Summary
हम हिस्टोपैथोलॉजिकल मूल्यांकन के लिए, सफलतापूर्वक निकालने, प्रक्रिया, खंड और दाग के लिए एक विधि विकसित की है, मूल रूप से स्लाइड्स पर पूरे माउंट के रूप में निर्धारित किया गया स्तन ऊतक। यह विधि प्रजनन और विकासात्मक परीक्षण दिशानिर्देशों के अध्ययन में स्तन ग्रंथि की पूरी संख्या को संग्रह और मूल्यांकन को बढ़ावा दे सकती है।
Abstract
सामान्य स्तन ग्रंथि के विकास में पर्यावरणीय विषाक्त पदार्थों और दवा उत्पादों, हार्मोन के लिए अत्यधिक प्रदर्शन और आनुवांशिक परिवर्तन के संपर्क में परिवर्तन किया जा सकता है। स्तन ग्रंथि की संपूर्ण माउंट एक्सपोज़र के बाद उत्पन्न होने वाली रूपात्मक परिवर्तनों की प्रगति पर कब्जा करने के लिए एक सस्ती विधि है। हालांकि, बाद के जीवन में, जब असामान्यताएं विकसित करने के लिए अधिक प्रवण हैं, इस विधि पर एकमात्र निर्भरता हमेशा असामान्यता का उचित निदान करने के लिए पर्याप्त जानकारी प्रदान नहीं कर सकता है ऐतिहासिक रूप से, रासायनिक परीक्षण दिशानिर्देशों के अध्ययन में, एक स्तनमय ग्रंथि नेक्रोस्पॉसी में हटा दिया जाता है और एक हेमटॉक्सीसिलिन और ईसिन (एच एंड ई) -स्टेन्ड सेक्शन के रूप में तैयार किया जाता है। द्विपक्षीय स्तनधारियों के पूरे ढांचे का संग्रह और विश्लेषण एक गलत-नकारात्मक मूल्यांकन की संभावना कम करता है। संपूर्ण माउंट का मूल्यांकन एक स्लाइड पर एक या दो संपूर्ण स्तन ग्रंथियों की उपस्थिति से सीमित है, और कुछ मामलों में, पूरे माउंट में दिखाई जाने वाली असामान्यताएं नहीं हैंटी एच एंड ई अनुभाग में एक समान रूप से प्रतिनिधित्व किया। इस अध्ययन का लक्ष्य एचएंडई-स्टेड वर्गों के लिए कवरलिपि स्तनधारियों के पूरे माउंट को परिवर्तित करने के लिए एक प्रोटोकॉल का विकास करना था ताकि अन्यथा मिस हो जाने वाले घावों या निदान करने में मुश्किल हो सकें। यहां, हम एक स्तन ग्रंथि से उच्च-गुणवत्ता, पैराफिन-एम्बेडेड एचएंडई अनुभाग बनाने की एक विधि का विस्तार करते हैं, जिसे शुरू में पूरे माउंट के रूप में तैयार किया गया था। जानबूझकर एच एंड ई सेक्शनिंग के लिए तैयार ऊतक की तुलना में, पूरे माउंट को ऊतक हटाने और प्रसंस्करण के लिए अतिरिक्त तैयारी की आवश्यकता होती है। हालांकि, इस विधि को सस्ती माना जाता है, क्योंकि इसमें सामान्य प्रयोगशाला अभिकर्मकों की आवश्यकता होती है और थोड़ा अतिरिक्त समय होता है। नतीजतन, यह विधि अनमोल सूचना प्रदान करती है कि कैसे रासायनिक और पर्यावरण जोखिम सामान्य स्तन वृद्धि को बदलता है, साथ ही आनुवंशिक संशोधनों के कारण होने वाले परिवर्तन भी प्रदर्शित करता है।
Introduction
स्तनपायी पूरी तरह से कई चूहे और माउस अध्ययनों में कार्यान्वित एक उपयोगी और सस्ती तरीका है जो सामान्य और रासायनिक रूप से प्रेरित, असामान्य विकास दोनों को समझते हैं। सामान्यतः, कृंतक विकास ( यानी, किशोरावस्था, यौवन, देर से गर्भधारण और जुदाई चरण) के दौरान विभिन्न चरणों में एकत्रित एक स्तन ग्रंथि, पैरासीराइन, एंडोक्राइन और ऑटोक्रेइन कारकों से प्रभावित ऊतक और सेलुलर आर्किटेक्चर में रूपात्मक परिवर्तन दिखाएगा। 1 बुढ़ापे चूहे में, ग्रंथि के उपकला और stromal भागों तेजी से घने हो जाते हैं, जो पूरे माउंट में आकृति विज्ञान मापदंडों को मापने के लिए बनाता है। इस प्रकार, सूक्ष्म स्तर पर परिवर्तन की पहचान करने के लिए हिस्टोलॉजिकल मूल्यांकन के लिए एक ग्रंथि एकत्र करने के लिए सामान्य अभ्यास होता है। दोनों प्रक्रियाएं विशेष रूप से रासायनिक एक्सपोजर ( यानी पर्यावरण या फार्मास्यूटिकल) से संबंधित अध्ययनों में उपयोगी हैं या आनुवंशिक बदलाव के साथ आकृति परिवर्तनों की जांच करनाations।
जोखिम मूल्यांकन में स्तन ग्रंथि का उपयोग करने के लिए तकनीकों और क्षमताओं का विकास जारी है। पूरे माउंट की तैयारी नियमित और मानकीकृत है, जबकि सेक्शनिंग के संशोधन 2 , 3 जारी रहते हैं। विभिन्न पृष्ठभूमि ( यानी, शिक्षा, सरकार, और उद्योग) के कई शोध समूहों ने स्तनधारी ऊतकों के राज्याभिषेक / अनुदैर्ध्य अनुभागों को पसंदीदा विधि के रूप में रूपांतरित किया है, जबकि कुछ प्रयोगशाला अभी भी त्वचा 4 के माध्यम से क्रॉस-कट वाले वर्गों का उपयोग करते हैं। उत्तरार्द्ध विधि ब्याज के ऊतक की बजाय एपिडर्मिस (त्वचा) के एक असाधारण प्रतिनिधित्व में होता है: स्तन ग्रंथि उपकला 2 कोरोनल या अनुदैर्ध्य अनुभाग सामान्य ऊतक 5 को चित्रित करने के लिए अधिक उपयोगी होते हैं और बढ़ सतह क्षेत्र और उपस्थित संरचनाओं की संख्या के कारण असामान्यताएं और घावों का पता लगाने में काफी सुधार होता है। कुल मिलाकर, यह पूरे मो बनाता हैस्तन ग्रंथि 1 , 2 के तुलनात्मक हिस्टोपैथोलॉजिकल मूल्यांकन के लिए एक उपयुक्त विधि के रूप में चाहे माउस या चूहा, पुनर्प्राप्ति, और 4 वें और 5 वें इंन्गल ग्रंथियों के संरक्षण का प्रयोग पूरे माउंट की तुलना एक समवर्ती एच एंड ई सेक्शन के लिए किया जाता है।
