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Cancer Research

Sezione delle ghiandole mammarie per tutti gli attacchi per identificazione delle lesioni

doi: 10.3791/55796 Published: July 24, 2017

Summary

Abbiamo sviluppato un metodo per eliminare, elaborare, tagliare e colorare con successo, per la valutazione istopatologica, il tessuto mammario che era stato originariamente fissato su diapositive come supporti interi. Questo metodo può promuovere la raccolta e la valutazione dei supporti integrali delle ghiandole mammarie negli studi di orientamento test riproduttivo e di sviluppo.

Abstract

Lo sviluppo della ghiandola mammaria normale può essere alterato dall'esposizione a tossiche ambientali e ai prodotti farmaceutici, esposizione eccessiva agli ormoni e alterazioni genetiche. I supporti interiori della ghiandola mammaria sono un metodo poco costoso per catturare la progressione dei cambiamenti morfologici che possono sorgere dopo l'esposizione. Tuttavia, nella vita successiva, quando le anomalie sono più inclini a svilupparsi, la sola dipendenza da questo metodo può non fornire sempre informazioni sufficienti per fare una corretta diagnosi dell'anomalia. Storicamente, negli studi di orientamento chimico della prova, una singola ghiandola mammaria viene rimossa in necrosi e preparata come una sezione ematossilina e eosina (H & E). L'incorporazione della raccolta e dell'analisi contralaterale di mammiferi integrali diminuisce la probabilità di una valutazione falsa-negativa. La valutazione dell'intero supporto è limitata dalla presenza di una o due intere ghiandole mammarie su uno scivolo e in alcuni casi le anomalie osservate nell'intero supporto non sonoT uniformemente rappresentato nella sezione H & E. L'obiettivo di questo studio è stato quello di sviluppare un protocollo per la conversione di supporti interni di mammary coperti in H & E, in modo che le lesioni che altrimenti sarebbero state perdute o che sono difficili da diagnosticare possono essere identificate. Qui, abbiamo dettagliato un metodo per produrre una sezione H & E di alta qualità incorporata in paraffina da una ghiandola mammaria inizialmente preparata come supporto intero. In confronto ad un tessuto che è stato intenzionalmente preparato per la sezione H & E, l'intero supporto richiede ulteriori preparazioni per la rimozione e l'elaborazione dei tessuti. Tuttavia, questo metodo è considerato poco costoso, in quanto richiede comuni reagenti di laboratorio e poco tempo supplementare. Di conseguenza, questo metodo può fornire informazioni preziose su come le esposizioni chimiche e ambientali alterano il normale sviluppo mammario, oltre a visualizzare le modifiche che si verificano a causa di modifiche genetiche.

Introduction

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Il montascale mammario è un metodo utile e poco costoso, realizzato in molti studi su ratti e mouse, per comprendere sia lo sviluppo anomalo normale che chimico-indotto. In generale, una ghiandola mammaria raccolte a vari stadi durante lo sviluppo roditore (cioè, l'adolescenza, pubertà, metà a fine gestazione, e la fase di involuzione) mostrerà cambiamenti morfologici nel tessuto e architettura cellulare influenzato da paracrino, endocrini, e fattori autocrini 1 . Nel ratto di invecchiamento, le porzioni epiteliali e stromali della ghiandola diventano sempre più densi, rendendo difficili i parametri morfologici di misura in un intero monte. Quindi, è pratica comune raccogliere una ghiandola per la valutazione istologica per identificare i cambiamenti a livello microscopico. Entrambi i processi sono particolarmente utili in studi che implicano esposizione chimica ( cioè ambientale o farmaceutica) o per esaminare i cambiamenti morfologici accompagnati da alterazioni genetichezioni.

