Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

Seksjon Mammary Gland Whole Mount for Lesion Identification

doi: 10.3791/55796 Published: July 24, 2017

Summary

Vi utviklet en metode for å fjerne, behandle, delte og flekke, for histopatologisk evaluering, brystvev som ble opprinnelig festet på lysbilder som hele fester. Denne metoden kan fremme innsamling og evaluering av brystkjertel hele fester i reproduktiv og utviklingstest retningslinjestudier.

Abstract

Normal brystkjertelutvikling kan endres ved eksponering for miljøgifter og farmasøytiske produkter, overdreven eksponering for hormoner og genetiske endringer. Mammekirtler hele fester er en billig metode for å fange utviklingen av morfologiske endringer som kan oppstå etter eksponering. Imidlertid, i senere liv, når unormaliteter er mer tilbøyelige til å utvikle, kan det bare være nok avhengig av denne metoden å gi nok informasjon for å gjøre en riktig diagnose av unormaliteten. Historisk sett, i kjemiske test retningslinjestudier, fjernes en enkelt brystkjertel ved nekropsy og prepareres som en hematoksylin og eosin (H & E) -farget seksjon. Inkorporeringen av kontralaterale brystsamlinger og -analyser reduserer sannsynligheten for en falsk-negativ vurdering. Evaluering av hele fjellet er begrenset av tilstedeværelsen av en eller to hele brystkirtler på et lysbilde, og i noen tilfeller er abnormaliteter observert i hele fjellet ikkeT er jevnt representert i H & E-delen. Målet med denne studien var å utvikle en protokoll for å omdanne dekkede brystfyllinger til H & E-fargede seksjoner slik at lesjoner som ellers ville vært savnet eller som er vanskelige å diagnostisere, kan identifiseres. Her beskriver vi en metode for å produsere en høyverdig, paraffin-innebygd H & E-seksjon fra en brystkjertel som opprinnelig ble tilberedt som en hel montering. I forhold til et vev som var forsettlig forberedt på H & E-seksjon, krever hele fjellet ytterligere forberedelse for fjerning og behandling av vev. Denne metoden anses imidlertid billig, da det krever vanlige laboratoriereagenser og lite ekstra tid. Som et resultat kan denne metoden gi uvurderlig informasjon om hvordan kjemiske og miljømessige eksponeringer endrer normal brystutvikling, samt viser endringer som oppstår på grunn av genetiske modifikasjoner.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Mammas hele fjellet er en nyttig og rimelig metode implementert i mange rott- og musestudier for å forstå både normal og kjemisk indusert, unormal utvikling. Generelt vil en brystkirtel samlet i ulike stadier under utvikling av gnagere ( dvs. ungdomsår, pubertet, mellom- til sen-svangerskap og invasjonsfasen), vise morfologiske forandringer i vev og cellulær arkitektur påvirket av parakrine, endokrine og autokrine faktorer 1 . I den aldrende rotte blir epithelial- og stromale delene av kjertelen stadig tettere, noe som gjør det vanskelig å måle morfologiske parametere i en hel montering. Således er det vanlig å samle en kjertel for histologisk evaluering for å identifisere endringer på et mikroskopisk nivå. Begge prosessene er spesielt nyttige i studier som involverer kjemisk eksponering ( dvs. miljø- eller farmasøytisk) eller å undersøke de morfologiske forandringene ledsaget av genetisk alterasjon.

Teknikker og evner for bruk av brystkjertelen i risikovurdering fortsetter å utvikle seg. Mens helmontert forberedelse er rutinemessig og standardisert, fortsetter modifikasjoner for snitting 2 , 3 . Mange forskergrupper fra ulike bakgrunner ( dvs. akademia, regjeringen og industrien) har tilpasset koronale / langsgående deler av brystvev som en foretrukket metode, mens enkelte laboratorier fortsatt bruker kryssnitt gjennom huden 4 . Sistnevnte metode resulterer i en overdreven representasjon av epidermis (hud), snarere enn det vev av interesse: brystkjertelepitelet 2 . Koronale eller langsgående seksjoner er mer nyttige for å karakterisere normalt vev 5 og sterkt forbedre påvisning av abnormiteter og lesjoner på grunn av det økte overflateareal og antall strukturer som er til stede. Samlet sett gjør dette hele mount en passende metode for sammenlignings histopatologisk vurderingen av melkekjertelen 1, 2. Uansett om du bruker en mus eller en rotte, henting og bevaring av den fjerde og femte tarmkirtlen, anbefales det sterkt å sammenligne hele fjellet til en kontralateral H & E-seksjon.