जब संयोजन में उपयोग किया जाता है, तो एच एंड ई अनुभाग और पूरे माउंट पर्यावरण के जोखिम से प्रेरित सेलुलर और आकारिकी के सटीक खाते प्रदान करते हैं। यह विशेष रूप से कुछ कृंतक उपभेदों में सच है जिसमें मॉडल में ट्यूमर के गठन की कम संवेदनशीलता होती है या एक ट्यूमर मोटे तौर पर दिखाई नहीं देता है। कुछ परिस्थितियों में, आवश्यक टिशू प्राप्त करना दोनों तकनीकों ( यानी अपर्याप्त ऊतक मात्रा, संसाधन, या अप्रत्याशित प्रयोगात्मक परिणाम) का उपयोग करके हमेशा संभव नहीं हो सकता है। हमारे मामले में, मार्मिक पूरे माउंट में असामान्यताएं देखी गईं, जबकि हिस्टोपैथोद्विपक्षीय एच एंड ई ग्रंथि में तार्किक निष्कर्ष अधिकतर सामान्य थे। द्विगुणित ग्रंथियों के बीच भारी विसंगति ने हमें पूरे माउंट में असामान्यताओं की पहचान करने के लिए एक किफायती और कुशल प्रक्रिया विकसित की। संशोधित प्रसंस्करण और एम्बेडिंग प्रक्रिया का उपयोग करना, पैराफिन-एम्बेडेड संपूर्ण माउंट से उच्च-गुणवत्ता वाली एचएंडई-स्टेन्ड अनुभाग तैयार किए गए थे। हम इस प्रोटोकॉल को रासायनिक प्रदर्शन प्रभावों के लिए एक शक्तिशाली पहचान उपकरण बनने, इंटर-लैब तुलना को बढ़ाने के लिए कल्पना करते हैं।
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Protocol
इस अध्ययन के लिए सभी पशु उपयोग और प्रक्रियाएं एनआईईएचएस प्रयोगशाला पशु द्वारा अनुमोदित की गई थीं
देखभाल और उपयोग समिति और एसोसिएशन फॉर आकलन एंड प्रत्यायन ऑफ़ द
प्रयोगशाला पशु देखभाल-मान्यता प्राप्त सुविधा
1. स्तन-पूर्ण तैयारी 2 , 3 , 6 , 7
- गैर-गर्भवती CD-1 मादा माउस के एक तरफ से इनगेंनल स्तन ग्रंथियों को निकालें, जैसा कि संदर्भ 3 में वर्णित है, और उन्हें इलेक्ट्रोस्टैटिक रूप से चार्ज किए गए स्लाइड पर रखें।
- गैर-स्टिक पेपर या फिल्म के साथ ग्रंथि को कवर करें और शीर्ष पर एक और स्लाइड रखें। ग्रंथि को बाहर फैलाने के लिए स्लाइड में ( यानी, पानी के वजन) स्लाइड जोड़ें जिससे कि ग्रंथि फिक्स्डेशन के लिए स्लाइड पर चिपकाए।
- स्लाइड्स को लगानेवाला ( जैसे, 100% इथेनॉल, क्लोरोफॉर्म, और ग्लेशियल एसिटिक एसिड को 6: 3: 1 अनुपात में) में दबाएं।कमरे के तापमान पर रातोंरात
- लगानेवाला से ग्रंथियों को निकालें और 15-30 मिनट के लिए इथेनॉल में धो लें 30 मिनट के धोने के बाद, धीरे-धीरे पानी में बदलकर 1/3 इथेनॉल डालना और पानी जोड़ना धोने प्रत्येक समय के बारे में 5 मिनट के लिए बैठते हैं, और 3 बार पानी के अतिरिक्त के साथ दोहराएँ।
- 12-24 घंटे के लिए धब्बा ( जैसे, कारमिन अल्म समाधान)
नोट: मोटा ऊतकों को अब धुंधला बार की आवश्यकता होगी। धुंधला हो जाने वाले विवरण के लिए संदर्भ 3 देखें। - आवंटित समय के बाद दाग को बंद करें और पानी के स्लाइड्स को 30 एस के लिए कुल्ला दें। 15 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में स्लाइड धोकर ऊतकों को निर्जलीकरण, इसके बाद 95% इथेनॉल में 15 मिनट की धुलाई करें और 20 मिनट के लिए 100% इथेनॉल में अंतिम धो लें।
- ऊतकों से वसा को कम से कम 24 घंटे या उससे अधिक के लिए xylene में रखने से ऊष्मा को मोटा होना चाहिए, ताकि ऊतक मोटी हो, ताकि किसी भी अपारदर्शी या सफेद क्षेत्रों को निकाल दिया जाए।
- ऊतक को xylene से निकालें और जल्दी से मी जोड़ेंऊतक निर्जलीकरण से बचने के लिए स्लाइड के माध्यम से मध्यम देना; शीर्ष पर एक coverslip जगह कम से कम 48 घंटे के लिए स्लाइड सुखा दें।
- जैसा कि 2 में वर्णित है, असामान्यताओं के लिए पूरे माउंटेड ऊतक का मूल्यांकन करें
नोट: जब पूरे माउंट में घावों का पता लगाया जाता है और अपनी पहचान स्थापित करने के लिए सेक्शनिंग आवश्यक है, तो निम्न चरणों का पालन किया जाना चाहिए।
2. एक ग्लास स्लाइड से स्तन पूरे माउंट का हटाया जाना
- रातोंरात xylene से भरा एक गिलास धुंधला जार में स्तन पूरे माउंट स्लाइड submerging द्वारा coverslip और बढ़ते माध्यम निकालें