Le tecniche e le capacità di utilizzare la ghiandola mammaria nella valutazione del rischio continuano ad evolversi. Mentre la preparazione a tutto montaggio è routine e standardizzata, le modifiche alla sezione continuano 2 , 3 . Molti gruppi di ricerca di diversi ambiti (ad esempio, università, governo e industria) hanno adattato le sezioni coronali / longitudinali del tessuto mammario come un metodo preferito, mentre alcuni laboratori utilizzano ancora sezioni trasversali attraverso la pelle 4 . Quest'ultimo metodo produce un'incredibile rappresentazione dell'epidermide (pelle), anziché del tessuto di interesse: l'epitelio della ghiandola mammaria 2 . Le sezioni coronali o longitudinali sono più utili per caratterizzare il tessuto normale 5 e migliorare notevolmente la rilevazione di anomalie e lesioni dovute all'aumento della superficie e al numero di strutture presenti. Nel complesso, questo rende tutto il moUn metodo adeguato per la valutazione comparativa istopatologica della ghiandola mammaria 1 , 2 . Sia che si utilizzi un topo o un ratto, il recupero e conservazione del 4 ° e 5 ° ghiandole inguinali è altamente raccomandato per il confronto di tutta montare una sezione controlaterale H & E.

Se utilizzati in combinazione, la sezione H & E e l'intero supporto forniscono un accurato esame dei cambiamenti cellulari e morfologici indotti dall'esposizione ambientale. Ciò è particolarmente vero in alcuni ceppi di roditori in cui il modello possiede una bassa suscettibilità alla formazione del tumore o un tumore non è grossolanamente visibile. In alcune circostanze, l'ottenimento del tessuto richiesto può non essere sempre possibile utilizzando entrambe le tecniche ( ossia quantità insufficiente di tessuti, risorse o risultati sperimentali inaspettati). Nel nostro caso, anomalie sono state osservate nel montante intero mammario, mentre istopatoI risultati logici nella ghiandola H & E contralaterale erano per lo più normali. La divergenza enorme tra le ghiandole contralaterali ci ha portati a sviluppare una procedura economica ed efficiente per individuare le anomalie in tutti i montanti. Utilizzando una procedura di trasformazione e di incorporazione modificata, le sezioni trattate con H & E di alta qualità sono state preparate da supporti interamente incorporati in paraffina. Immaginiamo che questo protocollo diventi uno strumento di rilevazione potente per gli effetti di esposizione chimica, migliorando i confronti tra laboratori.

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Protocol

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Tutti gli usi animali e le procedure per questo studio sono state approvate dall'animale NIEHS Laboratory

Comitato per la cura e l'uso e condotto in un'associazione per la valutazione e l'accreditamento di

Impianto accreditato per la cura degli animali da laboratorio.

1. Mammary Preparazione a tutto sesto 2 , 3 , 6 , 7

  1. Rimuovere le ghiandole mammarie inguinali da un lato di un mouse femminile non pregnant CD-1, come descritto nel riferimento 3 , e posizionarle su uno scivolo elettrostaticamente caricato.
  2. Coprire la ghiandola con carta o pellicola antiaderente e inserire un'altra diapositiva in cima. Aggiungere la pressione ( cioè i pesi dell'acqua) alla diapositiva per spargere la ghiandola in modo che la ghiandola rimanga sullo scivolo per fissarla.
  3. Immergere le diapositive in fissativo ( es. 100% etanolo, cloroformio e acido acetico glaciale in rapporto 6: 3: 1)Pernottamento a temperatura ambiente.
  4. Rimuovere le ghiandole dal fissativo e lavare in etanolo per 15-30 min. Dopo il lavaggio di 30 minuti, passare gradualmente all'acqua versando 1/3 dell'etanolo e aggiungendo acqua. Lasciate che il lavaggio rimanga per circa 5 minuti ogni volta e ripeti con l'aggiunta dell'acqua 3 volte.
  5. Macchiare (per esempio, soluzione aluminica di carminio) per 12-24 h.
    NOTA: I tessuti più spesso richiedono tempi di colorazione più lunghi. Vedere il riferimento 3 per la colorazione dei dettagli.
  6. Versare la macchia dopo il tempo assegnato e sciacquare le diapositive in acqua per 30 s. Deidirli i tessuti lavando le vetrini in etanolo al 70% per 15 minuti, seguite da un lavaggio di 15 minuti in etanolo al 95% ed un lavaggio finale in etanolo al 100% per 20 minuti.
  7. Eliminare il grasso dai tessuti, collocandoli in xilene per un minimo di 24 ore, o più a lungo se il tessuto è spesso, in modo da rimuovere tutte le aree opache o bianche.
  8. Rimuovere il tessuto dal xilene e aggiungere rapidamente mMettere il medesimo al diapositiva per evitare la disidratazione dei tessuti; Posizionare un coperchio sulla parte superiore. Lasciare asciugare la diapositiva per almeno 48 ore.
  9. Valutare il tessuto interamente montato per le anomalie, come descritto in 2 .
    NOTA: quando le lesioni vengono rilevate in montagne intere e la sezione è necessaria per stabilire la loro identità, seguire le seguenti fasi.

