एक नमूना का उपयोग करते हुए जैविक ऊतकों से लिपिड, मेटाबोलाइट्स और प्रोटीन के व्यापक निष्कर्षण के लिए प्रस्तुत किया गया है।
जटिल जैविक प्रणालियों को समझना, जीवित कोशिका के एक से अधिक यौगिक वर्गों के माप, विश्लेषण और एकीकरण की आवश्यकता होती है, जो आमतौर पर ट्रांसस्क्रिप्टोमीक, प्रोटिओमिक, मेटाबोलामीक्स और लिपिडोमिक मापन द्वारा निर्धारित होते हैं। इस प्रोटोकॉल में, प्रति नमूना एक विभेदक का उपयोग करके जैविक ऊतकों से चयापचयों, लिपिड और प्रोटीन की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य निष्कर्षण के लिए हम एक सरल विधि पेश करते हैं। निकासी विधि मिथाइल टर्ट -बेटिलीन ईथर पर आधारित है: मेथनॉल: तरल पदार्थों के लिए जल प्रणाली: हाइड्रोफोबिक और ध्रुवीय चयापचयों का तरल विभाजन, एक स्थिर गोली के रूप में प्रोटीनों की वर्षा और अन्य अणुओं के साथ-साथ दो अमिषीय चरणों में होता है। इसलिए, यह विधि विशिष्ट आणविक संरचना के तीन अलग-अलग अंश प्रदान करती है, जो द्रव्य क्रोमैटोग्राफी (एलसी) या गैस क्रोमैटोग्राफी (जीसी) जैसे आम हाई थ्रुपुट 'ओमिक्स' प्रौद्योगिकियों जैसे बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर के साथ पूरी तरह से संगत है। हालांकि विधि init थाविभिन्न पौधे के ऊतक नमूनों के विश्लेषण के लिए विकसित किया गया है, यह शैवाल, कीड़े और स्तनधारी के ऊतकों और सेल संस्कृतियों के रूप में विविध प्रणालियों से जैविक नमूनों के निष्कर्षण और विश्लेषण के लिए पूरी तरह से संगत साबित हुआ है।
सिस्टम जीव विज्ञान, जो पिछली शताब्दी 1 के मध्य में उभरा और जीनोमिक और ट्रांसस्क्रिप्टमिक डेटा सेटों के बड़े पैमाने पर विश्लेषण द्वारा उन्नत किया गया , 2 , 3 , ने जटिल जैविक प्रणालियों 4 , 5 के विश्लेषण के लिए एक नया और अपरिहार्य दृष्टिकोण विकसित किया है। सिस्टम बायोलॉजी का मुख्य उद्देश्य जैविक प्रणालियों में घटक परस्पर क्रियाओं और निर्भरता को समझना और जीनोटाइप, उनकी प्राप्ति, आणविक परिवर्तनों और परिणामी फ़िनोटीप्स के बीच संबंध को पुल करने के लिए है। तदनुसार, व्यापक बड़े पैमाने पर विश्लेषणात्मक दृष्टिकोणों, अर्थात् जीनोमिक्स, ट्रांसस्क्रिप्टमिक्स, मेटाबोलामिक्स, लिपिडोमिक्स और प्रोटिओमिक्स और उनके कम्प्यूटेशनल विश्लेषण द्वारा निर्मित व्यापक डेटा सेटों का एकीकरण जटिल जैविक प्रणालियों के विवरण और समझने के लिए एक शर्त बन गया है।
बास किसी भी जीवित प्रणाली में जैविक घटकों की विशाल रासायनिक विविधता और जटिलता पर एड, बड़े और व्यापक 'ओमिक्स' डेटा सेट का उत्पादन, लागू निष्कर्षण पद्धति 9 की गुणवत्ता पर दृढ़तापूर्वक निर्भर करता है। निष्कर्षण विधि की गुणवत्ता के अलावा, विधि की अर्थव्यवस्था महत्वपूर्ण है; इसका मतलब यह है कि जितना संभव हो उतना नमूना इनपुट के रूप में बहुत आणविक जानकारी प्राप्त करना वांछनीय होगा। अक्सर नमूना मात्रा सीमित हो सकती है और इसलिए यह निष्कर्षण विधि का उपयोग करने के लिए बेहद वांछनीय है, जो किसी दिए गए नमूने के एकल निष्कर्षण से कई आणविक वर्गों को प्राप्त कर सकता है। इसका अर्थ है कि एक ही नमूना के विभिन्न नमूना aliquots से विभिन्न यौगिक कक्षाओं के निष्कर्षण के लिए कई विशेष निष्कर्षण विधियों का उपयोग करने के बजाय, एक अनुक्रमिक निकासी विधि कार्यरत है, जो अलग-अलग आणविक भिन्नों में एक विभेदक के आणविक घटकों को अलग करता है।