नोट: अत्यधिक बढ़ते समाधानों के साथ मोटा ऊतक और स्लाइड्स को coverslip हटाने के लिए अतिरिक्त समय की आवश्यकता हो सकती है। - शुरुआती रातोंरात सोख के बाद, स्लाइड्स को ताजे xylene में रखें और 6 घंटे के लिए सोखो। एक अंतिम अंतिम ताजा xylene में भिगोना रातोंरात।
नोट: पिछले सोख के बाद coverslip आसानी से स्लाइड गिर जाएगी। - एजी के साथहाथ से प्यार करते हैं, स्लाइड को पकड़ कर रखें और कंसलिप को संदंश की एक जोड़ी से सावधानीपूर्वक हटा दें ताकि सुनिश्चित हो सके कि यह एक टुकड़ा में हटा दिया गया है।
नोट: इस घटना में कि coverslip अभी भी कांच स्लाइड से जुड़ा हुआ है, जब तक इसे बहुत कम प्रयास से हटाया जा सकता है तब तक भिगोने जारी रखें। - कंडोलिप हटा दिए जाने के बाद, स्लाइड को लम्बवत रूप से एक गिलास पेटी डिब्बे में रखें, जिसमें एक्सलीन युक्त पदार्थ, एक तेज, डिस्पोजेबल रेजर ब्लेड ले जाएं और स्लाइड के नीचे एक ही गति में ब्लेड को स्लाइड करें।
- एक बार ऊतक हटा दिया जाता है, स्तन-पैड को एक xylene-filled ग्लास पेट्री डिश में जल्दी से डुबोकर सुनिश्चित करें कि ऊतक सूखी सूखी नहीं है।
नोट: इस कदम से सावधानी बरतें। पूरे माउंट पतले (≤ 1 मिमी) और एक्सलीन प्रोसेसिंग से कमजोर है। किसी भी इंप्रेशन या आँसू ऊतक के आकारिकी को बदल सकते हैं और बाद में मूल्यांकन कर सकते हैं।
3. ऊतक प्रसंस्करण
- एक बार ऊतक पेट्री डिश में है, ध्यान से इसे स्थानांतरित करेंलेबल वाले ऊतक विज्ञान कैसेट के लिए ऊतक क्षति को कम करने के लिए कुंद-नाक, दाँतेदार छिद्र संदंश के साथ वसा पैड के किनारे को पकड़ो।
- रेजर का इस्तेमाल करना, बड़े ऊतकों (विशेषकर चूहों के लिए) को छमाही में काटता है और उन्हें दो अलग-अलग लेबल वाले कैसेट में रखता है जो ऊतक के आकार को समायोजित करेंगे। ऊतक को दाईं ओर रखें (एक संदर्भ के रूप में लिम्फ नोड का उपयोग करें) यह सुनिश्चित करें कि लसीका नोड के बिना ऊतक को एक ही, ईमानदार स्थिति में रखा जाता है जब इसे कैसेट पर स्थानांतरित किया जाता है।
- केसेट को कंटेनर में 2 घंटे तक रखें, ऊतक प्रोसेसर में रखने से पहले।
नोट: नमूने को उसी दिन संसाधित करने के लिए अनुशंसित किया जाता है, जो उन्हें कैसेट में रखा जाता है। Xylene में विस्तारित भिगोने का परीक्षण नहीं किया गया है। - हाथ से ऊतक प्रोसेसर में अधिकतम कैसेट को लोड करें।
- शुरुआत से पहले, प्रोसेसर की अभिकर्मक सूची में इस प्रक्रिया के लिए उपयोग किए जाने वाले सभी अभिकर्मक कार्यक्रम। आंदोलन को स्वचालित करने के लिएएक स्टेशन से दूसरे तक, मेनू विकल्प का उपयोग करें और एक नया प्रोग्राम बनाएं। जब सभी चरण पूर्ण हो जाएं, तो आगे बढ़ने के लिए 'ठीक' चुनें।
नोट: प्रोसेसर शुरू होने से पहले सभी स्टेशन विवरणों की समीक्षा करने की अनुमति देगा- 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस के लिए xylene में कैसेट सोखने के लिए प्रोसेसर को स्वचालित बनाएं, उसके बाद एक ही स्थिति में ताजा xylene में एक दूसरे का सोख लें। Xylene समाधान से कैसेट को निकालने के लिए प्रोसेसर को स्वचालित बनाएं और ऊतकों को 1: 1 xylene युक्त अगले स्टेशन में स्थानांतरित करें: पिघला हुआ पैराफिन मिश्रण, 60 डिग्री सेल्सियस पर सेट, 30 मिनट के लिए।
नोट: प्रोसेसर तब केसेट को एक नए कक्ष में स्थानांतरित कर देगा जिसमें 1 घंटे के लिए पिघला हुआ पैराफिन शामिल है। 1 घंटे के बाद, नमूने स्वचालित रूप से ताजा पिघला हुआ पैराफिन के एक नए कक्ष में स्थानांतरित हो जाएंगे और एक अतिरिक्त 2 घंटे के लिए संसाधित किया जाएगा। दोनों चरणों 60 डिग्री सेल्सियस पर किए जाते हैं - प्रोसेसर फिर सेट को पिघला हुआ पैरा युक्त स्टेशन में स्थानांतरित करता है1 घंटे के लिए एफफ़िन फिर, नमूने स्वचालित रूप से ताजा पिघला हुआ पैराफिन के अंतिम स्टेशन में स्थानांतरित हो जाते हैं और एक अतिरिक्त 2 घंटे के लिए संसाधित होते हैं। दोनों चरणों 60 डिग्री सेल्सियस पर किए जाते हैं
- 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस के लिए xylene में कैसेट सोखने के लिए प्रोसेसर को स्वचालित बनाएं, उसके बाद एक ही स्थिति में ताजा xylene में एक दूसरे का सोख लें। Xylene समाधान से कैसेट को निकालने के लिए प्रोसेसर को स्वचालित बनाएं और ऊतकों को 1: 1 xylene युक्त अगले स्टेशन में स्थानांतरित करें: पिघला हुआ पैराफिन मिश्रण, 60 डिग्री सेल्सियस पर सेट, 30 मिनट के लिए।