2. Rimozione del Mammary Whole Mount da una diapositiva di vetro

  1. Rimuovere la copertura e il supporto di montaggio sommersando la scivolata del mammifero in un recipiente di vetro colorato pieno di xilene durante la notte.
    NOTA: I tessuti e le diapositive più alte con una soluzione di montaggio eccessiva possono richiedere tempi aggiuntivi per la rimozione del coperchio.
  2. Dopo il primo bagaglio di notte, posizionare le diapositive in xilene fresco e immergere per 6 ore. Effettuare un ultimo ammollo in xilene fresco durante la notte.
    NOTA: La copertura copre facilmente la diapositiva dopo l'ultima immersione.
  3. Con agAmate la mano, tenete la diapositiva e rimuovete accuratamente la coperta con una coppia di pinze per assicurarne la rimozione in un solo pezzo.
    NOTA: Nel caso in cui il coperchio sia ancora fissato al vetrino, continuare a immergerlo finché non si può rimuovere con poco sforzo.
  4. Una volta rimossa la copertura, tenere la diapositiva perpendicolarmente ad un piatto di vetro di Petri contenente xilene, prendete attentamente una lama di rasoio tagliente e usa e scorri la lama in un solo movimento verso il basso.
  5. Una volta che il tessuto viene rimosso, immettere rapidamente il tampone mammario in un piatto di vetro Petri pieno di xilene per assicurare che il tessuto non si asciughi.
    NOTA: Attenersi a questo passaggio. L'intero supporto è sottile (≤ 1 mm) e fragile dall'elaborazione di xilene. Ogni impressione o lacrime può cambiare la morfologia del tessuto e complicare le valutazioni successive.

3. Trattamento dei tessuti

  1. Una volta che il tessuto è nel piatto di Petri, trasferirlo con curaA una cassetta di istologia etichettata. Afferrare il bordo del tampone di grasso con punte a punta a punta liscia, per ridurre al minimo i danni ai tessuti.
    1. Usando un rasoio, tagliate a metà i tessuti più grandi (specialmente per i topi) e collocarli in due cassette etichettate separate che accolgono le dimensioni del tessuto. Posizionare il tessuto a destra con l'alto (utilizzare il linfonodo come riferimento). Assicurarsi che il tessuto senza il linfonodo sia mantenuto nella stessa posizione in posizione verticale quando viene trasferito nella cassetta.
  2. Posizionare la cassetta in un contenitore di xilene per un massimo di 2 ore prima di collocarlo nel processore del tessuto.
    NOTA: Si raccomanda di elaborare i campioni nello stesso giorno in cui vengono collocati nella cassetta. L'imbottitura estesa in xilene non è stata testata.
  3. Caricare il numero massimo di cassette nel processore del tessuto a mano.
  4. Prima di iniziare, programma tutti i reagenti che verranno utilizzati per questo processo nell'elenco dei reagenti del processore. Per automatizzare il movimentoDa una stazione all'altra, utilizzare le opzioni del menu e creare un nuovo programma. Una volta completati tutti i passaggi, selezionare 'OK' per procedere.
    NOTA: Il processore consentirà la revisione di tutti i dettagli della stazione prima di avviare.
    1. Automatizzare il processore per immergere le cassette in xilene per 30 minuti a 37 ° C, seguita da una seconda immersione in xilene fresco nelle stesse condizioni. Automatizzare il processore per rimuovere le cassette dalla soluzione xilene e trasferire i tessuti nella stazione successiva contenente una miscela di paraffina fusa di 1: 1, impostata a 60 ° C, per 30 min.
      NOTA: Il processore trasferirà le cassette in una nuova camera che contiene paraffina fusa per 1 ora. Dopo 1 ora i campioni saranno automaticamente trasferiti in una nuova camera di paraffina fusa fresca e saranno trattati per altri 2 h. Entrambe le fasi vengono eseguite a 60 ° C.
    2. Il processore poi trasferisce le cassette alla stazione contenente para paraFfin per 1 h. Quindi, i campioni vengono automaticamente trasferiti alla stazione finale di paraffina fusa fresca e trattati per altri 2 h. Entrambe le fasi vengono eseguite a 60 ° C.