Når de brukes i kombinasjon, gir H & E-delen og hele monteringen en nøyaktig beskrivelse av de cellulære og morfologiske forandringene som er forårsaket av miljøpåvirkning. Dette gjelder spesielt i visse gnagestammer hvor modellen har lav mottakelighet for dannelse av svulster, eller en svulst er ikke grovt synlig. Under noen omstendigheter er det ikke alltid mulig å skaffe det nødvendige vevet ved hjelp av begge teknikkene ( dvs. utilstrekkelig vevsmengde, ressurser eller uventede eksperimentelle resultater). I vårt tilfelle ble abnormiteter observert i hele brystet, mens histopathoLogiske funn i kontralateralt H & E-kjertel var for det meste normale. Den overveldende uoverensstemmelsen mellom de kontralaterale kjertlene førte oss til å utvikle en økonomisk og effektiv prosedyre for å identifisere abnormaliteter i hele monteringen. Ved bruk av en modifisert prosesserings- og innlejringsprosedyre ble høykvalitets H & E-fargede seksjoner fremstilt fra paraffin-innebygde hele fester. Vi ser på at denne protokollen blir et kraftig gjenkjenningsverktøy for kjemiske eksponeringseffekter, og forbedrer interlab-sammenligninger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

All dyrebruk og prosedyrer for denne studien ble godkjent av NIEHS Laboratory Animal

Care and Use Committee og utført i en forening for vurdering og akkreditering av

Laboratory Animal Care-akkreditert anlegg.

1. Mammary Whole Mount forberedelse 2 , 3 , 6 , 7

  1. Fjern de inguinale brystkjertlene fra den ene siden av en ikke-gravid CD-1 kvinnelig mus, som beskrevet i referanse 3 , og plasser dem på et elektrostatisk ladet lysbilde.
  2. Dekk kjertelen med non-stick papir eller film og legg et annet lys på toppen. Legg trykk ( dvs. vannvekter) til lysbildet for å spre kjertelen ut flatt slik at kjertelen vil holde seg til glidelåsen for fiksering.
  3. Senk lysbildene i fikseringsmiddel ( f.eks. 100% etanol, kloroform og iseddik i et forhold på 6: 3: 1)Over natten ved romtemperatur.
  4. Fjern kjertlene fra fikseringsmiddelet og vask i etanol i 15-30 minutter. Etter 30 min vask, byttes gradvis til vann ved å hælde ut 1/3 av etanol og tilsett vann. La vasken sitte i ca 5 minutter hver gang, og gjenta med tilsetning av vann 3 ganger.
  5. Stain ( f.eks. Karmin alun løsning) i 12-24 timer.
    MERK: Tykkere vev vil kreve lengre fargetider. Se referanse 3 for farging detaljer.
  6. Hell platen etter den tildelte tiden og skyll lysbildene i vann i 30 s. Dehydrere vevet ved å vaske lysbildene i 70% etanol i 15 minutter, etterfulgt av å utføre en 15 minutters vask i 95% etanol og en sluttvask i 100% etanol i 20 minutter.
  7. Fjern fettet fra vevet ved å plassere dem i xylen i minst 24 timer, eller lenger hvis vevet er tykt, slik at eventuelle ugjennomsomme eller hvite områder fjernes.
  8. Fjern vevet fra xylenet og legg raskt til mUjevnt medium til lysbildet for å unngå vevsdehydrering; Sett et deksel på toppen. La lysbildet tørke i minst 48 timer.
  9. Evaluer det helfestede vevet for unormaliteter, som beskrevet i 2 .
    MERK: Når lesjoner oppdages i hele fester og snitt er nødvendig for å etablere sin identitet, bør følgende trinn følges.

