成体ラットおよびブタを用いた以前の研究では、新規な小児ベクター送達技術が開発された8 。このアプローチを使用して、単一ボーラスAAV9送達後に、非常に強力で多セグメントのトランスジーン発現が実証された。激しいGFP発現が一貫して見られた神経細胞、グリア細胞、および下垂/上行軸索において、注入された脊髄分節を通過する。この研究は、髄膜腔からの脊髄実質への効果的なAAV9の拡散を制限する主な障壁であることを初めて実証した。この以前に開発された技術および小児注射デバイスは、大きなげっ歯類(ラットのような)または成人のブタで使用するのが比較的容易であるが、成体マウスのような小型動物での使用には適していない。様々な神経変性障害の利用可能なトランスジェニックマウスモデルの数が多いため、マウスにおける効果的な脊柱 - 実質細胞ベクター送達技術の開発が明らかに必要とされている。そのような技術の利用可能性は、細胞非特異的( 例えば、サイトメガロウイルス-CMVまたはユビキチン)または細胞特異的( 例えば、シナプシンまたはグリア)を用いた特異的遺伝子サイレンシング( 例えば、 shRNAを用いる)またはアップレギュレーションの研究を可能にする線維性酸性プロテイン(GFAP))プロモーターの活性を阻害する可能性がある。

したがって、本研究では、成体マウスにおいて効果的に使用され得る小型の小児ベクター送達システムを開発し、検証した。同様に、以前のラットおよびブタの研究の場合と同様に、この研究は、マウスにおける単球ボーラスsubpial AAV9送達後の脊柱実質全体にわたる有力なトランスジーン発現を実証する。このアプローチの単純さ、腹腔内AAV9送達に対する注射されたマウスの非常に良好な忍容性、および脊髄実質における導入遺伝子発現の高い効力は、この技術が任意の実験室環境において効果的に実施され得、脊髄遺伝子発現を標的とする実験において使用され得ることを示唆する。

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Protocol

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これらの試験は、カリフォルニア大学サンディエゴ校の動物実験および使用委員会の承認を受けたプロトコールのもとで実施され、動物実験のための動物実験ガイドライン評価協会に準拠しています。すべての研究は、群の大きさおよび動物の苦痛を最小限に抑えるように実施した。

1.一般的な動物および外科的調製物

  1. 手術を開始する前に、ウイルスを解凍する(AAV9-UBI-GFP;5μLアリコート) 8 。デキストラン粉末を蒸留水に混合して5%デキストラン(10,000 MW)溶液を調製する。ウイルス溶液を5%デキストラン溶液と1:1で混合し、2.5%の最終デキストラン濃度にする。
    1. ウイルス溶液を氷上に保存する(4℃)。
  2. 成体C57BL / 6Jマウス(オスおよびメス、20〜30g)を使用する。 5%イソフルラン(O 2、1L /分)を用いてマウスを麻酔し、 2で維持する-3%は、呼吸速度及び足ピンチ応答に応じて、手術中、ノーズコーンによってイソフルラン(O 2中、1 L /分)吸入します。
  3. シェービングクリッパーで動物の背中を剃り、2%クロルヘキシジンで皮膚をきれいにする。
  4. 慢性的な回復研究では、厳密な無菌技術に従う。
  5. 腰椎注射を行う場合は、Th8-L1椎骨の上にある皮膚をメスで切って、はさみを使ってTh10-12脊椎骨から傍脊椎筋を離します。
    1. マウスの脊髄クランプを使用して動物を標準的な定位フレームにマウントする。
    2. 亀裂が現れるまで歯科用ドリル(ドリルビット:0.9mm、速度:20,000rpm)を使用して、Th10-12椎骨の薄層の両面を剃る。
    3. 割れた骨断片を鉗子で除去し、腰椎の背側表面を露出させる。
    4. 30Gステンレススチール針と鉗子を使用して約1cmの硬膜を切る。
  6. 23Gステンレス鋼の針と鉗子を使用して、大槽のアトランタ - 後頭皮膜を除去する。
  7. 綿棒で組織や骨の破片の切開部位をきれいにします。
  8. 30Gのステンレス製の針と鉗子を使用して約2〜3mmの硬膜を切る。