4. संसाधित स्तन ऊतक को एम्बेड करना
- एम्बेडिंग स्टेशन की 58 डिग्री सेल्सियस पैराफिन होल्डिंग टैंक में कैसेट रखें जब तक कि ढालना में ऊतक को एम्बेड करने के लिए तैयार न हो।
- ऊतक के लिए सबसे अच्छा ढालना आकार निर्धारित करने के लिए कैसेट कवर निकालें सुनिश्चित करें कि मोटे ऊतक को समायोजित करने के लिए काफी बड़ा है, और परिधि के चारों ओर पैराफिन के ऊतक-मुक्त सीमा के लिए पर्याप्त कमरे छोड़ें।
- 3-4 मिमी पिघला हुआ पैराफिन को ढालना और स्तन पूरे माउंट सतह को ओरिएंट करें, जो ग्लास स्लाइड के नीचे और कासेट के निचले हिस्से के निकट था, जो मोल्ड में ऊपर का सामना करना पड़ रहा था।
- ढालना को ठंडा करने वाली प्लेट में ट्रांसफ़ॉर्म करें और जल्दी से ऊतक को समायोजित करें जिससे कि यह ढालना बी के समानांतर होottom।
नोट: एक बार पैराफिन कड़ी मेहनत के बाद, ऊतक को जगह में बाज़ी किया जाएगा। - गर्म संदंश का उपयोग करके, ढालना के शीर्ष पर कैसेट के निचले आधे लेबल पर रखें; मजबूती से संदंश का उपयोग कर प्रेस
- पूरे कैसेट को कवर करने के लिए एक सतत मोड़ में मोल्ड को अतिरिक्त पिघला हुआ पैराफिन जोड़ें। ब्लॉक की सख्त को पूरा करने के लिए गर्म थाली से मोल्ड को ठंडा प्लेट पर ले जाएं।
- मोल्ड से ब्लॉक निकालें जब पैराफिन पूरी तरह से दरारें या हवा के बुलबुले से बचने के लिए ठोस हो जाते हैं।
नोट: अनुभाग के लिए तैयार होने तक कमरे के तापमान पर पैराफिन-एम्बेडेड ऊतकों को स्टोर करें।
5. माइक्रोफ़ोम पर पैराफिन-एम्बेडेड स्तन ऊतक को विभाजित करना
- सेक्शनिंग से पहले, 1 घंटे के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर पैराफिन ब्लॉकों को सेते हैं।
नोट: ब्लॉक में अवशेष बढ़ते माध्यम मूल कवरलिपेड पूरे माउंट ऊतक से होगा। ब्लॉक चिलिंग ब्लॉक सेक्शनिंग और रिबनिंग को बेहतर बनाता है। - Mic तैयार करेंपानी के नहाने को चालू करके, ताजे आसुत जल युक्त, और तापमान 42-45 डिग्री सेल्सियस तक समायोजित करके घुमाएं। माइक्रोटॉम पर एक ताजा, कम प्रोफाइल ब्लेड रखें और इसे 4 सुक्ष्ममापी पर सेट करें।
नोट: ऊतक में अवशिष्ट बढ़ते माध्यम की उपस्थिति की वजह से धारा की गुणवत्ता 4 माइक्रोन से अधिक मोटा है। - ब्लेड का सामना करने वाले मोम के साथ सूक्ष्ममाणु में ब्लॉक डालें और ऊर्ध्वाधर विमान के साथ गठबंधन करें। फिर, ठंडे पानी में धुंध पैड के एक भाग को गीला करके इसे कई मिनट के लिए ब्लॉक पर रखें।
- बड़े चक्र को दक्षिणावर्त गति में मोड़ने से ब्लॉक, मोटे उन्नत पहिये के साथ संयोजन में, जब तक कि पूर्ण चेहरे या ब्लॉक का प्रतिनिधि खंड प्राप्त नहीं किया जाता है।
नोट: पूरे माउंट प्रक्रिया के दौरान xylene क्लियरिंग के कारण ऊतक पतली है। एक प्रतिनिधि अनुभाग प्राप्त करने में कटौती की संख्या को कम करने के लिए ब्लेड से ठीक से संरेखित करें। - रिबन उठाओहाथ से ऊपर अनुभाग, सावधानी से गर्म (45 डिग्री सेल्सियस) पानी के स्नान (अग्रिम में तैयार) में रिबन फ्लोट, ऊतक झुर्रियों को नष्ट करने और ध्यान से एक साफ ग्लास स्लाइड पर एक अनुभाग फ्लोट की अनुमति दें।
- अधिक पानी निकालने के लिए एक सुखाने रैक पर सीधे स्लाइड रखें। स्लाइड्स को 37 डिग्री सेल्सियस पर एक थोड़ा खोला स्लाइड बॉक्स में रातोंरात सेते हैं।
6. विभाजित स्तन ऊतकों की स्वचालित और मैनुअल एच एंड ई स्टैनिंग
- धुंधला होने से पहले, स्लाइड कमरे के तापमान पर संग्रहीत होती हैं
- स्वचालित धुंधला हो जाने के लिए, मुख्य मेनू पर दाग विकल्प से एच एंड ई का चयन करें। अपारफाइनीकरण, धुंधला हो जाना, और निर्जलीकरण सभी स्वचालित स्टेयर पर पूरा हो गया है। वर्गों को माउंट करने के लिए माउंटिंग माध्यम और कंसलिप का उपयोग करें।
- अगर स्लाइड्स मैन्युअल रूप से धुंधला हो, तो स्लाइड्स को 5 मिनट के लिए स्लाइड में डुबोकर वर्गों को डिपाराइज करें। ताजा xylene के लिए स्थानांतरण और 5 मिनट के लिए दोहराएँ
- वें डुबोते हुए स्लाइड्स को दोहराएं3 मिनट प्रत्येक के लिए 100% इथेनॉल में दो बार, इसके बाद ताजा 95% इथेनॉल में दो पुनरावृत्तियों और 5 मिनट प्रत्येक पर 1 एक्स वॉश बफर में दो अलग-अलग धुएं।
- आसुत जल में स्लाइड्स को कुल्ला।
- 1-2 मिनट के लिए स्लाइड्स हेमटैक्साइलिन में जोड़ें स्लाइड्स निकालें और उन्हें 5 मिनट के लिए नल का पानी चलाने के साथ कुल्ला।