2. Fjerning av Mammary Whole Mount fra en Glass Slide

  1. Fjern dekselglasset og monteringsmediet ved å nedsenke brystglasset med helmontering i en glassfargebeholder fylt med xylen over natten.
    MERK: Tykkere vev og lysbilder med overdreven monteringsløsning kan kreve ekstra tid for fjerning av deksel.
  2. Etter den første natten over, legg lysbildene i frisk xylen og bløt i 6 timer. Utfør en siste suge i frisk xylen over natten.
    MERK: Dekselet faller lett av lysbildet etter siste bløt.
  3. Med agElsket hånd, hold lysbildet og fjern forsiktig dekselet med et par tang for å sikre at den fjernes i ett stykke.
    MERK: Hvis dekselet fortsatt er festet til glassglasset, fortsett å suge til det kan fjernes med liten innsats.
  4. Når dekselet er fjernet, hold lysbildet vinkelrett på en glassfett som inneholder xylen, ta forsiktig et skarpt, engangs barberblad og skyv bladet i en enkelt bevegelse nedover lysbildet.
  5. Når vevet er fjernet, nedsenk raskt brystpapiret i en xylenfylt glass petriskål for å sikre at vevet ikke lufttørker.
    MERK: Vær forsiktig med dette trinnet. Hele fjellet er tynt (≤ 1 mm) og skjør fra xylenbehandling. Eventuelle inntrykk eller tårer kan forandre vevets morfologi og komplisere senere evalueringer.

3. Vevbehandling

  1. Når vevet er i Petriskålen, overfør den forsiktigTil en merket histologi-kassett. Ta tak i kanten av fettputen med stumpete, serrated-tipped tang for å minimere vevskader.
    1. Ved hjelp av en barberhøvel, kutte større vev (spesielt for rotter) i halve og plasser dem i to separate merkede kassetter som vil imøtekomme vevstørrelsen. Plasser vevet rett opp (bruk lymfeknude som referanse). Sørg for at vevet uten lymfeknude holdes i samme oppreist posisjon når den overføres til kassetten.
  2. Legg kassetten i en beholder med xylen i opptil 2 timer før du plasserer den i vevprosessoren.
    MERK: Det anbefales å behandle prøvene samme dag de plasseres i kassetten. Utvidet soaking i xylen har ikke blitt testet.
  3. Legg maksimalt antall kassetter i vevprosessoren for hånd.
  4. Før begynnelsen, programmer alle reagensene som skal brukes til denne prosessen, inn i prosessorens reagensliste. Å automatisere bevegelseFra en stasjon til den neste, bruk menyalternativene og opprett et nytt program. Når alle trinnene er fullført, velg 'OK' for å fortsette.
    MERK: Prosessoren vil tillate gjennomgang av alle stasjonsdetaljer før du starter.
    1. Automatiser prosessoren til å suge kassettene i xylen i 30 minutter ved 37 ° C, etterfulgt av en annen suge i frisk xylen under de samme forhold. Automatiser prosessoren for å fjerne kassettene fra xylenløsningen og overfør vevet til neste stasjon som inneholder en 1: 1 xylen: smeltet paraffinblanding satt til 60 ° C i 30 minutter.
      MERK: Prosessoren overfører deretter kassettene til et nytt kammer som inneholder smeltet paraffin i 1 time. Etter 1 time vil prøvene automatisk overføres til et nytt kammer av fersk smeltet paraffin og vil bli behandlet i ytterligere 2 timer. Begge trinnene utføres ved 60 ° C.
    2. Prosessoren overfører deretter kassettene til stasjonen som inneholder smeltet paraFf i 1 time. Deretter overføres prøvene automatisk til sluttstasjonen av fersk smeltet paraffin og behandles i ytterligere 2 timer. Begge trinnene utføres ved 60 ° C.

4. Embedding av behandlet mammavev

  1. Plasser kassettene i 58 ° C-paraffinholdingstanken på innleggingsstasjonen til den er klar til å legge inn vevet i formen.
  2. Fjern kassettdekselet for å bestemme den beste formstørrelsen for vevet. Pass på at formen er stor nok til å imøtekomme vevet, og la nok plass til å ha en vevfri kantlinje av paraffin rundt omkretsen.
  3. Tilsett 3-4 mm smeltet parafin til formen og orienter hele brønnen på brystet, som var tilstøtende til bunnen av glassruten og bunnen av kassetten, vendt opp i formen.
  4. Overfør støpeformen til en kjøleplate og raskt juster vevet etter behov, slik at det er parallelt med formen bottom.
    MERK: Når paraffinet er hardt, vil vevet sikres på plass.
  5. Ved å bruke varme tang, legg den merkede, nederste halvdelen av kassetten på toppen av formen; Trykk fast med tangene.
  6. Tilsett ekstra smeltet paraffin til formen i kontinuerlig bevegelse for å dekke hele kassetten. Flytt støpeformen fra den varme platen til en kaldplate for å fullføre herdingen av blokken.
  7. Fjern blokken fra formen når paraffinen fullstendig stivner for å unngå sprekker eller luftbobler.
    MERK: Oppbevar det parafin-innebygde vevet ved romtemperatur til klar til seksjon.

