Burada, insandan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (hiPSC) serum serbest embriyo gövdesi (SFEB) denilen üç boyutlu (3 boyutlu) bir sistem geliştirmek için bir protokol bildirdik. Bu 3 Boyutlu model, insan kortikal gelişimini modellemek için organotipik dilim kültürü gibi ve gelişmekte olan sinir devrelerinin fizyolojik sorgusu için kullanılabilir.
HiPSC'leri kullanarak bir dizi in vitro hastalık modeli geliştirilmiş olsa da, bir sınırlama, bu iki boyutlu (2-B) sistemlerin, şüpheli hastalık varyantlarını taşıyan etkilenen bireylerin altında yatan sitolojik mimari ve fonksiyonel karmaşıklığı temsil etmeyebileceğidir. Konvansiyonel 2 boyutlu modeller in vivo benzeri yapıların eksik temsillerini tutar ve beynin karmaşıklığını yeterince yakalar. Dolayısıyla, in vivo bir sistemde görülen hücresel etkileşimleri ve işlevleri daha iyi özetleyebilen daha fazla 3-D hiPSC'ye dayalı modeller için yeni bir ihtiyaç ortaya çıkmaktadır.
Serbest embriyo gövdeye (SFEB) dayalı farklılaşmamış hiPSC'lerden 3 boyutlu bir sistem geliştirmek için bir protokol bildirdik. Bu 3 boyutlu model, gelişmekte olan bir ventralize neokorteksin özelliklerini yansıtır ve yaşayan sinir hücreleri ile göç, bağlantı, iletişim ve mat gibi bozulmamış dokular için ayrılmaz fonksiyonlara yönelik çalışmalara izin veriruration. Özellikle, protokolümüzü kullanan SFEB'lerin kalsiyum görüntüleme ve kriyoseksiyonsuz çok elektrotlu dizi (MEA) kayıtları gibi fizyolojik olarak alakalı ve içeriği yüksek hücre bazlı analizleri kullanarak sorguya çekilebileceğini gösteriyoruz. ÇÇ kayıtlarında, SFEB'lerin uzun süreli kültürde hem başak aktivitesini hem de şebeke seviyesinde patlama aktivitesini arttırdığını gösteriyoruz. Bu SFEB protokolü, erken kortikal gelişimin özelliklerini yakalayan 3 boyutlu bir modelde ağ oluşumunun geliştirilmesi çalışması için sağlam ve ölçeklenebilir bir sistem sağlar.
Daha önce erken kortikal ağ 1 geliştirme bazı yönlerini tekrarlar hasta-türevi insan uyarılmış pluripotent kök hücreler (hiPSCs) oluşturulmuş bir 3-boyutlu bir model sistemi, bildirmişlerdir. Serumsuz bir embriyo gövdesi (SFEB) olan bu 3 boyutlu model, önceki basit toplama hiPSC modelleri 2 , 3'ü geliştirir . Işin artan vücut 5 / tek tabakalı hiPSC modelleri 4 eden SFEBs gibi 3-B yapısı, sinir gelişme yaklaşık yönleri genel olarak in vivo ve 2-boyutlu (2-D) 'de gözlenenden daha önceki bir zaman noktasında gözlemlenen açıklayıcıdır. İlk çalışmalar, fizyolojik karmaşıklığını göstermeksizin üç boyutlu cisimciklerin kendilerini organize eden karmaşıklığına odaklanmıştır 2 .