4. Incorporare il tessuto mammario lavorato

  1. Posizionare le cassette nel serbatoio della paraffina 58 ° C della stazione di incorporazione fino a quando non sarà pronto per incorporare il tessuto nello stampo.
  2. Rimuovere il coperchio della cassetta per determinare la migliore dimensione dello stampo per il tessuto. Assicurarsi che lo stampo sia abbastanza grande per accogliere il tessuto e lasciare abbastanza spazio per avere un bordo di paraffina privo di tessuti attorno al perimetro.
  3. Aggiungere 3-4 mm di paraffina fusa allo stampo e orientare la superficie del mammifero interamente montata, che era adiacente al fondo della vetretta di vetro e al fondo della cassetta, rivolta verso l'alto nello stampo.
  4. Trasferire lo stampo su una piastra di raffreddamento e regolare rapidamente il tessuto secondo necessità in modo che sia parallelo allo stampo bottom.
    NOTA: Una volta che la paraffina si indurisce, il tessuto verrà bloccato in posizione.
  5. Usando le pinze calde, posizionare la metà inferiore della cassetta sulla parte superiore dello stampo; Premere saldamente con la pinza.
  6. Aggiungere una ulteriore paraffina fusa allo stampo in un movimento continuo per coprire l'intera cassetta. Spostare lo stampo dalla piastra calda a una piastra fredda per completare l'indurimento del blocco.
  7. Rimuovere il blocco dallo stampo quando la paraffina si solidifica completamente per evitare crepe o bolle d'aria.
    NOTA: Conservare i tessuti incorporati in paraffina a temperatura ambiente fino a quando non è pronto per la sezione.

5. Sezione del tessuto mammario incorporato in paraffina sul microtomo

  1. Prima della sezionatura, incubare i blocchi di paraffina a -20 ° C per 1 h.
    NOTA: Ci sarà un supporto di montaggio residuo nel blocco dal tessuto originale completo di copertina. Il raffreddamento del blocco migliora la sezione di blocco e il nastro.
  2. Preparare il microfonoGirare accendendo il bagno d'acqua, contenente acqua fresca distillata e regolare la temperatura a 42-45 ° C. Posizionare una lama fresca a basso profilo sul microtomo e impostarla a 4 μm.
    NOTA: La qualità della sezione viene ridotta con sezioni più spesse di 4 μm a causa della presenza di un supporto di montaggio residuo nel tessuto.
  3. Inserire il blocco nel microtomo con la cera rivolta verso la lama e allineare al piano verticale. Quindi, inumidire una sezione di rilievo in acqua fredda e metterlo sul blocco per alcuni minuti.
  4. Sezione il blocco ruotando la ruota grande in un movimento in senso orario, in combinazione con la ruota avanzata avanzata, fino a ottenere una faccia piena o una sezione rappresentativa del blocco.
    NOTA: Il tessuto è sottile a causa della radura di xilene durante il processo di montaggio. Allineare correttamente il blocco con la lama per ridurre al minimo il numero di tagli per ottenere una sezione rappresentativa.
  5. Scegli il nastroSpostare con attenzione il nastro nel bagno d'acqua caldo (45 ° C) preparato in anticipo, consentire alle rughe dei tessuti di dissipare e galleggiano con cura un tratto su una lastra di vetro pulita.
  6. Posizionare le diapositive verticalmente su un rack per asciugare per rimuovere l'acqua in eccesso. Incubare le diapositive in una scivoletta leggermente aperta per una notte a 37 ° C.