5. Seksjon av den paraffin-innebygde mammavev på mikrotomen

  1. Før snitting inkuberer parafinblokkene ved -20 ° C i 1 time.
    MERK: Det vil være gjenværende monteringsmedium i blokken fra det opprinnelige dekslet fullstendige vevet. Kjøling av blokken forbedrer blokkavsnitt og båndbredde.
  2. Klargjør mikrofonenRotom ved å skru på vannbadet, som inneholder fersk destillert vann, og juster temperaturen til 42-45 ° C. Legg et friskt, lavprofilblad på mikrotomen og sett det på 4 μm.
    MERK: Seksjonskvaliteten reduseres med seksjoner tykkere enn 4 μm på grunn av tilstedeværelse av gjenværende monteringsmedium i vevet.
  3. Sett blokken inn i mikrotomenet med voks som vender mot bladet og justert med vertikalplanet. Deretter fuktes en del av gasbindestoff i kaldt vann og legger det på blokken i flere minutter.
  4. Del blokken ved å dreie det store hjulet med klokken, i kombinasjon med det grove avanserte hjulet, til et fullstendig ansikt eller en representativ del av blokken er oppnådd.
    MERK: Vevet er tynt på grunn av xylenfjerning under hele monteringsprosessen. Juster blokken riktig med bladet for å minimere antall kutt i å få en representativ seksjon.
  5. Velg båndetDel opp med hånden, forsiktig bøy båndet i det varme (45 ° C) vannbadet (forberedt på forhånd), la vevskrynkene løsne og forsiktig flyte en del på en ren glassglass.
  6. Plasser lysbildene oppreist på et tørkehylle for å fjerne overflødig vann. Inkubér lysbildene i en litt åpnet lysboksen over natten ved 37 ° C.

6. Automatisert og manuell H & E-farging av delte mammavev

  1. Før farging lagres lysbildene ved romtemperatur.
  2. For automatisert farging, velg H & E fra flekkalternativene i hovedmenyen. Deparaffinisering, farging og dehydrering er fullført på den automatiserte fargen. Bruk monteringsmedium og en deksel for montering av seksjonene.
  3. Hvis manuell farging av lysbildene, deparaffiniserer seksjonene ved å nedsenke lysbildene i xylen i 5 minutter. Overfør til frisk xylen og gjenta i 5 min.
  4. Rehydrer lysbildene ved å nedsenke denEm to ganger i 100% etanol i 3 minutter hver, etterfulgt av to repetisjoner i frisk 95% etanol og to separate vasker i 1X vaskebuffer ved 5 minutter hver.
  5. Skyll lysbildene i destillert vann.
  6. Legg lysbildene til hematoksylinet i 1-2 minutter. Ta av lysbildene og skyll dem med rennende vann i 5 minutter.
    MERK: Filtrer hematoksylin før hver bruk.
  7. Plasser lysbildene i 1% iseddik i 30 s for å fremme fargedifferensiering, og skyll deretter i rennende vann i 1 minutt.
  8. Legg lysbilder til 1X PBS i 30 s til 1 min til blå vevseksjonene, etterfulgt av en 5 min skylling i vann fra springen og deretter i 95% alkohol i 15-20 s.
  9. Motstå med eosinoppløsning i 30 s til 1 min. Etter dette dehydrerer lysbildene to ganger i fersk 95% etanol, etterfulgt av to friske repetisjoner i 100% etanol. Utfør hver vask i 5 minutter.
  10. Fjern lysbildene i xylen, med to endringer i xylen i 5 minutter hver.
  11. dekkVevsdelen med monteringsmedium og tørr flat over natten ved romtemperatur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denne metoden er effektiv til å bistå med diagnoser som ellers kan ha blitt savnet hvis den opprinnelige kontralaterale H & E-delen av brystvorten ikke viste noen histologiske endringer. Utfallet vil imidlertid kun være nyttig dersom det tas hensyn til det første preparatet, samt under forberedelsen av vevet til den histologiske evalueringen. Paraffinbøyning gir beskyttelse og vil bidra til å bevare vevet for fremtidig seksjonering.