नोट: प्रत्येक उपयोग के लिए पहले हीमटॉक्सिलीन फ़िल्टर करें। - रंग विभेदकों को बढ़ावा देने के लिए स्लाइडों को 1% हिमनदों के एसिटिक एसिड में रखें और 1 मिनट के लिए नल का पानी चलाने में कुल्ला करें।
- 1x पीबीएस को 30 से 1 मिनट के लिए ऊतक वर्गों के लिए नीले रंग में जोड़ें, नल के पानी में 5 मिनट की कुंडली के बाद और फिर 15-20 एस के लिए 95% शराब में।
- 30 एस से 1 मिनट के लिए ईोसिन समाधान के साथ काउंटरस्टेन इसके बाद, स्लाइड्स को ताजा 95% इथेनॉल में दो बार निर्जलीकरण करें, उसके बाद 100% इथेनॉल में दो ताज़ा दोहराव। 5 मिनट के लिए प्रत्येक धोने का प्रदर्शन करें
- Xylene में स्लाइड्स को साफ़ करें, प्रत्येक 5 मिनट के लिए xylene में दो परिवर्तन होते हैं।
- coverslipबढ़ते माध्यम के साथ ऊतक अनुभाग और कमरे के तापमान पर रात भर शुष्क।
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Representative Results
निदान के साथ सहायता करने में यह विधि प्रभावी है, जो कि अन्यथा मिस हो सकती है यदि स्तन पैड की मूल प्रतिधारात्मक एच एंड ई खंड में किसी भी हिस्टोलॉजिकल परिवर्तन नहीं दिखाए। हालांकि, परिणाम केवल उपयोगी होगा यदि प्रारंभिक पूर्ण-माउंट की तैयारी के दौरान देखभाल की जाती है, साथ ही ऊष्मीय मूल्यांकन के लिए ऊतक की तैयारी के दौरान। पैराफिन एम्बेडिंग सुरक्षा प्रदान करेगा और भविष्य के सेक्शनिंग के लिए ऊतक को संरक्षित करने में मदद करेगा।
स्तन ऊतक की आदर्श मोटाई निर्धारित करने के लिए, 4-माइक्रोन और 6-माइक्रोग्राम वर्ग तैयार किए गए थे। हमने गहराई का परीक्षण किया जो माइक्रोटम पर ± 1 माइक्रोन की त्रुटि के मार्जिन से अधिक थे। 6-μm मोटाई ( चित्रा 1 ए ) के खंड कॉम्पैक्ट कोशिकाओं के साथ बहुत घने थे। कुल मिलाकर, स्लाइड्स में विशिष्ट सेल्युलर विवरण नहीं थे जिनमें उचित पहचान बनाने के लिए आवश्यक होication। इष्टतम मोटाई 4 माइक्रोन ( चित्रा 1 बी ) थी। इन ऊतकों ने सर्वोत्तम परिणाम प्रदान किए, जहां उपकला और stromal क्षेत्रों और संबंधित सेल प्रकार आसानी से विशिष्ट थे।
इस पद्धति की आसानी और उपयोगिता को स्पष्ट करने के लिए एक बड़े, चल रहे अध्ययन से स्लाइड का उपयोग किया गया था। कई मामलों में, 14 महीने की कुंवारी महिला सीडी-1 संतानों से मूल एच एंड ई खंड में एक ही जानवर के समरूप माउंट पूरे माउंट की तुलना में विरोधाभासी निष्कर्ष पाया गया। पूरे माउंट में घावों को स्पष्ट किया गया था, लेकिन बिना किसी सेक्शनिंग और धुंधला हो जाने के बाद पहचाना नहीं जा सका। दो विभिन्न जानवरों के नमूने प्रतिनिधि मामलों के रूप में चुना गया। दोनों ही मामलों में, एक खंड को धुंधला हो जाने के लिए इस्तेमाल किया गया था, लेकिन एक प्रतिनिधि अनुभाग प्राप्त होने तक कई कटौती की गई थी। एक प्रतिनिधि अनुभाग प्राप्त करने के लिए बहुत कुछ कटौती आवश्यक थी, चूंकि पिछले पूरे माउंट तैयारी ने मो को मंजूरी दी थीवसा वाले पैड के सेंट, पैरामीन एम्बेडिंग के लिए तैयार एक स्तन ग्रंथि की तुलना में बहुत पतली ग्रंथि छोड़कर, जो एक मोटी चरबी पैड से घिरा हुआ है। चित्रा 2 ए और चित्रा 3 एक सामान्य रूप में मूल्यांकन किया गया था कि ग्रंथियों के ऊतक विज्ञान अनुभाग दिखाता है दोनों ग्रंथियों एक मजबूत और समरूप adipocyte समृद्ध आबादी से घिरे ductal संरचना दिखाते हैं। प्रत्येक वाहिनी सरल क्यूबाईडियल उपकला कोशिकाओं की एक परत द्वारा तैयार होती है और बेसल कोशिकाओं की एक दूसरी परत द्वारा बनाए रखा जाता है, मुख्यतः माय्योपेटिलियल कोशिकाओं से बना होता है, लेकिन इसमें स्टेम और प्रजनन सेल आबादी भी शामिल होती है। प्रतिनिधि प्रतिपक्षीय पूरे माउंट ( आंकड़े 2 बी और चित्रा 3 बी ) ने नलिकाओं का प्रदर्शन किया और वृद्धि हुई अस्पष्टता के साथ स्ट्रोमा का प्रदर्शन किया। हालांकि, यह निर्धारित करना मुश्किल था कि क्या अस्पष्टता हाइपरप्लास्टिक, भड़काऊ, या नवोप्लास्टिक परिवर्तन का परिणाम थाएक एच एंड ई अनुभाग होने पर यह विशिष्ट सेल्युलर विवरण प्रदान कर सकता है।