6. H & E automatizzata e manuale di colorazione dei tessuti mammari sezionati

  1. Prima della colorazione, le diapositive vengono conservate a temperatura ambiente.
  2. Per la colorazione automatica, selezionare H & E dalle opzioni di colorazione nel menu principale. La deparaffinazione, la colorazione e la disidratazione sono tutti completati sul macchinario automatizzato. Utilizzare un supporto di montaggio e una copertura per montare le sezioni.
  3. Se si colorano manualmente le diapositive, deparaffinare le sezioni immersando le diapositive in xilene per 5 min. Trasferire in xilene fresco e ripetere per 5 minuti.
  4. Riabilita le diapositive immersing thEm due volte in etanolo al 100% per 3 minuti ciascuno, seguiti da due ripetizioni in etanolo fresco al 95% e due lavaggi separati in tampone di lavaggio 1X a 5 minuti ciascuno.
  5. Sciacquare le diapositive in acqua distillata.
  6. Aggiungere le diapositive all'ematossilina per 1-2 minuti. Rimuovere le diapositive e sciacquarle con acqua corrente per 5 minuti.
    NOTA: filtrare l'ematoxilina prima di ogni utilizzo.
  7. Posizionare le diapositive nell'acido acetico glaciale del 1% per 30 secondi per favorire la differenziazione del colore e poi sciacquare nell'acqua di rubinetto corrente per 1 minuto.
  8. Aggiungere le diapositive a 1X PBS per 30 secondi fino a 1 min in blu le sezioni del tessuto, seguite da un risciacquo di 5 minuti in acqua di rubinetto e poi in alcool al 95% per 15-20 sec.
  9. Conteggio con soluzione eosina da 30 a 1 min. Successivamente, disidratare le diapositive due volte nell'etichetta fresca del 95%, seguita da due ripetizioni fresche in etanolo al 100%. Eseguire ogni lavaggio per 5 minuti.
  10. Cancella le diapositive in xilene, con due cambiamenti in xilene per 5 minuti ciascuno.
  11. CoverslipLa sezione tissutale con supporto di montaggio e asciugare piano a notte a temperatura ambiente.

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Representative Results

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Questo metodo è efficace nell'assistere le diagnosi che altrimenti potrebbero essere perse se l'originale sezione H & E del tampone mammario non ha mostrato alcun cambiamento istologico. Tuttavia, l'esito sarà utile solo se si prende cura durante la preparazione iniziale a tutto tondo, come pure durante la preparazione del tessuto per la valutazione istologica. L'incorporazione di paraffina fornirà protezione e contribuirà a preservare il tessuto per future sezioni.

Per determinare lo spessore ideale del tessuto mammario sono state preparate sezioni di 4 μm e 6 μm. Abbiamo provato profondità che erano superiori al margine di errore di ± 1 μm sul microtomo. Le sezioni di uno spessore di 6 μm ( Figura 1A ) erano molto dense con le celle compatte. Nel complesso, le diapositive non disponevano di particolari cellulari distinti che sarebbero necessari per fare una corretta identificazioneicazione. Lo spessore ottimale era di 4 μm ( figura 1B ). Questi tessuti hanno fornito i migliori risultati, dove le aree epiteliali e stromali e le tipologie di cellule corrispondenti sono facilmente distinguibili.

Le diapositive da un grande studio in corso sono state utilizzate per illustrare la facilità e l'utilità di questo metodo. In alcuni casi, la sezione H & E originaria della femmina virginale CD-1 di 14 mesi ha trovato riscontri conflittuali rispetto al supporto interattivo mammario contralaterale proveniente dallo stesso animale. Le lesioni erano evidenti in tutto il monte, ma non potevano essere identificate senza ulteriori sezioni e macchie. Esempi di due diversi animali sono stati scelti come casi rappresentativi. In entrambi i casi, una singola sezione è stata utilizzata per la colorazione, ma sono stati effettuati diversi tagli fino a ottenere una sezione rappresentativa. Pochissimi tagli sono stati necessari per ottenere una sezione rappresentativa, poiché i preparativi precedenti di tutto il montaggio sono stati eliminatiSt del grasso pad, lasciando la ghiandola molto sottile rispetto ad una ghiandola mammaria originariamente preparata per l'incorporazione di paraffina, che è circondata da un panno grasso spesso. La Figura 2 A e la Figura 3 A illustrano le sezioni istologiche delle ghiandole che sono state valutate come normali. Entrambe le ghiandole mostrano strutture ductali circondate da una robusta e omogenea popolazione ricca di adipociti. Ogni condotto è fiancheggiato da un unico strato di semplici cellule epiteliali cuboidali e viene mantenuto da un secondo strato di cellule basali, composto principalmente da cellule mioepiteliali, ma comprendendo anche le popolazioni di cellule staminali e di progenitori. I rappresentativi controlaterali supporti interi (Figure 2B e la Figura 3 B) hanno dimostrato condotti e stroma con maggiore opacità. Tuttavia, era difficile determinare se l'opacità fosse il risultato di alterazioni iperplastiche, infiammatorie o neoplastiche conUt avere una sezione H & E che potrebbe fornire dettagli cellulari distinti.