2.膜貫通開口およびAAV9送達のための子宮頸部針挿入

  1. ガラス毛細管ホルダー( 図1AおよびB )を使用して、XYZマニピュレータのZアームに34 Gの貫通針を取り付けます。
    注:貫通針を製造するために、34Gニードルの元の面取りされた先端は、ダイヤモンド研磨板を有するガラスキャピラリーベベル(荒い(5.0μm〜50μmの先端サイズ))および砥石角度15〜20°。針の先端(先端から測定して1mmの長さ)を約90°に緩やかに曲げます図1B 、左のインサート)。
  2. 8-10倍に設定された外科的解剖スコープを使用して、Xアームを用いて約1mm( 図1C )の穿刺針で穿刺する。
    1. 組織の表面に針を通す角度を5~10°に保つ。
  3. 開口部を開いた後、Xアームを用いて平滑筋から水平に貫通した針を抜去する( 1D)。
    注:貫通した場所は、血管などのランドマークで覚えています。
  4. PE-10またはPE-20チューブを注射針に接続した50μLマイクロシリンジを用いて、鈍的36G注射針にAAV9-UBI-GFPウイルスをロードする。
  5. 第2のXYZマニピュレータのZアームに針を取り付けます図1A 図1B、右側インサート)を使用してNG>及びB)。
    注:サブプライアルAAV9注射針を製造するために、36G針の鈍い先端を、ダイヤモンド研磨板 - 粗い(5.0μm〜50μmの先端サイズ)を備えたガラスキャピラリーベベルを用いて研磨し、鋭いエッジを除去する。針の先端(先端から測定して2〜3mmの長さ)を緩やかに約90°に曲げる。穿刺針および穿刺針を1-2cm長の20Gスレーブステンレス鋼管(針の端から10mm)に挿入し、エポキシで接着する。ガラスキャピラリーホルダーに確実に取り付けるためには、直径20 mm(直径0.91 mm)のチューブを使用する必要があります。
  6. 第2マニピュレータのX、Y、Zアームを操作することにより、AAV9注射針の先端を穿刺部位に位置させ、次にこれを使用して、 Xアーム( 図1EおよびF )。
    注:1)AAV9-UBI-GFPは、以前のプロトコル9、10報告し、最終力価は、mL当たり1.2×10 13ゲノムコピー(GC / mLで)に調整されるに従って調製されます。 2)容易に同定できるので、軟口蓋の部位をマークする必要はない( 図1D )。
  7. 50μLのマイクロシリンジを用いて、AAV9-UBI-GFP(1.5、3、または5μL)をサブスペースに注入します(実験グループについては表1を参照)。
  8. AAV9-UBI-GFP注入が完了した後、注射針をサブスペースから外す。
  9. 4.0モノフィラメント縫合糸と外科用クリップを使用して筋肉と肌を閉じます。
    注記:開いた椎骨をシールする必要はありません。
  10. 動物を加熱パッドで回復させる。
  11. 疼痛管理のために、ブプレノルフィン0.05mg / kg / scを12時間毎に手術後2〜3日。

灌流固定、組織凍結保護、および免疫蛍光染色

  1. 亜脂肪族AAV9注射後の所定の時点で、マウスを安楽死溶液(0.3mLの表を参照)で深く麻酔し、20mLのヘパリン処理した生理食塩水、次いで20mLのPBS中の4%パラホルムアルデヒドで経心灌流する。
  2. 骨鉗子を使用して脊髄と脳を解剖し、PBS中の4%ホルムアルデヒドで4℃で一晩後固定する。
  3. 最低5〜7日間、PBS中の30%スクロースで脊髄および脳を凍結保護する。
  4. クライオスタット上で、コロナ、トランスバース、または縦/横の凍結切片(厚さ30μm)を切り取り、PBSに4℃で保存します。

4.脊髄および脳切片の免疫蛍光染色(材料表を参照)