_content "> इन भिन्न निष्कर्षण विधियों के लिए नियोजित सामान्य विधि, फोलच एट अल से दो चरण लिपिड निष्कर्षण पद्धति पर आधारित है। 1 9 57 में विकसित। यह विधि क्लोरोफॉर्म पर आधारित है: ध्रुवीय और हाइड्रोफोबिक चयापचयों का मेथनॉल / पानी विभाजन और उच्च गुणवत्ता वाले लिपिड विश्लेषण के लिए साफ-सुथरा और डी-जटिल नमूने का इरादा है। बहु-ओमिक्स सिस्टम जीवविज्ञान के विकास के साथ, फॉल्च पद्धति आगे, चरणबद्ध, प्रोटीन और ध्रुवीय मेटाबोलाइट्स और लिपिड के नमूना विभाजन के लिए इसका उपयोग करके बेहतर था। तरल क्रोमैटोग्राफी-आधारित प्रोटिओमिक्स 11 , 12 , 13 , 14 के अलावा, गैस और तरल क्रोमैटोग्राफी-आधारित चयापचय और ध्रुवीय और हाइड्रोफोबिक यौगिकों के लिपिडोमिक्स। दुर्भाग्य से, ये सभी विधियां क्लोरोफॉर्म-आधारित निष्कर्षण विधि पर निर्भर करती हैं, जो न केवल अवांछित फॉ के लिए जाता हैध्रुवीय और लिपिड चरण के बीच एक इंटरफेस के रूप में प्रोटीन गोली का रिमाशन, लेकिन जो हरे रंग की रसायन विज्ञान परिप्रेक्ष्य 15 , 16 से भी अवांछनीय विलायक है। हालांकि, विलायक मिथाइल टर्ट -बेटिलीन ईथर (एमटीबीई) इन दोनों की उपरोक्त समस्याओं पर काबू पाती है और क्लोरोफॉर्म के लिए उपयुक्त प्रतिस्थापन है। इन आवश्यकताओं के आधार पर, हमने एक एमटीबीई स्थापित करने का निर्णय लिया: मेथनॉल: पानी आधारित निकासी विधि, जो सभी पूर्वनिर्धारित विनिर्देशों को पूरा करती है और इसलिए व्यापक बहु-ओमिक्स विश्लेषण 16 के लिए एक आदर्श प्रारंभ बिंदु के रूप में कार्य करता है।यह प्रोटोकॉल सामान्य चरण की समस्याओं के निवारण सहित नमूना तैयार करने के सरल, तेज और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य वर्कफ़्लो के माध्यम से उपयोगकर्ता चरण-दर-चरण का मार्गदर्शन करता है। इसके अलावा, हम संक्षेप में अल्ट्रा-प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी-जन स्पेक्ट्रोमेट्री (यूपीएलसी-एमएस) से अनुकरणीय विश्लेषणात्मक आंकड़े पेश करेंगेएड लिपिडोमिक्स, मेटाबोलामोक्स और प्रोटीमोक्स प्रोफाइलिंग संयंत्र के ऊतकों के नमूने से। यद्यपि दिए गए उदाहरण अरबीडोपिस थलियाना पत्ती के ऊतक नमूने के 50 मिलीग्राम से निकले हैं , इस प्रोटोकॉल का उपयोग कई जैविक नमूनों और ऊतकों के लिए किया गया है, जिसमें शैवाल 17 , 18 , कीड़े 19 और स्तनधारी कोशिकाएं, अंगों और ऊतक 20 , 21 , 22 प्रस्तुत निष्कर्षण प्रोटोकॉल का दायरा पूर्व निष्कर्षण नमूना हैंडलिंग का स्पष्ट और विस्तृत वर्णन और निष्कर्षण प्रक्रिया ही प्रदान करना है। हालांकि हम विश्लेषणात्मक आवेदन के तीन संक्षिप्त उदाहरण प्रदान करते हैं, पूर्व और पोस्ट विश्लेषणात्मक डेटा से निपटने के बारे में विस्तृत जानकारी हमारे पिछले 16 , 23 , 24 के प्रकाशनों से प्राप्त की जा सकती है , <supClass = "xref"> 25 , 26