I montanti contralaterali interi dagli stessi animali sono stati usati per attuare il metodo descritto qui e può essere osservato in Figura 2 C e D e Figura 3 C e D. I campioni della Figura 2 C & D sono stati diagnosticati come infiammazione perivascolare dovuta all'aumento del numero di linfociti presenti attorno ad un vaso sanguigno grande nella sezione delle ghiandole mammarie. Per il secondo caso, l'architettura lobulare della ghiandola mammaria è stata mantenuta ma è stata allargata in modo multifocale con l'aumento del numero e delle dimensioni dei normali alveoli e dei condotti (iperplasia lobuloalveolare). Le cellule epiteliali alveolari erano ben differenziate, rotonde, spesso vacolizzate e formavano uno strato concentrico attorno ad un lumen che conteneva tipicamente fluido proteico. DucTs erano fiancheggiate da cellule colonne e erano simili alle cellule alveolari, con un epitelio ben differenziato che formava uno strato concentrico. Questo fenotipo è più spesso osservato nelle ghiandole mammarie dei topi e ratti mid-pregnant. Questo non dovrebbe essere confuso con le strutture lobuloalveolari nelle ghiandole mammarie dei ratti maschi adulti 8 . Nella ghiandola mammaria maschile adulta, gli alveoli sono prominenti e i condotti sono infrequenti, ma gli alveoli ei condotti sono fiancheggiati da epitelio stratificato, con cuboidi alti e vacuolati a celle corne epiteliali colonnari.

Figura 1
Figura 1 : Spessore consigliato per il montaggio intero delle ghiandole mammarie del mouse per le sezioni H & E. A) 6 μm e B) 4 μm. Le risoluzioni delle strutture delle ghiandole mammarie non erano ottimali per la valutazione istopatologica utilizzando il più spesso (6 -181; m), quindi si raccomanda la sezione 4 μm. Questa cifra è stata modificata da Tucker et al. 9 . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2 : Montaggio intero alla sezione H & E di infiammazione perivascolare. Questa immagine è una ghiandola mammaria del mouse che è stata raccolta nel diestro. A) La sezione del ghiandolare mammaria H & E fissa con formalin senza alterazioni istopatogene. B) Sezione contralaterale interamente montata, con aree di maggiore opacità (area boxed). C) Ingrandimento 20x di una sezione H & E da un montante intero mammario (area boxed). I cluster di cellule mononucleari circondavano il vaso sanguigno e si estendevano nel tessuto adiposo circostante. D) ThL'ingrandimento di 40x di una sezione H & E da un montante intero mammario (area boxed) mostra in maggiore dettaglio che la maggior parte della popolazione mononucleare è costituita da linfociti e evidenzia la gravità dell'infiammazione perivascolare. Questa cifra è stata modificata da Tucker et al. 9 . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3 : Montaggio intero alla sezione H & E di iperplasia lobulare alveolare . Questa immagine è una ghiandola mammaria del mouse che è stata raccolta nel diestro. A) Sezione di ghiandola mammaria H & E fissa con formalina senza alterazioni istopatologiche. B) Sezione contralaterale interamente montata con maggiore opacità nelle aree duttali e stromali (boxed sonoun). C) Ingrandimento 20x di una sezione H & E da un montante intero mammario (area boxed). L'architettura lobulare è stata mantenuta ma è stata allargata in modo multifocale dal numero e dimensioni aumentati di alveoli e condotti normali (iperplasia lobuloalveolare). D) L'ingrandimento di 40x di una sezione H & E da un montante integrale mammario (area boxed) rivela che i lobuli ingranditi contengono un maggior numero di alveoli e condotti che sono fiancheggiate da cellule epiteliali ben differenziate, spesso vacuolate, che formano lumen che contengono Fluido proteicoceo. Questa cifra è stata modificata da Tucker et al. 9 . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

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Il supporto integrale della ghiandola mammaria è un potente strumento che può essere utilizzato per illustrare lo sviluppo normale del mammifero e le alterazioni morfologiche che possono sorgere e persistono dopo l'esposizione a sostanze chimiche, inclusi i disgregatori endocrini. Quando un insieme completo e la sezione H & E dello stesso animale vengono valutati insieme, possono fornire un'istantanea precisa di alterazioni precoci, che possono avanzare in uno stato più malato.