  1. フリーフローティングセクションをprimarでインキュベートするy抗体を一晩インキュベートする。
  2. 一次抗体とのインキュベーションの後、PBSで3回切片を洗浄し、蛍光結合ロバ抗ウサギ、ロバ抗チキンおよびロバ抗ヤギ二次抗体とともにインキュベートする。
  3. 切片を顕微鏡スライド上に載せ、室温で乾燥させ、そして退色防止培地で覆う。
  4. 落射蛍光顕微鏡(対物レンズ:10X、NA-0.3; 20X、NA-0.8;および63X、NA-1.4)を用いて画像を取り込む。

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Representative Results

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亜型AAV9注射部位における有力なトランスジーン発現:
AAV9送達後14日目の脊髄切片における導入遺伝子(GFP)発現の分析は、脊髄実質全体にわたってAAV9用量依存性GFP発現を示した。第1に、上部腰椎腔に注入されたAAV9-UBI-GFPの2回の両側3μL注射は、腰部脊髄全体における白色および灰白質のほぼ完全な感染と関連し、上部胸部セグメントに及んだ( 図2Aおよび2B 、左および中央の列)。 AAV9-UBI-GFPを上部腰椎腔に2回両側に1.5μL注射したところ、3μLの注射後に見られるように、腰部脊髄全体の白色および灰白質の同様のほぼ完全な感染と関連していた。しかし、中胸部セグメントは時折感染したニューロンのみを示した(ass = "xfig">図2B、右の列)。 α-motoneuron特異的(ChAT)およびニューロン特異的(NeuN)抗体による染色は、腰部α-運動ニューロン( 図2C )および後角( 図2D )に位置する介在ニューロン、中間ゾーン図2E )、および腹部ホーン( 図2F )。第2に、AAV9の2回の両側頚部注射(各注射について5μL)は、頸部脊髄全体(灰白質物質)および上胸部セグメント( 図3Aおよび3B )における白質および灰白質において同様のGFP発現をもたらした。同じ動物の腰部脊髄切片の分析は、腰椎GFP陰性α-運動ニューロンおよび介在ニューロンの近くで終結する高密度のGFP +下行性軸索を示した( 図3Cおよび3D )。 AAV9の2つの両側頚椎および2つの両側上部腰椎注射(各注射について5μL)の送達は、頚椎上部から仙骨セグメントまでの脊髄全体におけるGFP発現と関連し、白および灰白質に均一に存在した( 図3E~ 3H )。

脊髄脊髄運動および感覚器における逆行性および前向きトランスポート媒介性トランスジーン発現:
亜胸腺AAV9送達後の腰椎または子宮頸部脊髄における広範なGFP発現は、脊髄下行性軸索およびそれらの突出ニューロンならびに上行路の軸索および末端における強力な逆行性および順行性感染媒介性GFP陽性と関連していた( 図4 )。したがって、強い網膜形成(RF)に局在するニューロンにおいて強いGFP陽性が見られ、、核ルーバー(NR)、および運動皮質(MC)( 図4B~ 4D )。同様に、透明なGFP免疫反応性は、脊髄小脳(SCT)、spinoreticular、及び脊髄視床路(STT)( 図4B- 図4D)の端子で見られました。

図1
図1 :成体マウスの脊髄小滴注射を行うための実験的セットアップ。A )成体マウスの脊髄小胞注射を行うために、2つの別々のXYZマニピュレータを使用する(IおよびII)。 ( B )各マニピュレータのZアームは、ガラスキャピラリーホルダを保持する。一方の毛細管ホルダーは、34Aの針貫通性針を保持し、他方の毛細管ホルダーは、鈍い36Gの小孔の注射針を保持する。 ( CDE 、およびF)穿刺直後の穿刺針の位置を示す画像( C ;硬膜は既に除去されている)、穿刺針( D )の除去後、胸部注射針の先端の挿入後( E )、および3mmの大腿注射針を大腿宇宙空間( F )に前進させた後。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図2
図2 :成人マウスにおける腰椎サブプライスAAV9-UBI-GFP送達後の強力な脊髄実質性GFP発現。A )AAV9-UBI-GFPの2回の両側性注射(それぞれ1.5または3μLの注射)を上部腰椎に送達したAAV9送達の14日後に動物を灌流固定した。 ( B )3 +3μLのAAV9(左および中央の柱)を注射した動物では、灰色(点状領域内)および白質(腰部から上胸部部分まで)に激しいGFP発現が認められる。 (C、D、E、およびF)、事実上すべてのチャット(α-運動ニューロンマーカー)で表示AAV9の3 + 3μLGFP発現を注射した動物において腰部拡大から採取した横断脊髄切片の同時染色陽性α-背側角( D )および中間領域( E )における運動ニューロン( CおよびF )およびNeuN陽性介在ニューロン。スケールバー=1,000μm(B)。 30μm(C)。 100μm(DF)。 DH:後角; LV:薄層V; VH:腹側ホーン。 もっと見るにはここをクリックしてくださいこの数字のrsion。