यहां वर्णित विधि को लागू करने के लिए एक ही जानवरों से उलटे पूरे माउंट का उपयोग किया गया था और इसे चित्रा 2 सी और डी और चित्रा 3 सी और डी में देखा जा सकता है। चित्रा 2 सी और डी के नमूने स्तन ग्रंथि खंड में बड़े रक्त वाहिका के आसपास मौजूद लिम्फोसाइटों की बढ़ी हुई संख्या के कारण परिधीय सूजन के रूप में निदान किया गया। दूसरे मामले के लिए, स्तन ग्रंथि लोबुलर वास्तुकला को बनाए रखा गया था, लेकिन सामान्य ऐल्वोओली और नलिकाएं (लोबोलोएल्व्होलर हाइपरप्लासिया) की बढ़ी संख्या और आकार द्वारा बहुमुखी रूप से विस्तारित किया गया था। वायुवीर उपकला कोशिकाओं को अच्छी तरह से विभेदित, गोल, अक्सर-रिक्त किया गया था, और एक लुमेन के आसपास एक गाढ़ा परत का गठन किया था, जिसमें आमतौर पर प्रोटीन वाले द्रव होते थे डुकस्तंभ स्तंभ कोशिकाओं द्वारा पंक्तिबद्ध होते थे और वायुकोशीय कोशिकाओं के समान थे, एक अच्छी तरह से विभेदित उपकला जिसमें एक गाढ़ा परत का गठन किया गया था। यह फेनोटाइप सबसे अधिक बार गर्भवती चूहों और चूहों के स्तन ग्रंथियों में देखा जाता है। वयस्क पुरुष 8 चूहों के स्तन ग्रंथियों में यह लोबोलोवलिवोलर संरचनाओं के साथ भ्रमित नहीं होना चाहिए वयस्क नर स्तन ग्रंथि में, एल्वियोली प्रमुख हैं और नलिकाएं कभी-कभार नहीं होती हैं, लेकिन एलवीओली और नलिकाएं स्तरीकृत उपकला द्वारा पंक्तिबद्ध होती हैं, साथ में, छोटे स्तंभों के उपकला कोशिकाओं के लिए लंबा, रिक्तिकृत घनघरणिक।
चित्रा 1 : माउस स्तन ग्रंथि के लिए अनुशंसित मोटाई एच एंड ई के वर्गों के लिए पूरे माउंट । ए) 6 माइक्रोन और बी) 4 माइक्रोन। स्तन ग्रंथि संरचनाओं के संकल्प मोटी (6 - & #) का उपयोग करके हिस्टोपैथोलॉजिकल मूल्यांकन के लिए अनुकूल नहीं थे।181; एम) सेक्शन, इसलिए 4-माइक्रोग्राम अनुभाग की सिफारिश की जाती है। यह आंकड़ा टकर एट अल से संशोधित किया गया है 9 इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 2 : परिधीय सूजन के एच एंड ई खंड के लिए पूरे माउंट। यह छवि एक माउस स्तन ग्रंथि है जिसे डायस्टर्स में एकत्र किया गया था। ए) फॉर्मिलीन-फिक्स्ड एच एंड ई स्तन ग्रंथि अनुभाग कोई हिस्टोपैथोगिकल परिवर्तन नहीं है। बी) वृद्धि हुई अस्पष्टता (बॉक्सिंग क्षेत्र) के क्षेत्रों के साथ, अनुभागीय पूरे माउंट अनुभाग। सी) एक स्तन पूरे माउंट (बॉक्सिंग क्षेत्र) से एक एच एंड ई अनुभाग की 20x बढ़ाई मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं के क्लस्टर्स रक्त वाहिनियों से घिरे हुए थे और आसपास के वसा ऊतकों में फैल गए थे। डी) गुएक स्तनमय पूरे माउंट (बॉक्सिंग क्षेत्र) से एच एंड ई अनुभाग में 40x बढ़ाई अधिक विस्तार से पता चलता है कि ज्यादातर मोनोन्यूक्लियर जनसंख्या लिम्फोसाइटों के होते हैं और परजीविकाय सूजन की गंभीरता को हाइलाइट करती है। यह आंकड़ा टकर एट अल से संशोधित किया गया है 9 इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 3 : लबुलर ऐल्वोलर हाइपरप्लासिया के एच एंड ई खंड के लिए पूरे माउंट । यह छवि एक माउस स्तन ग्रंथि है जिसे डायस्टर्स में एकत्र किया गया था। ए) फॉर्मिलीन-फिक्स्ड एच एंड ई स्तन ग्रंथि अनुभाग कोई हिस्टोपैथोलॉजिकल परिवर्तन नहीं है। बी) द्विशताब्दी और stromal क्षेत्रों में वृद्धि की अस्पष्टता के साथ द्विपक्षीय पूरे माउंट अनुभाग (बॉक्सिंग कर रहे हैंए)। सी) एक स्तन पूरे माउंट (बॉक्सिंग क्षेत्र) से एक एच एंड ई अनुभाग की 20x बढ़ाई लोबुलर वास्तुकला को बनाए रखा गया था, लेकिन सामान्य एल्वियोली और नलिकाएं (लोबोलोवलिवोलर हाइपरप्लासिया) की बढ़ी हुई संख्या और आकार द्वारा बहुमुखी रूप से विस्तारित किया गया था। डी) एक स्तन पूरे माउंट (बॉक्सिंग क्षेत्र) से एच एंड ई अनुभाग की 40x बढ़ाई से पता चलता है कि बढ़े हुए लोबियल्स में एलविओली और नलिकाओं की संख्या में बढ़ोतरी होती है जो अच्छी तरह से विभेदित, अक्सर-रिक्तिकृत उपकला कोशिकाओं से खड़ी होती हैं, जिसमें ल्यूमेंस होते हैं प्रोटीनसियस तरल पदार्थ यह आंकड़ा टकर एट अल से संशोधित किया गया है 9 इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
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Discussion
स्तन ग्रंथि पूरे माउंट एक शक्तिशाली उपकरण है जिसका उपयोग सामान्य स्तन विकास और रूपात्मक परिवर्तनों को स्पष्ट करने के लिए किया जा सकता है जो उत्पन्न हो सकता है और अंतःस्रावी विघटनकारी सहित रसायनों के लिए निम्नलिखित जोखिमों को जारी रखता है। जब एक ही जानवर से पूरे माउंट और एच एंड ई अनुभाग एक साथ मूल्यांकन किया जाता है, तो वे जल्दी परिवर्तन का एक सटीक दृश्य स्नैपशॉट प्रदान कर सकते हैं, जो एक अधिक बीमारी वाले राज्य में प्रगति कर सकते हैं।