La capacità di ottenere queste informazioni utili sta nel garantire che la cura sia presa per preservare e non compromettere la morfologia ghiandolare durante la rimozione del tessuto. Mentre il roditore ha diversi siti mammaria ghiandola situata bilateralmente lungo la parete dorsale, si raccomanda di raccogliere i 4 ° e 5 ° ghiandole per ridurre al minimo il recupero del tessuto muscolare. Anche l'area di attacco del capezzolo e il linfonodo dovrebbero essere presenti, in quanto servono da punti di riferimento morfologici utili. Anche la ghiandola deve essere diffusa e allungataImbrogliare su una superficie piana ( cioè una vetretta di vetro, un cardstock o un panno) per imitare in modo preciso la struttura naturale del tessuto in situ . Le anomalie all'interno della ghiandola mammaria non sono solitamente visibili solo dopo che la ghiandola è stata sgrassata in xilene o è stata macchiata a carmine. A differenza del tessuto mammario originariamente preparato per la sezione istologica, un intero supporto rimosso dal vetro per l'inserimento di paraffina sarà estremamente sottile e fragile. È necessario evitare le impressioni e le lacrime dei forcipe, in quanto potrebbero alterare la morfologia cellulare e rendere difficile le valutazioni istopatologiche del prodotto finito.

Una volta che l'intero supporto è stato incorporato in paraffina, prima della sezione, è consigliabile lasciare incubare i blocchi a -20 ° C per 1 ora. Questo passo migliora la capacità di ottenere una sezione ottimale del tessuto rappresentativo in un nastro. Sezione del tessuto a 6 μm ( Figura 1A ) 9 figura 1B ) 9 , tutte le caratteristiche cellulari, incluso il tessuto epiteliale e gli infiltrati stromali circostanti, sono stati facilmente identificati. Va anche notato che, anche se queste sezioni erano precedentemente colorate con carminio, la macchia non era visibile dopo la sezionamento e non interferiva con la colorazione H & E. Pertanto, nel protocollo non era necessaria una fase di de-colorazione. Anche se le sezioni dei tessuti sono state macchiate esclusivamente con H & E, ci aspettiamo con piccole modifiche, altre macchie istochemiche e eventualmente immunohistochemical potrebbero essere applicabili una volta che la sezionamento è completa. Tuttavia, è al di là della portata di questo protocollo e richiederà ulteriori indagini per determinare le condizioni ottimali per queste macchie.

Questa procedura è stata sviluppata perché abbiamo osservato scoperte discordanti tra chi raccolse regolarmenteLe montature e le sezioni contralaterali H & E della ghiandola mammaria macchiata dallo stesso animale. Analoghi protocolli mammari esistono 6 , 10 ; Tuttavia le procedure non erano dettagliate o facili da seguire. Questi metodi hanno stabilito una base per lo sviluppo del nostro protocollo. La morfologia della ghiandola normale è stata osservata nelle sezioni dei tessuti trattati con H & E ( Figura 2 A e Figura 3 A ) 1 , mentre i supporti interiori complementari hanno rivelato numerose caratteristiche morfologiche anomale ( Figura 2B e Figura 3B ) 9 . Realizzando istologia su tutti i montanti, potremmo classificare le caratteristiche anormali. Per esempio, l'infiammazione perivascolare e l'iperplasia lobuloalveolare sono stati identificati in due casi separati che erano disparati rispetto aRisultati H & E osservati nei lati contralaterali ( Figura 2 C e D e Figura 3 C e D ) 9 .