図3
図3: 成体マウスにおける脊髄下垂体頸部脊髄下垂体頸部および伏在腰椎AAV9-UBI-GFP送達後の脊髄GFP発現の比較。以前にAAV9-UBI-GFP(5 +5μL)の上頸部副鼻腔注射を受けた動物の脊髄の全長を切断した横断面( A、B、CおよびD )。頸部領域の白質および灰白質における激しいGFP発現が見られる( B )。腰部脊髄では、側副甲状腺(LF)およびNeuN陽性であるがGFP陰性ニューロン間の灰白質における高密度のGFP +下行性軸索を同定することができる( CおよびD )。 ( E、F、G、 H この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図4
図4 rong>:脳モータおよび感覚センタにおける強力な逆行性および前向きAAV9-UBI-GFP媒介性GFP発現。 ( A )頚部脊髄、髄腔口、小脳、および運動皮質(MC)における強いGFP陽性の存在を示す低出力画像。 ( B )矢状の脳切片から採取され、網状構造(RF)、核破裂(NR)および脊髄小脳路(SCT)の軸索におけるニューロンにおけるGFP蛍光の存在を示す高出力画像。 ( C )モーター皮質(MC)および網状視床核(STT)領域のスピノタラミック管の末端の錐体ニューロンにおけるGFP蛍光の存在を示す冠状脳切片から採取した低出力画像。 ( D )運動野のピラミッドニューロンにおける強いGFP発現を示す高出力画像。スケールバー=2000μm(A)。 1,000μm(BおよびC)。 60μm(D)。csource.jove.com/files/ftp_upload/55770/55770fig4large.jpg "target =" _ blank ">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

実験グループ AAV9送達のサイト/レベル(*) AAV9注射液の容量、注入速度 生存時間 組織分析
グループA(n = 7) C2(両側​​) 5μL/ 5分 14日間脳+脊髄
グループB(n = 12) L1-L2(両側) 1.5μLまたは3μL、60秒/μL 14日間脳+脊髄
グループC(n = 6) C2 + L1-L2(各レベルの両側) 5μL/ 5分 14日間脊髄
* - 両側=注入されたセグメントの右側の1つのサブ空間に送られる2つのサブピアル注入が実行される。

表1:実験群。すべての実験は、成体C57BL / 6Jマウスで行った。

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Discussion

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現在の研究では、成体マウスにおける腹側ベクター(AAV9)送達の技術が記載されている。付属のビデオで実証されているように、確立され、試験された仕様に従って、必要な器具および穿刺針および胸骨下注射針が適切に製造されるならば、この手法および技法を効果的に使用することができる。