For å bestemme den ideelle tykkelsen av brystvevet ble 4 μm og 6 μm seksjoner fremstilt. Vi testet dybder som var større enn feilmarginen på ± 1 μm på mikrotomenet. Seksjoner med en tykkelse på 6 μm ( Figur 1A ) var svært tette med kompakte celler. Samlet sett manglede lysbildene forskjellige mobildata som ville være nødvendige for å skape en riktig identifiseringication. Den optimale tykkelsen var 4 μm ( figur 1B ). Disse vevene ga de beste resultatene, hvor epitel- og stromalområder og tilsvarende celletyper lett ble skilt.

Lysbilder fra en stor, pågående studie ble brukt til å illustrere enkelheten og nytte av denne metoden. I flere tilfeller ble den opprinnelige H & E-delen fra 14 måneder gamle jomfru CD-1-avkom funnet å ha motstridende funn sammenlignet med den kontralaterale brysthulen fra samme dyr. Lesjoner var tydelige i hele fjellet, men kunne ikke identifiseres uten ytterligere snitt og farging. Prøver fra to forskjellige dyr ble valgt som representative tilfeller. I begge tilfeller ble en enkelt seksjon brukt for farging, men flere kutt ble gjort til en representativ seksjon ble oppnådd. Svært få kutt var nødvendig for å oppnå en representativ seksjon, siden tidligere preparater for helmontering ble fjernetSt av fettputen, slik at kjertelen blir veldig tynn sammenlignet med en brystkjertel som opprinnelig var forberedt på innblanding av paraffin, som er omgitt av en tykk fettpute. Figur 2 A og Figur 3 A illustrerer histologiske deler av kjertlene som ble vurdert som normalt. Begge kjertlene viser duktale strukturer omgitt av en robust og homogen adipocytrik befolkning. Hver kanal er foret med et enkelt lag med enkle kuoidale epitelceller og opprettholdes av et andre lag av basalceller, hovedsakelig sammensatt av myopiteliale celler, men omfatter også stamme- og stamcellepopulasjoner. De representative kontralaterale helfestene ( figur 2B og figur 3B ) demonstrerte kanaler og stroma med økt opasitet. Det var imidlertid vanskelig å avgjøre om opaqueness var resultatet av hyperplastiske, inflammatoriske eller neoplastiske endringer medUt har en H & E-seksjon som kan gi tydelige cellulære detaljer.

Kontralaterale hele fester fra de samme dyrene ble brukt til å implementere fremgangsmåten beskrevet her og kan observeres i figur 2 C og D og figur 3 C og D. Prøven i figur 2 C & D ble diagnostisert som perivaskulær betennelse på grunn av det økte antall lymfocytter som var tilstede rundt et stort blodkar i brystkjertelen. For det andre tilfellet ble brystkirtlen lobulær arkitektur opprettholdt, men ble forstørret multifokalt av det økte antallet og størrelsen på normale alveoler og kanaler (lobuloalveolar hyperplasi). Alveolære epitelceller ble godt differensiert, runde, ofte vakuolerte og dannet et konsentrert lag rundt et lumen som typisk inneholdt proteinholdig væske. DucTs ble foret av kolonne celler og lignet alveolære celler, med et godt differensiert epitel som dannet ett konsentrert lag. Denne fenotypen observeres oftest i brystkirtler av mid-gravide mus og rotter. Dette bør ikke forveksles med lobuloalveolære strukturer i brystkjertlene hos voksne hannrotter 8 . I den voksne mannlige brystkjertelen er alveoler fremtredende, og kanaler er sjeldne, men alveolene og kanalene er foret med stratifisert epitel, med høye, vakuolerte kuleformede til korte, koloniale epitelceller.