इस लेख में, हम एक एकल 50 मिलीग्राम लीप नमूने से व्यापक लिपिडोमिक, मेटाबोलामोइक और प्रोटियोमिक विश्लेषण के लिए सरल और अत्यधिक लागू निष्कर्षण प्रोटोकॉल का वर्णन और वर्णन करते हैं। इस विधि का कई अध्ययनों में इस्तेमाल किया गया है, जो 17 , 18 , 1 9 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 के विभिन्न लेखों में प्रकाशित हुए हैं। और इसके सीधे-आगे के अलावा साबित हुएकार्यप्रवाह और उच्च प्रयोज्यता मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य
यहां दिए गए आवेदन एक जटिल जैविक नमूने की प्रारंभिक स्क्रीनिंग के लिए कुछ नियमित तरीके दिखाते हैं। इन सचित्र बड़े पैमाने पर मेटाबोलामोिक और लिपिडोमिक डेटा सेट विश्लेषण जैविक प्रणाली के चयापचय में व्यापक या विशिष्ट परिवर्तनों के बारे में व्यापक जानकारी प्रदान कर सकते हैं, जबकि प्रोटीन के विश्लेषण से प्राप्त डेटा मात्रात्मक (बहुतायत) और गुणात्मक (संशोधनों) में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है ) सेलुलर फ़ंक्शंस और मशीनरी को नियंत्रित करने वाले एंजाइम, स्ट्रक्चरल प्रोटीन या ट्रांसक्रिप्शन कारक (टीएफ) में परिवर्तन तदनुसार, समेकित ओमिक्स डेटा में विशिष्ट चयापचय मार्गों या सेलुलर प्रक्रियाओं से संबंधित विविध अणुओं के आणविक परिवर्तनों को बताकर, जैविक प्रणाली के आनुवंशिक या जैविक और / या अबायोटिक उलझनियों द्वारा प्रेरित संभावित परिवर्तनों के बारे में प्रारंभिक जानकारी प्रकट करने की क्षमता है।
बेशक, दीर्घकालिक में, एक सफल सिस्टम जीव विज्ञान विश्लेषण के लिए, विश्लेषित और एनोटेट किए गए आणविक संस्थाओं की संख्या को अधिकतम करने के लिए, सेलुलर फ़ंक्शंस की निगरानी और संभवतः पूरी तरह से गतिविधियों की अनुमति देने के लिए, यह काफी आवश्यक है। इस प्रयोजन के लिए, प्राप्त किए गए अंश भिन्न वैश्वीकृत विश्लेषणात्मक विधियों के लिए अतिरिक्त रूप से लागू हो सकते हैं, और आगे यौगिक या मिश्रित कक्षाएं ( चित्रा 4 ) को लक्षित कर सकते हैं।
यह कहने के बाद, यह उल्लेख किया जाना चाहिए कि प्राप्त आंकड़ों की वैश्विक विश्लेषण रणनीति दो अलग-अलग रणनीतियों का पालन कर सकती है: एक तरफ, हम ज्ञात परिसरों की मात्रा का ठहराव करके सेलुलर फ़ंक्शन की व्याख्या को बल देते रहे हैं। दूसरी ओर, मापा चयापचयों और लिपिड के कई अभी तक ज्ञात या एनोटेट नहीं हैं। ये, फिर भी, संयुक्त राष्ट्र-एनोटेट यौगिक मापन में बहुत सारी सार्थक जानकारी भी होती है, जिसका उपयोग वर्गीकरण या भेदभाव के लिए सांख्यिकीय तरीकों से किया जा सकता है।एटीन समूह या उपचार 20 , 21 , 22
फिर भी, इन अज्ञात यौगिकों, विशेष रूप से समूह वर्गीकरण के लिए प्रासंगिक या बायोमार्कर के रूप में सेवा करने वालों को पहचानने की आवश्यकता है। यह पहचान प्रक्रिया दुर्भाग्य से काफी कठिन है और अतिरिक्त विश्लेषणात्मक माप या रणनीति के बिना प्राप्त नहीं की जा सकती 38 । जैसा कि चित्रा 4 से देखा जा सकता है, संयुक्त राष्ट्र-एनोटेट यौगिकों की संख्या काफी अधिक है (वास्तव में विशाल बहुमत)। फिर भी, जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, इन क्रोमैटोग्राफिक चोटियों को डेटा विश्लेषण में संभाला जा सकता है और इसलिए महत्वपूर्ण प्रभावित संस्थाओं को स्पष्ट किया जा सकता है और आगे की पहचान रणनीतियों के अधीन किया जा सकता है।