इस उपयोगी जानकारी को प्राप्त करने की क्षमता यह सुनिश्चित करने में है कि ऊतक को हटाते समय ध्यान को संरक्षित करने और ग्रंथियों के आकारिकी का समझौता नहीं किया जाता है। जबकि कृंतक के कई स्तन ग्रंथि पृष्ठीय दीवार के साथ द्विपक्षीय रूप से स्थित हैं, तो मांसपेशी ऊतक वसूली को कम करने के लिए 4 वें और 5 वें ग्रंथियों को एकत्र करने की सिफारिश की जाती है। निप्पल अटैचमेंट क्षेत्र और लिम्फ नोड भी मौजूद होना चाहिए, क्योंकि वे उपयोगी रूपात्मक स्थलों के रूप में कार्य करते हैं। ग्रंथि को भी फैलाना और फैलाना चाहिएसीटू में ऊतक की प्राकृतिक संरचना की बारीकी से नकल करने के लिए एक सपाट सतह ( यानी एक ग्लास स्लाइड, कार्डस्टॉक या क्लॉथ) में छिद्रित । स्तन ग्रंथि में असामान्यताएं आम तौर पर दिखाई नहीं देती हैं जब तक कि ग्रंथि को एक्सलीन में ढंका नहीं किया जाता है या फिर तीर-दागदार हो गया है। स्तन ऊतक के विपरीत, जो मूल रूप से ऊष्मगत सेक्शनिंग के लिए तैयार था, पैराफिन एम्बेडिंग के लिए कांच से हटाए गए पूरे माउंट बहुत पतले और नाजुक होंगे। छापों और ऊतक के आँसू संक्रमित करने से बचा जाना चाहिए, क्योंकि वे सेलुलर आकारिकी को बदल देंगे और तैयार उत्पाद के हिस्टोपैथोलॉजिकल मूल्यांकन को कठिन बना देंगे।
एक बार पूरे माउंट पैराफिन-एम्बेडेड हो जाने पर, सेक्शनिंग से पहले, यह सिफारिश की जाती है कि ब्लॉकों को 1 घंटे के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर रहने दें। यह चरण रिबन में इष्टतम प्रतिनिधि ऊतक अनुभाग प्राप्त करने की क्षमता में सुधार करता है। 6 माइक्रोन ( चित्रा 1 ए ) 9 में ऊतक का भाग चित्रा 1 बी ) 9 का इस्तेमाल करते हुए, उपकला ऊतक और आस-पास के घुमक्कड़ क्षेत्रों सहित सभी सेलुलर सुविधाओं को आसानी से पहचाना जा सकता था। यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए, हालांकि ये वर्ग पहले से चमड़ी-दाग थे, दाग खंडन के बाद दिखाई नहीं दे रहा था और एच एंड ई धुंधला हो जाना में हस्तक्षेप नहीं किया। इसलिए, प्रोटोकॉल में एक डी-स्टैनिंग चरण आवश्यक नहीं था। हालांकि ऊतक वर्ग केवल एच एंड ई के साथ दाग रहे थे, एक बार सेक्शनिंग पूरा हो जाने पर हम मामूली संशोधन के साथ उम्मीद करते हैं, अन्य हिस्टोकेमिकल और संभवतः इम्यूनोहिस्टोकेमिकल दाग लागू हो सकते हैं। हालांकि, यह इस प्रोटोकॉल की सीमा से परे था और इन दागों के लिए अनुकूलतम स्थिति निर्धारित करने के लिए आगे की जांच की आवश्यकता होगी।
इस प्रक्रिया को विकसित किया गया था क्योंकि हमने नियमित रूप से एकत्र किए गए लोगों के बीच अनगिनत निष्कर्षों को देखा हैएक ही जानवर से ले माउंट और कॉन्ट्रैलिकल एच एंड ई-स्केड स्तन ग्रंथि अनुभाग। इसी प्रकार के स्तन प्रोटोकॉल मौजूद हैं 6 , 10 ; हालांकि, प्रक्रिया विस्तृत या पालन करने में आसान नहीं थी। उन विधियों ने हमारे प्रोटोकॉल के विकास के लिए एक आधार स्थापित किया था। सामान्य ग्रंथि आकारिकी एच एंड ई के दाग ऊतक वर्गों ( चित्रा 2 ए और चित्रा 3 ए ) 1 में देखा गया था , जबकि पूरक पूरे माउंट्स ने कई असामान्य आकारिकी विशेषताओं ( चित्रा 2 बी और चित्रा 3 बी ) 9 को बताया । संपूर्ण माउंट पर हिस्टोलोजी प्रदर्शन करके, हम असामान्य सुविधाओं को वर्गीकृत कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, दो अलग-अलग मामलों में परिधीय सूजन और लोबुलोवलिवोलर हाइपरप्लासिया की पहचान की गई थी, जो कि तुलनात्मक रूप से भिन्न थीई एच एंड ई निष्कर्ष contralateral पक्षों में देखा ( चित्रा 2 सी और डी और चित्रा 3 सी और डी ) 9
लेखकों के ज्ञान के लिए, स्तन कैंसर के बारे में कोई भी ज्ञात रिपोर्ट नहीं है, जो हमारे चल रहे अध्ययन में देखी गई हैं। हालांकि, यह घटना की कमी के बजाय प्रयोगात्मक डिजाइन मुद्दों के कारण हो सकता है, क्योंकि स्तन ग्रंथि अक्सर केवल एक आवेदन या विश्लेषण के लिए एकत्रित होती है जिसमें आरटी-पीसीआर या पश्चिमी ब्लोट जैसी आकारिकी शामिल नहीं होती है। हालांकि, कई प्रयोग कई अनुप्रयोगों को शामिल करते हैं जो प्रत्येक समापन बिंदु के लिए ऊतक की पर्याप्त मात्रा की आवश्यकता होती है। इनगेंनल ग्रंथियां पूरे माउंट और डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए पसंदीदा विकल्प हैं क्योंकि वे शायद ही कभी थोरैसिक ग्रंथियों ( यानी, मांसपेशियों के संदूषण) की तरह आसपास के ऊतकों को दूषित करते हैं और क्योंकि इनग्नल स्तन लिम्फ नोड्स मूल्य प्रदान करते हैंओरिएंटेशन