Figur 1
Figur 1 : Anbefalt tykkelse for muskirtler hele feste til H & E seksjoner . A) 6 μm og B) 4 μm. Oppløsningene av brystkirtelstrukturer var ikke optimale for histopatologisk evaluering ved bruk av tykkere (6 - & #181; m) seksjoner, så 4-μm seksjonen anbefales. Denne figuren er blitt modifisert fra Tucker et al. 9 . Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2
Figur 2 : Hele montering til H & E-delen av perivaskulær betennelse. Dette bildet er en musekirtel som ble samlet inn i diestrus. A) Formalin-fast H & E-kjertelkjertel-seksjon uten histopatogiske endringer. B) Kontralateral helmontering, med områder med økt ugjennomtrengelighet (boksområde). C) 20x forstørrelse av en H & E-seksjon fra en brysthelefeste (boksområde). Klynger av mononukleære celler omgikk blodkaret og utvidet til det omkringliggende fettvev. D) ThE 40x forstørrelse av en H & E seksjon fra en brysthelefeste (boksområde) viser mer detaljert at størstedelen av den mononukleære befolkningen består av lymfocytter og fremhever alvorlighetsgraden av perivaskulær betennelse. Denne figuren er blitt modifisert fra Tucker et al. 9 . Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3
Figur 3 : Hele montasje til H & E-delen av lobular alveolær hyperplasi . Dette bildet er en musekirtel som ble samlet inn i diestrus. A) Formalin-fast H & E-kjertelkjertel-seksjon uten histopatologiske endringer. B) Kontralateral helmonteringsseksjon med økt opasitet i duktale og stromale områder (esker eren). C) 20x forstørrelse av en H & E-seksjon fra en brysthelefeste (boksområde). Lobulær arkitektur ble opprettholdt, men ble forstørret multifokalt av det økte antallet og størrelsen på normale alveoler og kanaler (lobuloalveolær hyperplasi). D) 40x forstørrelsen av en H & E-seksjon fra en brysthelefeste (boksområde) viser at de forstørrede lobulene inneholder et økt antall alveoler og kanaler som er foret med godt differensierte, ofte vakuolerte epitelceller, som danner lumen som inneholder Proteinholdig væske. Denne figuren er blitt modifisert fra Tucker et al. 9 . Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Brystkjertelen hele fjellet er et kraftig verktøy som kan brukes til å illustrere den normale brystutviklingen og morfologiske endringer som kan oppstå og vedvarer etter eksponering for kjemikalier, inkludert hormonforstyrrelser. Når en helfest og H & E-seksjon fra det samme dyret vurderes sammen, kan de gi et nøyaktig visuelt øyeblikksbilde av tidlige endringer som kan utvikle seg til en mer sjukt tilstand.

Evnen til å oppnå denne nyttige informasjonen ligger i å sørge for at det tas hensyn til å bevare og ikke kompromittere glandulær morfologi når vevet fjernes. Mens gnageren har flere brystkjertelter som ligger bilateralt langs dorsalveggen, anbefales det å samle den fjerde og femte kjertelen for å minimere gjenvinning av muskelvev. Brystvorten og lymfeknude bør også være til stede, da de tjener som nyttige morfologiske landemerker. Kjertelen skal også spres og strekkesChed over en flat overflate ( dvs. en glidelåse, kartong eller klut) for å nøye etterligne den naturlige strukturen av vevet på stedet . Unormaliteter i brystkirtlen er vanligvis ikke synlige før kjertelen har blitt fett i xylen eller har vært karminfarget. I motsetning til brystvev som ble opprinnelig forberedt på histologisk snitting, vil en hel montering fjernet fra glasset for paraffininkjetting være ekstremt tynn og skjør. Tvangsinntrykk og vevstår skal unngås, da de muligens vil endre cellemorfologi og gjøre histopatologiske evalueringer av ferdigproduktet vanskelig.

Når hele fjellet har blitt parafin-innebygd, er det anbefalt å la blokkene inkuberes ved -20 ° C i 1 time før snitting. Dette trinnet forbedrer muligheten til å oppnå en optimal representativ vevsdel i et bånd. Seksjonering av vevet ved 6 μm ( Figur 1A ) 9 Figur 1B ) 9 , ble alle cellulære trekk, inkludert epitelvev og omkringliggende stromal infiltrater, lett identifisert. Det skal også bemerkes at, selv om disse seksjonene tidligere var karminfarget, var flekken ikke synlig etter snitting og ikke forstyrret H & E-farging. Derfor var et de-fargingstrinn ikke nødvendig i protokollen. Selv om vevseksjoner ble farget utelukkende med H & E, forventer vi med mindre endringer, kan andre histokjemiske og muligens immunohistokjemiske flekker være aktuelt når seksjonen er fullført. Det var imidlertid utenfor omfanget av denne protokollen og vil kreve ytterligere undersøkelse for å bestemme de optimale forholdene for disse flekkene.