マウスにおける一貫した安全な副作用注射を行う際の重要な技術変数:
示されているように、子宮頸部または腰椎椎弓切除術の後、成体麻酔したマウスにおいて、小児の注射を容易に行うことができる。サブパーティクル注入技術の成功を定義するいくつかの重要な技術的変数があります。第1に、34Gの通気針の先端は、通気孔の円滑な穿刺を保証するために、ベベルを用いて一貫して鋭利にする必要がある。針が鋭利にされる方法に関する技術の不一致は、痛みを穿刺するにはあまりにも多くの力を使用することによって痛みの浸透中に起こり、および/または脊髄損傷を引き起こす可能性がある。通常の状況下では(ビデオおよび図1CおよびDに示されるように)、開口部の部位は脊髄損傷または淡蒼球出血の徴候を示さない。場合によっては、いくつかの小赤血球出血が見られるが、これは、神経学的機能不全またはAAV9送達後の遺伝子発現の変化と関連していないことが見出された。第二に、電気焼灼器を用いて硬膜を除去した後に、手術部位に血液がない状態を保つことが重要である。たとえ外科用顕微鏡が使用されていても、斑点のある血液残留物は、ピア表面の確実な同定を不明瞭にする可能性がある。 1C〜Fに示すように、無髄椎弓切除部位は、椎弓切除した椎骨および周囲の軟組織を覆う小さなゲル発泡体片を使用して効果的に維持することができる。第3に、麻酔した動物を適切な場所に配置するために特に注意を払う必要があります。脊柱フレームを固定し、脊柱クランプを使用して脊柱を固定することに関する。脊柱クランプの配置中に多すぎる圧力を使用すると、椎骨が破裂する可能性があります。不十分な圧力を使用すると、固定された椎骨が漸進的に弛緩することがあり、典型的には椎弓切除を行うために歯科用ドリルが使用されると典型的に起こる。

副次的に注入されたAAV9の量は、吻側 - 尾側の導入遺伝子発現の大きさと相関する。このように、2つの腰部両側大胸腺AAV9注射(3 +3μLまたは5 +5μL)の使用は、腰部灰白質および白質全体の一貫したGFP発現と関連し、上部胸部セグメントまで及んだ。使用した動物間では最小限の変動しかなかった。 1.5±1.5μLのAAV9注入体積は、注射の近傍に局在化したセグメントにおいて同様のGFP発現をもたらした;しかし、ウイルスの拡散および結果として生じるGFP発現は、胸部セグメントにおいては限られていた(

小児遺伝子送達技術の限界:
脊髄の背側表面へのアクセスを可能にするために背側椎弓切除術が行われなければならない場合、(髄腔内送達と比較して)胸骨下注射技術の相対的限界の1つは、このアプローチのより侵襲性の性質である。しかし、脊髄および脊髄脊髄の脳の中心部で見られる有力な導入遺伝子発現は、α-運動ニューロンおよび一次求心性部分の亜集団における選択的なトランスジーン発現によって特徴付けられる髄腔内AAV送達よりも明らかな利点を示すようである(しかし、存在しないより深い脊髄層のニューロンで) 8

Subpiの将来のアプリケーションal Gene Delivery Technique:
同様に、成体ラットおよびブタにおける以前の研究で実証されているように、成体マウスの脊髄白質および灰白質において、亜麻薬AAV9送達を用いることによって、非常に効果的な導入遺伝子発現を達成することができる。さらに、マウス脊髄の比較的小さい寸法(特に長さ)のために、2つの脊髄レベル(上部頚部および上部腰椎)でのAAV9の送達は、ほぼ完全な脊髄感染を導くのに十分である。この特徴は、標的遺伝子サイレンシングまたはアップレギュレーションのいずれかによる特定の疾患修飾治療アプローチを設計する際に重要な示唆を有することができる。

例えば、shRNAサイレンシングベクターを使用することにより、変異遺伝子( 例えば、 ALSの遺伝的形態の場合にはSOD)の発現の非常に有効な減少が、脊髄全体ならびに脊髄で達成されることが期待される脳の運動核を投射する。二番、脊髄白質軸索の非常に有効な感染のために、治療遺伝子( 例えば、成長因子をコードする)をアップレギュレートして、脊髄外傷傷害動物における軸索発芽を促進することができる。第3に、皮下送達されたウイルスの体積または力価、ならびに皮下注射部位を操作することによって、導入遺伝子の発現を脊髄の別個の領域( 例えば、片側後角)に標的化することができる。局在化導入遺伝子発現は、阻害性神経伝達系( 例えば、 GABA)をアップレギュレーションするかまたは興奮性系( 例えば、グルタミン酸結合レセプター系)を阻害することによる疼痛または筋痙攣改変治療において潜在的に使用され得る。第4に、AAV送達に加えて、血液脳関門透過性が乏しい他の分子またはベクター( 例えば、マイクロRNA)は、送達した後、脊髄実質により効果的に送達されるようである。これらは効果的にテストすることができますこの原稿で説明されている技術。最後に、現在の研究で実証されているように、体重(BW)が20〜30gの成体マウスでは、このサブプライヤー技術を成功裏に使用することができます。したがって、同様のBW( 例えば、 Sprague-Dawley(SD)ラットの仔)を有する他の動物種において、同じ技術および実験装置を用いることができる可能性が高い。 P6およびP21 SDラットのBWはそれぞれ約17および62gである。産後発育の初期段階でラットの子犬を使用することは、脊髄神経回路および感覚および運動処理の発達における特定の遺伝子のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションの役割を研究するのに有用なツールとなり得る。