Alla conoscenza degli autori, non esistono rapporti noti di discrepanze di ghiandole mammarie simili a quelle osservate nel nostro studio in corso. Tuttavia, questo può essere dovuto a problemi di progettazione sperimentale piuttosto che alla mancanza di eventi, in quanto la ghiandola mammaria viene spesso raccolta solamente per un'applicazione o un'analisi che non comporta la morfologia, ad esempio RT-PCR o Western blots. Tuttavia, molti esperimenti incorporano più applicazioni che richiedono un'adeguata quantità di tessuto per ciascun punto finale. Le ghiandole inguinali sono la scelta preferita per i montanti interi e le applicazioni a valle perché raramente hanno contaminato i tessuti circostanti come le ghiandole toraciche ( cioè la contaminazione muscolare) e perché i linfonodi mammari inguinali forniscono ilPotenti punti di riferimento per l'orientamento e il confronto tra le ghiandole. Quindi, decidere quale ghiandola e quanto la ghiandola sarà dedicata ad ogni applicazione influenzerà la precisione del rilevamento. Priorità per l'utilizzo della ghiandola mammaria dovrebbe essere per: 1) un monte intero composto dell'intero 4 ° e 5 ° ghiandole, 2) istologia della controlaterale 4 ° ghiandola contenente del linfonodo per l'uso come un punto di riferimento, e 3) controlaterale 5 ° ghiandola (senza linfonodo contaminante) per applicazioni a valle (cioè, RNA, DNA e proteine). Se un'anomalia è visibile alla necropia, un intero monte deve assumere la preferenza per la raccolta di istologia.

Come per qualsiasi protocollo, ci sono limitazioni di accompagnamento; La necessità di distruggere definitivamente l'intero supporto durante la sezione e il tessuto limitato per l'uso in analisi alternative, ad esempio. Pertanto, si raccomanda di documentare in modo completo i supporti interi con un desktopCanner per produrre immagini digitali per future analisi e riferimenti. Inoltre, se la colorazione non avverrà entro un mese, limitare il numero di sezioni tagliate per preservare il tessuto per eventuali analisi future. I vantaggi di questo intero supporto per il metodo della sezione H & E superano i limiti, in modo che possa essere universalmente applicato agli studi su mammiferi che coinvolgono più discipline, in particolare la tossicologia. Diversi studi che utilizzano sostanze chimiche con effetti endocrini noti hanno incluso una versione modificata di questo protocollo, dimostrando la sua applicabilità 11 , 12 , 13 . I risultati di questi studi possono contribuire a ridurre le probabilità di un falso negativo nei test chimici, ma possono anche fornire nuove o informazioni aggiuntive che possono essere utilizzate per le decisioni di regolamentazione e di valutazione del rischio.

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Disclosures

Gli autori non hanno interessi conflittuali da dichiarare in relazione alla ricerca, alla pubblicazione e / o alla pubblicazione di questo articolo.

Acknowledgments

Gli autori vorrebbero riconoscere Pam Ovwigho, Tenette Jones e Natasha Clayton, NIEHS, per la loro esperienza tecnica e supporto con questo progetto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Xylene Sigma-Aldrich 214736
Permount Thermo Fisher Scientific SP15-100 mounting media for coverslipping whole mounts and H&E sections
Leica automated processor Leica Biosystems Model # ST5020
HM 355S Automatic Microtome Thermo Fisher Scientific  905200
Paraffin Leica Biosystems EM-400
Superfrost plus microscope slides Thermo Fisher Scientific 4951PLUS-001 electrostatically charged
Fisher Finest 24x60x1 Thermo Fisher Scientific 12-548-5P coverslips
Varistain Gemini ES Automatic slide stainer Thermo Fisher Scientific A78000014
Sta-On Leica Biosystems 3803107 liquid adhesive; used in water bath at sectioning
Modified Harris Hematoxylin 72711 Richard-Allan Scientific (Part of Thermo Scientific) 72711
Eosin Leica Biosystems 3801600
Lithium Carbonate SkyTech Laboratories LCQ500
Glacial Acetic Acid Thermo Fisher Scientific A38-500 needed in Carnoy's fixative
Chloroform Macron Fine Chemicals 4440-04 needed in Carnoy's fixative
100% Ethanol The Warner Graham Company 6505001050000 needed in Carnoy's fixative and washing slides
95% Ethanol The Warner Graham Company 6505011137320190
Carmine Alum Sigma-Aldrich C1022-25G
Aluminum potassium sulfate dodecahydrate, Sigma Ultra Sigma-Aldrich A7210-500G
Automation wash buffer, 20X Biocare Medical TWB945

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References

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Sezione delle ghiandole mammarie per tutti gli attacchi per identificazione delle lesioni
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Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification. J. Vis. Exp. (125), e55796, doi:10.3791/55796 (2017).More

Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification. J. Vis. Exp. (125), e55796, doi:10.3791/55796 (2017).

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