Burada açıklanan protokol, fibroblastlardan türeyen farklılaşmamış hiPSC'lerde ve Periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC'ler). Bu hücreler γ-ışınlanmış fare embriyonik besleyicilerinde (MEFler) muhafaza edilir. Bu hiPSC kolonileri kendiliğinden farklılaşmış hücrelerden manuel olarak temizlenir, enzimatik olarak hasat edilir ve Rho-Kinaz inhibitörü Y-27632 (ROCKi) içeren ortamda yeniden süspanse edilir. Farklılaşmamış hiPSC'ler 96 oyuk düşük yapışma V-alt plakalarına aktarılmadan önce ayrışma ve santrifüje tabi tutulur. Kaplama sonra sinir indüksiyon çift Smad inhibisyonu kullanılarak başlatılır (birlikte SB431542 ve LDN193189 dickkopf 1 (dkk-1)), bir ön-cephe ön beyin nöron kaderini soy 6 sürücü. 14 gün sonra, SFEB'ler 6 oyuklu bir plaka içerisinde hücre kültür eklerine aktarılır. Bir kez aktarıldıktan sonra yuvarlak SFEB'ler yayılmaya ve inceltmeye başlarken, benzer hücre kültürü ekleri kullanan hipokampal organotipik dilim kültürü preparatlarında sıklıkla gözlendiği gibi yerel ağ bağlantılarını muhafaza ederek 1 ,Ss = "xref"> 7.
Bu formatta bir SFEB tabanlı 3 boyutlu platformun kullanımı kalsiyum görüntüleme veya tek hücreli kayıtlar veya çok elektrotlu dizi (MEA) gibi elektrofizyolojik testler gibi hücre bazlı fizyolojik tahliller kullanılarak sorgulanabilecek kortikal şebekelerin etkili bir şekilde üretilmesine uygundur ) 1 . 3 boyutlu sistemler erken kortikal gelişim işaretleri ayı rağmen, diğer çalışmalar bu 3 boyutlu cisimler insan dokusu gelişimi 8'in doğal olarak daha yavaş bir hızda izin vermek için daha uzun inkübasyon süreleri gerekebilir göstermiştir. Bu SFEB protokolü, kortekste erken gelişim özelliklerini yakalayan farklılaşmamış hiPSC'lerden başarıyla 3-D SFEB'ler üretir.
SFEB'lerin nörolojik bozukluklarda ağ aberasyonlarını modelleme potansiyeli bu sistemin gücüdür. Hasta dokusundan türetilen hiPSC'ler, sinir sisteminin kıçına tabi olan hücrelere yetiştirilebilirHücre biyolojisine ve aynı zamanda gen ekspresyonuna ilişkindir. İnsan iPSC'leri, otizm spektrum bozukluğu (ASD), şizofreni 9 , Rett Sendromu 10 ve Alzheimer hastalığı 11 , 12 gibi karmaşık etyolojilere sahip çeşitli nörolojik bozukluklara sahip geniş birey gruplarının genetik profilini tespit etmek için kullanılmaktadır. Yakın zamana kadar, iPSC modelleri tipik olarak, moleküler etkileşimleri değerlendirmede yeterli iken , in vivo görülen karmaşık hücresel etkileşimleri deşifrelemede yetersiz kalan tek tabaka preparatlarıydı. Hayvan modelleri, tümör organı platformunun yeniden oluşturulması için varsayılan ikame olmuştur. Bu hayvan modelleri, bulguların zayıf bir şekilde çevrilmesinden dolayı rahatsızdır ve büyük genetik tarama çalışmaları ile tanımlanan insan genetik profillerini çoğaltma yeteneği sınırlıdır. Böylece, iPSC'lerden 3-B sistemlerin geliştirilmesi, insan için gerekli bir katman katma- sını katarHastalık modelleme 13 , 14 . 3D hiPSC platformları için bir sonraki adım, hücre bazlı tahliller kullanılarak yüksek verimli taramada büyük ölçekli gereksinimleri karşılamaktır 15 .
Burada açıklanan protokol, bir hiPSC kaynağının frontal korteksin erken gelişim evresini yineleyen 3 boyutlu bir yapıya ayırma koşullarını sağlar. Bu prosedür, aynı zamanda mikroskopi yapılmaya elverişli olan elektrofizyoloji için sorgulanabilen yapılar üretir. SFEB'nin son morfolojisi, organotipik beyin dilim kültürlerine benzemekte ve yüksek kaliteli ayrıntılı konfokal görüntülemeye olanak sağlamaktadır. Bu protokol, hem fibroblast hem de periferik-kan mononükleer hücre kaynaklı hi…
The authors have nothing to disclose.