संक्षेप में, हम यह निष्कर्ष निकाल सकते हैं कि यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल प्रायोगिक प्रणालियों के जीवविज्ञान के लिए और शास्त्रीय सांख्यिकीय आवेदकों के लिए कई लाभ प्रदान करता हैations।
सबसे पहले, क्योंकि सभी अंश एक नमूने से निकाले जाते हैं, विभिन्न प्रयोगात्मक डेटा सेट (लिपिड्स, मेटाबोलाइट्स, प्रोटीन) के बीच अंतर काफी कम हो जाता है क्योंकि प्रत्येक डेटा सेट उसी नमूना विभाज्य से प्राप्त होता है यह स्पष्ट रूप से प्राप्त परिणाम की वृद्धि की तुलनात्मकता की ओर जाता है।
दूसरा, विधि आसानी से स्केलेबल है और यह इसलिए छोटे से बड़े नमूना मात्रा के साथ बेहद संगत बनाता है। हम नियमित रूप से 10-100 मिलीग्राम ऊतक नमूनों का उपयोग करते हैं, लेकिन सफल लिपिडॉमिक अध्ययन भी 20 अरबिडोप्सिस 31 के रूप में किए जाते हैं । विशेष रूप से छोटे नमूना मात्रा के साथ संगतता इस पद्धति को लागू करती है यदि सीमित मात्रा में जैविक ऊतकों या नमूने उपलब्ध हैं। फिर भी, भले ही पर्याप्त नमूना सामग्री उपलब्ध हो, यहां प्रस्तुत विधि में इन नमूनों का उपयोग करने के बजाय प्रयोगात्मक replicates की एक बड़ी संख्या में उपयोग करने के लिए लाभ प्रदान करता हैउन्हें विभिन्न निष्कर्षण प्रक्रियाओं के लिए गाएं यह एक बेहतर और परिष्कृत सांख्यिकीय डेटा विश्लेषण के लिए अनुमति देता है।
तीसरा, चूंकि यह विधि ध्रुवीय और गैर-ध्रुवीय अणुओं के तरल-तरल विभाजन पर आधारित है, यह सरल एक चरण निष्कर्षण विधियों ( जैसे मेथनॉल निष्कर्षण) के विपरीत प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण डी-कॉम्प्लेक्सिंग चरण प्रदान करता है। यह कुशल नमूना डी-कॉम्प्लेक्सिंग एक दूसरे से रासायनिक दखल अणुओं के पृथक्करण के कारण अलग-अलग अंशों के आंशिक शुद्धि की ओर ले जाता है। तदनुसार, रासायनिक विभाजन प्रक्रिया न केवल अलग-अलग रासायनिक वर्गों में निकाले गए नमूनों के व्यवस्थित भुखमरी के लिए एक व्यावहारिक लाभ प्रदान करती है, बल्कि व्यक्तिगत विश्लेषणात्मक माप को भी सुधारती है, क्योंकि यह भिन्न भिन्न भागों से संदूषित यौगिकों को हटाता है। स्पष्ट रूप से, हम देख सकते हैं कि विशेष रूप से लिपिड, जो कि जैविक चरण में विभाजित हैं और जो आमतौर पर नकारात्मक रूप से प्रभावित होते हैंध्रुवीय यौगिकों के क्रोमैटोग्राफिक विश्लेषण, ध्रुवीय अंश से लगभग पूरी तरह से अनुपस्थित रहेगा यह हाइड्रोफोबिक लिपिड के विश्लेषण के लिए भी सही है, जो ध्रुवीय यौगिकों के कम हो जाएगा। एक दूसरे से ध्रुवीय और गैर-विखंडन यौगिकों की शुद्धि के अलावा, हम नमूना से प्रोटीन और अन्य मैक्रो-अणुओं को कम करते हैं और इकट्ठा करते हैं, न कि केवल एक अलग अंश प्रदान करते हैं, जो प्रोटीन, स्टार्च और सेल दीवार विश्लेषण 16 के लिए उपयोग किया जा सकता है, लेकिन यह भी अलग-अलग हिस्सों में एक क्लीनर नमूना की ओर जाता है यह विशेष रूप से प्रासंगिक है, क्योंकि यह ज्ञात है कि बड़े macromolecules की उपस्थिति, विश्लेषणात्मक कॉलम के नुकसान या कम से कम छोटा जीवनकाल की ओर जाता है।