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Disclosures

Martin Marsalaは、Neurgain Technologies、Inc.(米国サンディエゴ)の共同設立者です。

Acknowledgments

この研究は、SANPORCおよびALSA財団の助成金(Martin Marsala)によって支持された。国家持続可能性プログラム、プロジェクト番号LO1609(チェコ文部省、青少年スポーツ)。 RVO:67985904(Stefan JuhasとJana Juhasova)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J Mice Jackson Labs 664
Lab Standard Stereotaxic for Mice Harvard Apparatus 72-9568
Mouse Spinal Adaptor Harvard Apparatus 72-4811
XYZ Manipulator Stoelting 51604
Manual Infusion Pump Stoelting 51218
34G Beveled Nanofill Needle World Precision Instruments NF34BV-2
36G Blunt Nanofill needle World Precision Instruments NF-36BL-2
Fluriso, Isoflurane MWI Veterinary Supply 502017
Chlorhexidine Solution MWI Veterinary Supply 501027
20G Stainless Steel Needle Becton-Dickinson 305175
23G Stainless Steel Needle Becton-Dickinson 305145
30G Stainless Steel Needle Becton-Dickinson 305128
Cotton Tipped Applicator MWI Veterinary Supply 27426
Glass Capillary Beveller  Narishige International SM-25B
Slide Microscope Superfrost Leica Microsystems M80
50 μL Microsyringe  Hamilton 81242
BD Intramedic PE-20 Tubing Becton, Dickinson 427406
BD Intramedic PE-10 Tubing Becton, Dickinson 427401
4-0 monofilament suture VetOne V1D397
Glass Capillary Beveller  Narishige Pipet Micro Grinder EG-40 
5 min Epoxy (Epoxy Clear) Devcon 14310
Euthanasia Solution MWI Veterinary Supply 11168
Heparin Inj 1,000 U/mL MWI Veterinary Supply 54254
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
Anti NeuN Antibody EMD-Millipore ABN78 Primary Rabbit Polyclonal Antibody, 1:1000
Anti-Choline Acetyltransferase (CHAT) Antibody EMD-Millipore AB144P Primary Goat Polyclonal Antibody, 1:100
Anti GFP Antibody Aves Labs GFP-1020 Primary Chicken Polyclonal Antibody, 1:1000
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 ThermoFisher Scientific A21207 Secondary Antibody, 1:1000
 Donkey anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 680 ThermoFisher Scientific A10043 Secondary Antibody, 1:1000
Donkey anti-Chicken IgY Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Jackson Immunoresearch Labs 703-545-155 Secondary Antibody, 1:1000
Donkey Anti-Goat IgG H&L (Alexa Fluor 647 Abcam ab150131 Secondary Antibody, 1:1000
Slide Microscope Superfrost Fisher Scientific 12-550-143
ProLong Gold Antifade Mountant Fisher Scientific P36930
Epifluorescence Microscope Zeiss Zeiss AxioImager M2
Fluorescence Confocal Microscope Olympus Olympus FV1000
Dextran Polysciences, Inc 19411
AAV9-UBC-GFP UCSD Viral Vector Core Laboratory

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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成体マウスにおける子宮頸部アデノ随伴ウイルス9(AAV9)ベクター送達
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Tadokoro, T., Miyanohara, A., Navarro, M., Kamizato, K., Juhas, S., Juhasova, J., Marsala, S., Platoshyn, O., Curtis, E., Gabel, B., Ciacci, J., Lukacova, N., Bimbova, K., Marsala, M. Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice. J. Vis. Exp. (125), e55770, doi:10.3791/55770 (2017).More

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