Makaleyi düzeltmek için Elizabeth Benevides'e teşekkür ediyoruz. Dr Dr teşekkür ederim. John Hussman ve Gene Blatt'ın yararlı tartışmaları ve yorumları için teşekkür ederiz.
SFEB Neuronal Differentiation Cell culture Media. Reagents. Components | |||
STEMdiff Neural Induction Medium (hiPSC Media) | STEMCELL Technologies | 0-5835 | 250ml |
PluriQ ES-DMEM Medium (MEF Media) | GlobalStem | GSM-2001 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
DM1 Media Components | |||
D-MEM/F-12 (1X), Glutamax liquid, 1:1 | Invitrogen | 10565018 | 385ml |
Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828028 | 20% 100ml |
Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5ml |
Glutamax 200mM | Invitrogen | 35050061 | 5ml |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution 10 mM (100X), liquid | Invitrogen | 11140050 | 5ml |
2-Mercaptoethanol (1,000X), liquid | Invitrogen | 21985023 | 900ul |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
DM2 Media Components | |||
D-MEM/F-12 (1X), Glutamax liquid, 1:1 | Invitrogen | 10565018 | 500ml |
Glutamax 200mM | Invitrogen | 35050061 | 5ml |
Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5ml |
N-2 Supplement (100X), liquid | Invitrogen | 17502048 | 10ml |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
DM3 Media Components | |||
NEUROBASAL Medium (1X), liquid | Invitrogen | 21103049 | 500ml |
B-27 Supplement Minus Vitamin A (50X), liquid | Invitrogen | 12587010 | 10ml |
Glutamax 200mM | Invitrogen | 35050061 | 5ml |
Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5ml |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Small Molecules | |||
Thiazovivin | Stemgent | 04-0017 | 2uM |
SB431542 | Stemgent | 04-0010-10 | 1:1000 (10uM) |
Dorsomorphin | Stemgent | 04-0024 | 1uM |
LDN-193189 | Stemgent | 04-0074-10 | 250nM |
Y27632 (ROCKi) | Stemgent | 04-0012-10 | 10uM |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Recombinant Protiens | |||
DKK-1 | Peprotech | 120-30 | 200ng/ml |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Components/Materials | |||
Cell Culture inserts 0.4uM, 30mm Diameter | Millicell | PICM0RG50 | |
Mouse Embryonic Fibroblasts | GlobalStem | GSC-6301G | |
96 well V bottom w/Lids | Evergreen | 222-8031-01V | |
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | ThermoFisher | A1110501 | |
TritonX-100 | ThermoFisher | 85111 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher | 10010023 | 500 mL |
Normal Donkey Serum | Jackson Labs | 017-000-121 | |
Leibovitz's L-15 Medium | ThermoFisher | 11415114 | 500 mL |
DRAQ5 (Nuclear Marker) | ThermoFisher | 65-0880-96 | |
MEA Plates | Axion Biosystems | M768-GL1-30Pt200 | |
6 well flat bottom | Falcon | 353046 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Antibody | |||
Nestin | Millipore | MAB5326 | |
Brn-2 | Protein tech | 14596-1-AP | |
VGLUT1 | Synaptic Systems | 135 303 | |
Pax6 | abcam | ab5790 | |
Calretinin | abcam | ab702 | |
Calbindin | abcam | ab11426 | |
CoupTFII | R&D Systems | PPH714700 | |
Nkx 2.1 | abcam | ab12650 | |
Tuj1 | abcam | ab41489 | |
Reelin | Millipore | MAB5364 | |
Tbr1 | Millipore | MAB2261 | |
NFH | Dako | M0762 |