अंतिम लेकिन कम से कम, वर्णित एमटीबीई निकासी विधि, जो कम खतरनाक और अधिक अनुकूल क्लोरोफॉर्म प्रतिस्थापन विलायक 15 पर निर्भर है, पहले से ही हमारे समूह से कई अध्ययनों से दिखाया गया है, व्यापक रूप सेपौधों 16 , शैवाल 17 , 18 , मक्खियों 19 से विभिन्न जैविक नमूने के लिए दक्षता , लेकिन कई स्तनधारी ऊतकों, अंगों या कोशिकाओं 20 , 21 , 22 ।
The authors have nothing to disclose.
एमएस को जीईआरएलएस-डीएएडी कार्यक्रम से पूर्ण पीएचडी छात्रवृत्ति द्वारा समर्थित है। पांडुलिपि पर प्रूफ पढ़ने और टिप्पणी करने के लिए हम डॉ। एंड्रयू विस्ज़निव्स्की को धन्यवाद देना चाहते हैं। हम मैक्स-प्लैंक इंस्टीट्यूट ऑफ आण्विक प्लांट फिजियोलॉजी, गोलम, जर्मनी में जीआईवलिस्को लैब के सभी सदस्यों के लिए उनकी मदद के लिए बहुत आभारी हैं।
Reagents and standards | |||
Ampicillin | Sigma Aldrich | A9393-5G | Internal standard for metabolites |
Corticosterone | Sigma Aldrich | 27840-500MG | Internal standard for metabolites, HPLC grade |
13C Sorbitol | Sigma Aldrich | 605514 | Internal standard for metabolites, ISOTEC® Stable Isotopes |
1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (17:0 PC) | Avanti Polar Lipids | 850360P | Internal standard for lipids |
Methanol (MeOH) | Biosolve Chemicals | 13684102 | ULC-MS grade |
Water | Biosolve Chemicals | 23214102 | ULC-MS grade |
Methyl tert-butyl ether (MTBE) | Biosolve Chemicals | 13890602 | HPLC grade |
Trypsin/Lys-C mix | Promega | V5072 | Enzymatic digestion of proteins |
Equipment | |||
Balance | Sartorius Corporation | 14 557 572 | |
Tissue grinding mixer mill | Retsch, Mixer Mill MM 300 | 20.746.0001 | |
Mortar and pestle | Sigma Aldrich | Z247464-1EA | |
Vortex mixer | Vortex-Genie 2, Model G560 | SI-0236 | |
Vacuum concentrator | Scan Speed Maxi Vac Alpha Evaporators | 7.008.500.002 | |
2 ml Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120094 | Used for sample extarction |
1.5 ml Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | Used for fractions |
Shaker | Eppendorf Thermomixer 5436 | 2050-100-05 | |
Sonicator | USC 300 TH | 142-0084 | |
Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf, model 5427R | 22620701 | |
UPLC system | Waters Acquity UPLC system (Waters, Machester, UK) | ||
MS system | Exactive, Orbitrap-type, MS (Exactive, Thermo-Fisher, Bremen, Germany). | ||
Reversed Phase (RP) Bridged Ethyl Hybrid (BEH) C8 column (100 mm×2.1 mm containing 1.7 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186002878 | Analysis of lipids |
RP High Strength Silica (HSS) T3 column (100 mm×2.1 mm containing 1.8 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186003539 | Analysis of metabolites |
Q ExactivePlus high resolution mass spectrometer connected to an EASY-nLC 1000 system | Thermo-Fisher, Bremen, Germany | Analysis of peptides |