के लिए सक्षम स्थलों और ग्रंथियों में तुलना इसलिए, यह तय करना है कि प्रत्येक आवेदन को किस ग्रंथि और कितनी ग्रंथि को समर्पित किया जाएगा, यह पता लगाने की सटीकता को प्रभावित करेगा। स्तन ग्रंथि के उपयोग के लिए प्राथमिकता निम्न के लिए होनी चाहिए: 1) पूरे 4 वें और 5 वें ग्रंथियों से बना एक पूरे माउंट, 2) एक मील का पत्थर के रूप में प्रयोग के लिए कुछ लसीका नोड युक्त contralateral 4 ग्रा ग्रंथि की ऊतक विज्ञान, और 3) डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों ( यानी, आरएनए, डीएनए, और प्रोटीन) के लिए contralateral 5 वें ग्रंथि (कोई दूषित लिम्फ नोड के बिना)। अगर नेक्रोस्पॉसी में एक असामान्यता दिखाई दे रही है, तो पूरे माउंट को हिस्टोलॉजी संग्रह के लिए प्राथमिकता लेनी चाहिए।
किसी भी प्रोटोकॉल के साथ, साथ में सीमाएँ हैं; सेक्शनिंग के दौरान पूरे माउंट को स्थायी रूप से नष्ट करने और वैकल्पिक विश्लेषण में उपयोग के लिए सीमित ऊतक को नष्ट करने की आवश्यकता है, उदाहरण के लिए इस प्रकार, हम अनुशंसित करते हैं कि डेस्कटॉप के साथ पूरे माउंट के बड़े पैमाने पर दस्तावेजीकरणभविष्य के विश्लेषण और संदर्भ के लिए डिजिटल छवियां तैयार करने के लिए। इसके अलावा, अगर एक महीने के भीतर धुंधला हो नहीं जाए, तो किसी भी भविष्य के विश्लेषण के लिए ऊतकों को संरक्षित करने के लिए कटौती करने वाले वर्गों की संख्या को सीमित करें। एच एंड ई अनुभाग विधि के लिए इस पूरे माउंट का लाभ सीमाओं से अधिक होता है, जैसे कि यह कई तरह के विषयों, विशेष रूप से विष विज्ञान से जुड़े स्तन अध्ययनों पर सार्वभौमिक रूप से लागू किया जा सकता है। ज्ञात अंतःस्रावी प्रभाव वाले रसायनों के उपयोग के कई अध्ययनों में इस प्रोटोकॉल का एक संशोधित संस्करण शामिल है, जो इसके प्रयोज्यता 11 , 12 , 13 का प्रदर्शन करता है। इन अध्ययनों से हुए निष्कर्ष रासायनिक परीक्षण में झूठी नकारात्मक संभावनाओं को कम करने में मदद कर सकते हैं, लेकिन नए या अतिरिक्त जानकारी भी प्रदान कर सकते हैं जिनका इस्तेमाल विनियामक और जोखिम-मूल्यांकन निर्णय के लिए किया जा सकता है।
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Disclosures
लेखकों के इस लेख के शोध, लेखक, और / या प्रकाशन के संबंध में घोषित करने के लिए कोई विरोधाभासी रुचियां नहीं हैं।
Acknowledgments
लेखकों को इस परियोजना के साथ अपनी तकनीकी विशेषज्ञता और सहायता के लिए पैम ओवविगो, टेनेट जोन्स, और नताशा क्लेटन, एनआईईएचएस को स्वीकार करना चाहूंगा।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Permount | Thermo Fisher Scientific | SP15-100 | mounting media for coverslipping whole mounts and H&E sections |
| Leica automated processor | Leica Biosystems | Model # ST5020 | |
| HM 355S Automatic Microtome | Thermo Fisher Scientific | 905200 | |
| Paraffin | Leica Biosystems | EM-400 | |
| Superfrost plus microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 4951PLUS-001 | electrostatically charged |
| Fisher Finest 24x60x1 | Thermo Fisher Scientific | 12-548-5P | coverslips |
| Varistain Gemini ES Automatic slide stainer | Thermo Fisher Scientific | A78000014 | |
| Sta-On | Leica Biosystems | 3803107 | liquid adhesive; used in water bath at sectioning |
| Modified Harris Hematoxylin 72711 | Richard-Allan Scientific (Part of Thermo Scientific) | 72711 | |
| Eosin | Leica Biosystems | 3801600 | |
| Lithium Carbonate | SkyTech Laboratories | LCQ500 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo Fisher Scientific | A38-500 | needed in Carnoy's fixative |
| Chloroform | Macron Fine Chemicals | 4440-04 | needed in Carnoy's fixative |
| 100% Ethanol | The Warner Graham Company | 6505001050000 | needed in Carnoy's fixative and washing slides |
| 95% Ethanol | The Warner Graham Company | 6505011137320190 | |
| Carmine Alum | Sigma-Aldrich | C1022-25G | |
| Aluminum potassium sulfate dodecahydrate, Sigma Ultra | Sigma-Aldrich | A7210-500G | |
| Automation wash buffer, 20X | Biocare Medical | TWB945 |
References
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