Aqui, relatamos um protocolo para desenvolver um sistema tridimensional (3-D) a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs) chamado corpo embrionóide sem soro (SFEB). Este modelo 3-D pode ser usado como uma cultura de fatia organotípica para modelar o desenvolvimento cortical humano e para a interrogação fisiológica do desenvolvimento de circuitos neurais.
Embora uma série de modelos de doenças in vitro tenham sido desenvolvidos usando o HiPSCs, uma limitação é que esses sistemas bidimensionais (2-D) podem não representar a complexidade subjacente citocárdica e funcional dos indivíduos afetados portadores de variantes de doença suspeitas. Os modelos 2-D convencionais permanecem representações incompletas de estruturas semelhantes a in vivo e não capturam adequadamente a complexidade do cérebro. Assim, há uma necessidade emergente de mais modelos baseados em HiPSC 3-D, que podem melhor recapitular as interações e funções celulares observadas em um sistema in vivo .
Aqui, relatamos um protocolo para desenvolver um sistema 3-D a partir de hiPSCs indiferenciados com base no corpo embrionóide sem soro (SFEB). Este modelo 3-D espelha aspectos de um neocórtex ventralizado em desenvolvimento e permite estudos sobre funções integrantes de células neurais vivas e tecido intacto, como migração, conectividade, comunicação e tapeteUração. Especificamente, demonstramos que os SFEBs que usam nosso protocolo podem ser interrogados usando ensaios baseados em células fisiologicamente relevantes e de alto conteúdo, tais como imagens de cálcio e gravações de matrizes múltiplas (MEA) sem criosecção. No caso das gravações MEA, demonstramos que os SFEBs aumentam tanto a atividade do ponto como a atividade de explosão no nível da rede durante o cultivo a longo prazo. Este protocolo SFEB fornece um sistema robusto e escalável para o estudo do desenvolvimento da formação da rede em um modelo 3-D que captura aspectos do desenvolvimento cortical inicial.
Já relatamos um sistema modelo 3-D, gerado a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs), que recapitulam alguns aspectos do desenvolvimento inicial da rede cortical 1 . Este modelo 3-D, um corpo embrionário isento de soro (SFEB), melhora os modelos 2 , 3 de agregação simples anteriores de agregação. Um corpo crescente de trabalho revela que estruturas tridimensionais, como nossas SFEBs, aspectos aproximados do desenvolvimento neural comumente observados in vivo e em um ponto de tempo anterior ao observado nos modelos hipsc 2-dimensional (2-D) / monocamada 4 , 5 . Os estudos iniciais têm sido focados na complexidade auto-organizada dos corpos 3-D sem demonstrar sua complexidade fisiológica 2 .
O protocolo descrito aqui foi usado em hiPSCs indiferenciados derivados de fibroblastos e Células mononucleares de sangue periférico (PBMCs). Essas células são mantidas em alimentadores embrionários de ratos irradiados com γ (MEFs). Estas colônias HiPSC são limpas manualmente de células diferenciadas espontaneamente, colhidas enzimaticamente e ressuspensas em meio contendo inibidor de Rho-quinases Y-27632 (ROCKi). HiPSCs indiferenciados são submetidos à dissociação e centrifugação antes de serem transferidos para placas de 96 poços de baixa aderência em V. Após o chapeamento, a indução neural é iniciada usando a inibição dupla de SMAD (SB431542 e LDN193189, juntamente com dickkopf 1 (DKK-1)) para direcionar uma linhagem do farol neurônio anterior-frontal do prosencéfalo 6 . Após 14 dias, os SFEBs são transferidos para inserções de cultura de células em uma placa de 6 poços. Uma vez transferidos, os SFEB redondos começam a se espalhar e fino, mantendo conexões de rede locais, como é freqüentemente observado em preparações de cultura de fatia organotípicas do hipocampo usando inserções similares de cultura celular 1 ,Ss = "xref"> 7.
O uso de uma plataforma 3-D baseada em SFEB neste formato é passível de produção eficiente de redes corticais que podem ser interrogadas usando ensaios fisiológicos baseados em células, tais como imagens de cálcio ou ensaios eletrofisiológicos, como gravações de células únicas ou matrizes de vários eletrodos (MEA ) 1 . Embora os sistemas 3-D tenham marcadores do desenvolvimento cortical precoce, outros estudos mostraram que esses corpos 3-D podem exigir tempos de incubação mais longos para permitir o ritmo inerentemente mais lento do desenvolvimento de tecido humano 8 . Este protocolo SFEB gera com sucesso 3-D SFEBs de hiPSCs indiferenciados que captura aspectos do desenvolvimento inicial do córtex.