Denne prosedyren ble utviklet fordi vi observerte uoverensstemmende funn mellom rutinemessig innsamlet hvemLe mounts og kontralaterale H & E-farget mammekirtelseksjoner fra samme dyr. Lignende brystprotokoller finnes 6 , 10 ; Prosedyrene var imidlertid ikke detaljerte eller enkle å følge. Disse metodene dannet grunnlag for utviklingen av protokollen vår. Normal kjertemorfologi ble observert i H & E-fargede vevseksjoner ( Figur 2A og Figur 3A ) 1 , mens de komplementære helfestene viste mange unormale morfologiske egenskaper ( Figur 2B og Figur 3B ) 9 . Ved å utføre histologi på hele monteringene, kunne vi klassifisere de unormale funksjonene. For eksempel ble perivaskulær betennelse og lobuloalveolær hyperplasi identifisert i to separate tilfeller som var forskjellig i forhold til thE H & E funn observert i kontralaterale sider ( figur 2 C og D og figur 3 C og D ) 9 .

Til forfatterens kunnskap er det ingen kjente rapporter om avvik i brystkjertelen som ligner de som er observert i vår pågående studie. Dette kan imidlertid skyldes eksperimentelle designproblemer i stedet for mangel på forekomst, da brystkjertelen ofte bare samles inn for en applikasjon eller analyse som ikke involverer morfologi, for eksempel RT-PCR eller Western blots. Imidlertid inneholder mange eksperimenter flere applikasjoner som krever en tilstrekkelig mengde vev for hvert sluttpunkt. De inguinale kjertlene er det foretrukne valget for hele fester og nedstrømsapplikasjoner fordi de sjelden har forurensende omgivende vev som thorakkjertlene ( dvs. muskelforurensning) og fordi de inguinale brystlymfodene gir verdierStand landemerker for orientering og sammenligning over kjertler. Derfor bestemmer hvilken kjertel og hvor mye kjertelen som vil bli dedikert til hver applikasjon, innvirkning på deteksjonsnøyaktigheten. Prioritering for anvendelse i melkekjertelen bør være på: 1) en hel feste bestående av hele 4 og 5. kjertler, 2) histologi av den kontralaterale 4. kjertel som inneholder noen lymfeknute for anvendelse som et fjell, og 3) den kontralaterale 5. kjertelen (med ingen forurensende lymfeknute) for nedstrømsapplikasjoner (dvs. RNA, DNA og protein). Hvis en unormalitet er synlig ved nekropsy, bør en hel montering foretrekke histologiinnsamling.

Som med hvilken som helst protokoll, er det medfølgende begrensninger; Behovet for å permanent ødelegge hele fjellet under snitting og å ha begrenset vev til bruk i alternative analyser, for eksempel. Derfor anbefaler vi omfattende dokumentasjon av hele fester med en desktop sCanner å produsere digitale bilder for fremtidig analyse og referanse. Også, hvis farging ikke vil skje innen en måned, begrense antall seksjoner kuttet for å bevare vevet for fremtidige analyser. Fordelene ved denne hele monteringen til H & E-seksjonen oppveier begrensningene, slik at den kan brukes universelt til bryststudier som involverer flere disipliner, spesielt toksikologi. Flere studier ved bruk av kjemikalier med kjente endokrine effekter har inkludert en modifisert versjon av denne protokollen, som viser anvendelighet 11 , 12 , 13 . Resultater fra disse studiene kan bidra til å redusere sjansene for falsk negativ i kjemisk testing, men kan også gi ny eller tilleggsinformasjon som kan brukes til regulerings- og risikovurdering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen motstridende interesser å erklære i forbindelse med forskning, forfatterskap og / eller publisering av denne artikkelen.