O potencial de SFEBs para modelar aberrações de rede em distúrbios neurológicos é uma força desse sistema. Os hiPSCs derivados do tecido do paciente podem ser cultivados em células do sistema nervoso que estão sujeitas a bundaSão relacionados à biologia celular, bem como a expressão de genes concomitantes. IPSCs humanos estão a ser usada para determinar o perfil genético de grandes grupos de indivíduos com diferentes distúrbios neurológicos com etiologias complexas, tais como a desordem do espectro do autismo (ASD), esquizofrenia 9, síndrome de Rett 10, e doença de Alzheimer 11, 12. Até recentemente, os modelos iPSC eram tipicamente preparações monocamadas que, embora proficientes na avaliação de interações moleculares, eram inadequadas na decifração das interações celulares complexas vistas in vivo . Os modelos de animais têm sido o substituto padrão para recriar a plataforma do órgão inteiro. Esses modelos animais estão atormentados pela má tradução de achados e têm capacidade limitada para replicar perfis genéticos humanos identificados por grandes estudos de triagem genética. Assim, o desenvolvimento de sistemas 3-D de iPSCs adiciona uma camada necessária de complexidade em humanosModelagem da doença 13 , 14 . O próximo passo para as plataformas 3D HiPSC é acomodar os requisitos de grande escala de rastreio de alto rendimento usando ensaios baseados em células 15 .
O protocolo descrito aqui fornece as condições para diferenciar uma fonte hiPSC em uma estrutura 3-D que recapitula um estágio inicial de desenvolvimento do córtex frontal. Este procedimento produz estruturas que podem ser interrogadas para eletrofisiologia, ao mesmo tempo que são passíveis de microscopia. A morfologia final do SFEB se assemelha à das culturas de fatia de cérebro organotípica e permite uma imagem confocal detalhada de alta qualidade. Este protocolo pode gerar com sucesso SFEBs de ambos os hiPSC…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Elizabeth Benevides pela revisão do artigo. Agradecemos aos Drs. John Hussman e Gene Blatt para suas discussões e comentários úteis.
SFEB Neuronal Differentiation Cell culture Media. Reagents. Components | |||
STEMdiff Neural Induction Medium (hiPSC Media) | STEMCELL Technologies | 0-5835 | 250ml |
PluriQ ES-DMEM Medium (MEF Media) | GlobalStem | GSM-2001 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
DM1 Media Components | |||
D-MEM/F-12 (1X), Glutamax liquid, 1:1 | Invitrogen | 10565018 | 385ml |
Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828028 | 20% 100ml |
Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5ml |
Glutamax 200mM | Invitrogen | 35050061 | 5ml |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution 10 mM (100X), liquid | Invitrogen | 11140050 | 5ml |
2-Mercaptoethanol (1,000X), liquid | Invitrogen | 21985023 | 900ul |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
DM2 Media Components | |||
D-MEM/F-12 (1X), Glutamax liquid, 1:1 | Invitrogen | 10565018 | 500ml |
Glutamax 200mM | Invitrogen | 35050061 | 5ml |
Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5ml |
N-2 Supplement (100X), liquid | Invitrogen | 17502048 | 10ml |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
DM3 Media Components | |||
NEUROBASAL Medium (1X), liquid | Invitrogen | 21103049 | 500ml |
B-27 Supplement Minus Vitamin A (50X), liquid | Invitrogen | 12587010 | 10ml |
Glutamax 200mM | Invitrogen | 35050061 | 5ml |
Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5ml |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Small Molecules | |||
Thiazovivin | Stemgent | 04-0017 | 2uM |
SB431542 | Stemgent | 04-0010-10 | 1:1000 (10uM) |
Dorsomorphin | Stemgent | 04-0024 | 1uM |
LDN-193189 | Stemgent | 04-0074-10 | 250nM |
Y27632 (ROCKi) | Stemgent | 04-0012-10 | 10uM |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Recombinant Protiens | |||
DKK-1 | Peprotech | 120-30 | 200ng/ml |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Components/Materials | |||
Cell Culture inserts 0.4uM, 30mm Diameter | Millicell | PICM0RG50 | |
Mouse Embryonic Fibroblasts | GlobalStem | GSC-6301G | |
96 well V bottom w/Lids | Evergreen | 222-8031-01V | |
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | ThermoFisher | A1110501 | |
TritonX-100 | ThermoFisher | 85111 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher | 10010023 | 500 mL |
Normal Donkey Serum | Jackson Labs | 017-000-121 | |
Leibovitz's L-15 Medium | ThermoFisher | 11415114 | 500 mL |
DRAQ5 (Nuclear Marker) | ThermoFisher | 65-0880-96 | |
MEA Plates | Axion Biosystems | M768-GL1-30Pt200 | |
6 well flat bottom | Falcon | 353046 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Antibody | |||
Nestin | Millipore | MAB5326 | |
Brn-2 | Protein tech | 14596-1-AP | |
VGLUT1 | Synaptic Systems | 135 303 | |
Pax6 | abcam | ab5790 | |
Calretinin | abcam | ab702 | |
Calbindin | abcam | ab11426 | |
CoupTFII | R&D Systems | PPH714700 | |
Nkx 2.1 | abcam | ab12650 | |
Tuj1 | abcam | ab41489 | |
Reelin | Millipore | MAB5364 | |
Tbr1 | Millipore | MAB2261 | |
NFH | Dako | M0762 |