Acknowledgments

Forfatterne vil gjerne anerkjenne Pam Ovwigho, Tenette Jones og Natasha Clayton, NIEHS, for deres tekniske kompetanse og støtte med dette prosjektet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Xylene Sigma-Aldrich 214736
Permount Thermo Fisher Scientific SP15-100 mounting media for coverslipping whole mounts and H&E sections
Leica automated processor Leica Biosystems Model # ST5020
HM 355S Automatic Microtome Thermo Fisher Scientific  905200
Paraffin Leica Biosystems EM-400
Superfrost plus microscope slides Thermo Fisher Scientific 4951PLUS-001 electrostatically charged
Fisher Finest 24x60x1 Thermo Fisher Scientific 12-548-5P coverslips
Varistain Gemini ES Automatic slide stainer Thermo Fisher Scientific A78000014
Sta-On Leica Biosystems 3803107 liquid adhesive; used in water bath at sectioning
Modified Harris Hematoxylin 72711 Richard-Allan Scientific (Part of Thermo Scientific) 72711
Eosin Leica Biosystems 3801600
Lithium Carbonate SkyTech Laboratories LCQ500
Glacial Acetic Acid Thermo Fisher Scientific A38-500 needed in Carnoy's fixative
Chloroform Macron Fine Chemicals 4440-04 needed in Carnoy's fixative
100% Ethanol The Warner Graham Company 6505001050000 needed in Carnoy's fixative and washing slides
95% Ethanol The Warner Graham Company 6505011137320190
Carmine Alum Sigma-Aldrich C1022-25G
Aluminum potassium sulfate dodecahydrate, Sigma Ultra Sigma-Aldrich A7210-500G
Automation wash buffer, 20X Biocare Medical TWB945

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rudel, R. A., Fenton, S. E., Ackerman, J. M., Euling, S. Y., Makris, S. L. Environmental exposures and mammary gland development: State of the science, public health, implications, and research recommendations. Environ Health Perspect. 119, (8), 1053-1061 (2011).
  2. Keenan, K. P., Wallig, M. A., Hascheck, W. M. Nature via Nurture: Effect of Diet on Health, Obesity, and Safety Assessment. Toxicol Pathol. 41, (2), 190-209 (2013).
  3. Stanko, J. P., Fenton, S. E. Quantifying branching density in rat mammary gland whole mounts using the Sholl analysis method. J Vis Exp. In press (2017).
  4. Toxicology Program, N. ational Specifications for the conduct of studies to evaluate the toxic and carcinogenic potential of chemical, biological, and physical agents in laboratory animals for the national toxicology program (NTP). National Toxicology Program, National Institutes of Environmental Health Sciences. Research Triangle Park, NC. Available from: http://ntp.niehs.nih.gov/ntp/test_info/finalntp_toxcarspecsjan2011.pdf (2011).
  5. Toxicology Program, N. ational Specifications for the conduct of studies to evaluate the reproductive and developmental toxicity of chemical, biological, and physical agents in laboratory animals for the National Toxicology Program (NTP). National Toxicology Program, National Institutes of Environmental Health Sciences. Research Triangle Park, NC. Available from: http://ntp.niehs.nih.gov/ntp/test_info/finalntp_reprospecsmay2011_508.pdf (2011).
  6. Mammary gland whole mount processing and staining. Available from: http://www.cpl.colostate.edu/pathology/protocols/wm.htm (2016).
  7. Whole mount preparations. Available from: http://www.protocol-online.org/cgi-bin/prot/view_cache.cgi?ID=2149 (2016).
  8. Filgo, A. J., et al. Mammary gland evaluation in juvenile toxicity studies: Temporal developmental patterns in the male and female Harlan Sprague Dawley Rat. Toxicol Pathol. 44, (7), 1034-1058 (2016).
  9. Tucker, D. K., Foley, J. K., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Preparation of high-quality hematoxylin and eosin-stained sections from rodent mammary gland whole mounts for histopathologic review. Toxicol Pathol. 44, (7), 1059-1064 (2016).
  10. Hvid, H., Thorup, O., Oleksiewicz, M. B., Sjogren, I., Jensen, H. E. An alternative method for preparation of tissue sections from the rat mammary gland. Exp Toxicol Path. 63, (4), 317-324 (2011).
  11. Munoz-de-Toro, M., et al. Perinatal exposure to bisphenol-A alters peripubertal mammary gland development in mice. Endocrinology. 146, (9), 4138-4147 (2005).
  12. Padilla-Banks, E., Jefferson, W. N., Newbold, R. Neonatal exposure to the phytoestrogen genistein alters mammary gland growth and developmental programming of hormone receptor levels. Endocrinology. 147, (10), 4871-4882 (2006).
  13. Nikaido, Y., et al. Effects of maternal xenotestrogen exposure on development of the reproductive tract and mammary gland in female CD-1 mouse offspring. Reprod Toxicol. 18, (6), 803-811 (2004).
Seksjon Mammary Gland Whole Mount for Lesion Identification
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification. J. Vis. Exp. (125), e55796, doi:10.3791/55796 (2017).More

Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification. J. Vis. Exp. (125), e55796, doi:10.3791/55796 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter