Summary
ويرد بروتوكول لاستخراج شامل من الدهون، الأيض والبروتينات من الأنسجة البيولوجية باستخدام عينة واحدة.
Abstract
فهم النظم البيولوجية المعقدة يتطلب قياس وتحليل وتكامل الطبقات المركبة متعددة من الخلية الحية، وعادة ما تحددها ترانسكريبتوميك، البروتين، الأيض والقياسات ليبيدوميك. في هذا البروتوكول، ونحن نقدم طريقة بسيطة لاستخراج استنساخه من الأيض، والدهون والبروتينات من الأنسجة البيولوجية باستخدام قسامة واحدة لكل عينة. ويستند أسلوب الاستخراج على ميثيل ثيرت- بيوتيل الأثير: الميثانول: نظام المياه للسائل: التقسيم السائل من مستقلب مسعور والقطبية إلى مرحلتين غير قابلة للامتزاج جنبا إلى جنب مع هطول الأمطار من البروتينات والجزيئات الأخرى كبيليه الصلبة. ومن ثم، فإن هذه الطريقة توفر ثلاثة أجزاء مختلفة من التركيب الجزيئي المحدد، وهي متوافقة تماما مع تكنولوجيات إنتاجية عالية مشتركة مثل اللوني السائل أو كروماتوغرافيا الغاز (غ) إلى جانب مطياف الكتلة. على الرغم من أن الطريقة كانت البدايةوضعت إيالي لتحليل عينات الأنسجة النباتية المختلفة، وقد ثبت أن تكون متوافقة تماما لاستخراج وتحليل العينات البيولوجية من نظم متنوعة مثل الطحالب والحشرات، والأنسجة الثدييات والثقافات الخلية.
Introduction
وقد تطورت بيولوجيا الأنظمة، التي ظهرت في منتصف القرن الماضي 1 ، وتطورت من قبل التحليل على نطاق واسع من مجموعات البيانات الجينومية و ترانسكريبتوميك 2 ، 3 ، إلى نهج جديد لا غنى عنه لتحليل النظم البيولوجية المعقدة 4 ، 5 . ويتمثل الهدف الرئيسي لبيولوجيا النظم في فك تفاعلات المكونات واعتمادياتها في النظم البيولوجية، وربط الصلة بين الأنماط الجينية، وتحقيقها، والتحولات الجزيئية والنماذج الظاهرية الناتجة. وبناء على ذلك، أصبح إدماج مجموعات البيانات الشاملة، التي تنتجها مختلف المقاربات التحليلية الواسعة النطاق، وهي علم الجينوم، والنسخ الترانسكريبتوميكس، والتمثيل الغذائي، والليبيدات، والبروتيوميات وتحليلها الحاسوبي شرطا أساسيا لوصف وفهم النظم البيولوجية المعقدة.
بس إد على التنوع الكيميائي الضخم وتعقيد المكونات البيولوجية في أي نظام حي، وإنتاج مجموعات البيانات الكبيرة والشاملة "أوميكس" تعتمد بقوة على نوعية طريقة استخراج تطبيقها 9 . بالإضافة إلى جودة طريقة الاستخراج، اقتصاد الطريقة مهم؛ وهذا يعني أنه سيكون من المرغوب فيه الحصول على أكبر قدر ممكن من المعلومات الجزيئية من مدخلات عينة قليلة قدر الإمكان. في كثير من الأحيان يمكن أن تكون مبالغ عينة الحد، وبالتالي فمن المرغوب فيه للغاية لاستخدام طريقة الاستخراج، والتي يمكن أن تستمد العديد من الطبقات الجزيئية من استخراج واحد من عينة معينة. وهذا يعني أنه بدلا من استخدام عدة طرق استخراج متخصصة لاستخراج فئات مركب مختلفة من قسائم عينة مختلفة من العينة نفسها، يتم استخدام طريقة استخراج متتابعة، الذي يجزأ المكونات الجزيئية لقسامة واحدة في كسور الجزيئية المختلفة.
_content "> تستند الطريقة الشائعة المستخدمة في طرق الاستخلاص المجزأة هذه إلى طريقة استخراج الدهون في مرحلتي فولش وآخرون التي تم تطويرها في عام 1957 10. وتستند هذه الطريقة إلى الكلوروفورم: تقطيع الميثانول / الماء من المستقلبات القطبية والمائية، وكان تهدف إلى تنظيف و إزالة عينات معقدة لتحليل الدهون عالية الجودة مع تطور البيولوجيا نظم متعددة اوميك، كان الأسلوب فولش أبعد من ذلك، وتحسين تدريجيا من خلال الاستفادة من ذلك لتقسيم عينة من البروتينات والأيض القطبية والدهون ل والزيوت والسائلة اللوني المستندة إلى الأيض و ليبيديوميكش من المركبات القطبية ومسعور، بالإضافة إلى البروتينات القائمة على اللوني السائل 11 ، 12 ، 13 ، 14. للأسف، كل هذه الأساليب تعتمد على طريقة استخراج الكلوروفورم القائم، والتي ليس فقط يؤدي إلى فو غير مرغوب فيهروماتيون من بيليه البروتين كما إنتيرفاس بين القطبية والدهون المرحلة، ولكن الذي هو أيضا مذيب غير مرغوب فيه من منظور الكيمياء الخضراء 15 ، 16 . ومع ذلك، فإن المذيبات ثالثي بيوتيل الأثير (متب) يتغلب على كل من هذه المشاكل المذكورة أعلاه، وهو بديل مناسب للكلوروفورم. واستنادا إلى هذه المتطلبات، قررنا إنشاء متب: الميثانول: طريقة الاستخلاص القائمة على المياه، والتي تستوفي جميع المواصفات المذكورة أعلاه، وبالتالي فهي بمثابة نقطة انطلاق مثالية لتحليل شامل متعدد الأوميات 16 . هذا البروتوكول يرشد المستخدم خطوة بخطوة من خلال سير العمل بسيطة وسريعة وقابلة للتكرار لإعداد العينة، بما في ذلك استكشاف الأخطاء وإصلاحها من المشاكل التي لوحظت عادة. وعلاوة على ذلك، سوف نقدم بإيجاز البيانات التحليلية النموذجية من فائقة الأداء اللوني السائل الطيف الكتلي (أوبلك-مس) -basعلم الليبيدات، و الأيض و بروتيوميكس التنميط من عينات الأنسجة النباتية. على الرغم من أن الأمثلة المستمدة من 50 ملغ من عينة الأنسجة ورقة أرابيدوبسيس ثاليانا ، وقد تم استخدام هذا البروتوكول لعدة عينات وأنسجة بيولوجية أخرى، بما في ذلك الطحالب 17 ، 18 ، الحشرات 19 وخلايا الثدييات والأعضاء والأنسجة 20 ، 21 ، 22- إن نطاق بروتوكول الاستخراج المقدم هو تقديم وصف واضح وتفصيلي لمعالجة العينات قبل الاستخراج وإجراءات الاستخراج نفسها. على الرغم من أننا نقدم ثلاثة أمثلة وجيزة من التطبيق التحليلي، ويمكن الحصول على معلومات مفصلة حول معالجة البيانات قبل وبعد التحليل من منشوراتنا السابقة 16 ، 23 ، 24 ،
Protocol
تنبيه : الميثانول (ميوه) و ميثيل ترت- بيوتيل الأثير (متب)، المستخدمة أثناء الاستخراج، قابلة للاشتعال، ويمكن أن يكون، على التعرض لفترات طويلة و / أو الاتصال، الجهاز التنفسي، العين أو الجلد تهيج. يرجى التعامل معها بعناية فقط في غطاء الدخان واستخدام إجراءات السلامة المناسبة أثناء الاستخراج (معطف المختبر، نظارات السلامة، والقفازات، وما إلى ذلك ). النيتروجين السائل والجليد الجاف، وتستخدم في عدة خطوات من هذا البروتوكول، يمكن أن يسبب حروق شديدة من قبل ملامسة الجلد لفترة طويلة. يرجى التعامل معها بعناية عن طريق ارتداء القفازات الواقية والنظارات. يمكن للمستخدمين استخدام المواد الكيميائية المختلفة، الكواشف أو المعايير الداخلية لتحليل العينات، وبعضها قد تكون سامة. يرجى فحص صحائف بيانات السلامة الكيميائية ذات الصلة لجميع المواد المستخدمة.
1. جمع وحصاد العينات البيولوجية
- إعداد أنابيب الحصاد المسمى.
ملاحظة: هنا، العينات البيولوجية الحصاد في المسمى، 2 مل، جولة القاع، مكان آمنk أنابيب ميكروسنتريفوج التي تحتوي على اثنين قطرها 5 ملم، كرات معدنية للالخلاط الأنسجة. - إعداد مليئة ديوار النيتروجين السائل.
- حصاد العينة البيولوجية والمفاجئة تجميد الأنسجة في النيتروجين السائل. تنفيذ هذه الخطوة في أسرع وقت ممكن في غضون ثوان قليلة لتجنب التغيرات الأيضية الناجمة عن الجرح.
ملاحظة: لأغراض العرض التوضيحي، استخدم أوراق روزيت من 30 نوعا من البرية من النوع البري أرابيدوبسيس ثاليانا (كول -0 ) نمت على التربة في ظل ظروف يوم طويل. - الحفاظ على العينات المحصودة على الجليد الجاف لفترات قصيرة الأجل أو تخزينها في -80 درجة مئوية لفترات أطول.
2. طحن و انقطاع الأنسجة
- قبل تبريد أصحاب أنبوب من الخالط الأنسجة في النيتروجين السائل لمدة لا تقل عن 10 دقيقة. إذا كان الخالط الأنسجة غير متوفر، واستخدام هاون نظيفة وقبل تبريد والمدقات.
- أخذ عينات من النيتروجين السائل، الجليد الجاف أو -80 درجة مئوية الفريزر ووضعها في قبل تبريدهاأصحاب الأنبوب.
- وضع بسرعة أصحاب أنبوب في الخالط الأنسجة.
- طحن المواد البيولوجية إلى غرامة ومسحوق متجانس. استخدام 20 هرتز لمدة 1 دقيقة للأوراق.
ملحوظة؛ قد تختلف الوقت التجانس وسرعة اعتمادا على الأنسجة، والتأكد من أن العينة المتجانس في مسحوق ناعم وأن يتم الاحتفاظ هذا المسحوق المجمدة في كل خطوة من التجانس. - أخذ العينات البيولوجية من أصحاب أنبوب والاحتفاظ بها المجمدة حتى مزيد من استخراج.
3. وزن الأنسجة
- استخدام التوازن التحليلي مع دقة كافية للمبالغ عينة المطلوبة.
- إعداد المسمى 2 مل جولة أسفل آمنة قفل أنبوب ميكروسنتريفوج.
- قبل تبريد الأنابيب والملاعق في النيتروجين السائل.
- قسامة المبلغ المطلوب من مسحوق الأنسجة في 2 مل آمنة قفل أنبوب ميكروسنتريفوج.
الحذر: تجنب أي إزالة الجليد من المواد النباتية عن طريق التقليل من الوقت الذي يستغرقه لإيغ العينات. - عودة عينات أليكوتد مباشرة بعد وزنها إلى النيتروجين السائل.
- سجل لكل عينة الوزن بالضبط. استخدام 10-50 ملغ ± 10٪ لمعظم الأنسجة النباتية.
- تخزين العينات أليكوتد في -80 درجة مئوية حتى مزيد من استخراج.
4. إعداد كاشف
- استخدام خليط الاستخلاص من ميثيل تيرت- بيوتيل الأثير (متب) / الميثانول (ميوه).
- لإعداد 100 ملغ استخراج المذيبات، إضافة 75 مل من متب إلى 25 مل من ميوه لجعل خليط من متب: ميوه (3: 1، المجلد / المجلد).
- إضافة معايير داخلية للتطبيع بعد التحليل وفقا للاحتياجات التحليلية. عادة، إضافة 50 ميكرولتر من 1،2-diheptadecanoyl- سن -glycero-3-فسفوشولين (1 ملغ / مل في الكلوروفورم) كمعيار داخلي لتحليل الدهون القائم على أوبلك-مس، في حين اضاف 50 ميكرولتر من 13 C السوربيتول ( 1 ملغ / مل في الماء) كمعايير داخلية للتحليل القائم على غ-مس من الابتدائيالأيض. المعايير الداخلية للتحليل المستقلب أوبلك-مس المستندة إلى 50 ميكرولتر من الكورتيزون (1 ملغ / مل في الميثانول) و 25 ميكرولتر من الأمبيسلين (1 ملغ / مل في الميثانول).
- نقل المذيب إلى زجاجة نظيفة التي تم شطف مع متب: ميوه خليط.
- تخزين خليط استخراج لمدة تصل إلى 1 أسبوع في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: لا تخزن خليط الاستخراج لفترات أطول للحفاظ على نتائج استنساخه.
- للحث على فصل المرحلة، واستخدام المياه (H 2 O) / الميثانول (ميوه).
- لإعداد 100 مل H 2 O: ميوه، إضافة 75 مل من H 2 O إلى 25 مل من ميوه لجعل H 2 O: ميوه (3: 1، المجلد / المجلد).
- نقل المذيب إلى زجاجة نظيفة التي تم شطف مع H 2 O: ميوه خليط. يمكن تخزين هذا المذيبات لعدة أسابيع في درجة حرارة الغرفة.
5. استخراج العينات
- قبل تبريد استخراج m(متب: ميوه، 3: 1، فول / فول) إلى -20 درجة مئوية باستخدام نظام التبريد السائل أو الفريزر -20 درجة مئوية.
- إخراج عينات أليكوتد واحدا تلو الآخر وإضافة 1 مل من خليط استخراج قبل تبريد لكل أنبوب العينة. تنبيه: تنفيذ هذه الخطوة بسرعة بسبب اللزوجة المنخفضة من متب.
- مزيج فورا على دوامة خلاط حتى الأنسجة متجانسة بشكل جيد داخل خليط الاستخراج.
ملاحظة: هذه الخطوة مهمة جدا، لأنه مطلوب لترسيب البروتينات وتعطل أنشطتها الأنزيمية. - احتضان جميع العينات على شاكر المداري في 100 دورة في الدقيقة لمدة 45 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- يصوتن العينات لمدة 15 دقيقة في حمام سونيكيشن تبريد الجليد.
6. تجزئة بواسطة فصل المرحلة
- إضافة 650 ميكرولتر من H 2 O: ميوه (3: 1، المجلد / المجلد) لكل أنبوب العينة.
- مزيج جيدا من فورتيكسينغ لمدة 1 دقيقة.
- أجهزة الطرد المركزي العينات بسرعة 20،000 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: بعد هذه الخطوة، وهناك نوعان من مراحل السائل غير قابلة للامتزاج مع بيليه الصلبة في الجزء السفلي من الأنبوب.
الحذر: التعامل مع أنابيب بعناية لتجنب خلط اثنين من مراحل السائل وتجنب تعطيل بيليه عجلت.
7. أليكوتينغ من الكسور القطبية ومسعور
- نقل 500 ميكرولتر من المذيبات من الجزء العلوي، التي تحتوي على الدهون، المرحلة إلى المسمى أنبوب ميكروسنتريفوج 1.5 مل.
ملاحظة: يمكن أن تتركز عينات الدهون أليكوتد مباشرة لتحليل أوبلك-مس فوري (الخطوة 8.1) أو تخزينها لعدة أسابيع في -80 درجة مئوية. - وبمجرد إزالة 500 ميكرولتر من العينة، وإزالة مرحلة الدهون المتبقية باستخدام ماصة 200 ميكرولتر.
- نقل 400 ميكرولتر من المذيب من المرحلة السفلى (الأيض القطبية وشبه القطبية) في أنبوب المسمى ميكروسنتريفوج 1.5 مل. يمكن أن تتركز عينات القطبية أليكوتد مباشرة لتحليل أوبلك-مس فوري (الخطوة 8.2) أو تخزين فوص عدة أسابيع في -80 درجة مئوية.
- خذ قسامة إضافية من 200 ميكرولتر لإجراء تحليل إضافي، على سبيل المثال تحليل مستقلب الغاز المستندة إلى اللوني كما هو موضح الثمينة 16 .
- إزالة ما تبقى من المرحلة المائية التي بيبتينغ قبالة حجم الزائد.
- غسل البروتين التي تم الحصول عليها، والنشا، بيليه جدار الخلية مع ميثانول 500 ميكرولتر من قبل فورتيكسينغ تماما لمدة 1 دقيقة.
- الطرد المركزي العينات بسرعة 10،000 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
- أداء استخراج البروتين والهضم (الخطوة 11) أو النشا / تحليل جدار الخلية كما هو موضح سابقا 16 .
ملاحظة: إذا لم تستخدم على الفور، يمكن تخزين هذه الكريات لعدة أسابيع في -80 درجة مئوية.
8. تركيز وتخزين الكسور
- تتبخر المذيبات من عينات الدهون (من الخطوة 7.1) إما في مكثف فراغ دون تسخين (لمدة 1-2 ساعات) أو يفضل استخدام نترأوجين تدفق المبخر لتجنب التعديلات الأكسدة من الدهون.
ملاحظة: يجب تحليل العينات المجففة فورا. للتخزين، وترك عينات في محلول متب، من الناحية المثالية في قارورة زجاجية (الخطوة 7.1). - تتبخر المذيب من العينات المائية (من الخطوة 7.3 أو 7.4) بين عشية وضحاها في فراغ المكثف دون التدفئة. ملاحظة: يمكن تخزين العينات المجففة لعدة أسابيع في -80 درجة مئوية قبل التحليل.
9. تحليل الدهون باستخدام أوبلك-مس 24
- إعادة تعليق الكسور الدهنية المجففة (من الخطوة 8.1) في 400 ميكرولتر من الأسيتونتريل: 2-بروبانول (7: 3، المجلد / المجلد).
- نقل السائل الكافي إلى قارورة زجاجية وغطاء بإحكام.
- وضع قارورة الزجاج في أوتوسامبلر تبريد (4 درجة مئوية).
- حقن 2 ميكرولتر لكل عينة وفصل الدهون على عكسي المرحلة (رب) C 8 العمود الذي عقد في 60 درجة مئوية باستخدام نظام أوبلك قيد التشغيل بمعدل تدفق 400 ميكرولتر / دقيقة.
- استخدام المحمولالمراحل الموصوفة في الجدول 1 للفصل الكروماتوغرافي.
- الحصول على أطياف الكتلة في وضع التأين الإيجابية والسلبية باستخدام أداة مس مناسبة تغطي مجموعة واسعة بين 150 و 1،500 م / ض.
10. تحليل المستقلبات القطبية وشبه القطبية باستخدام أوبلك-مس 25 .
- إعادة تعليق المرحلة القطبية (من الخطوة 8.2) في 200 ميكرولتر أوبلك الصف الميثانول: المياه (1: 1، المجلد / المجلد).
- نقل السائل الكافي إلى قارورة زجاجية وغطاء بإحكام.
- وضع قارورة الزجاج في أوتوسامبلر تبريد (4 درجة مئوية).
- حقن 2 ميكرولتر من كل عينة وفصل الأيضات على عمود رب C 18 الذي عقد في 40 درجة مئوية باستخدام نظام أوبلك قيد التشغيل بمعدل تدفق 400 ميكرولتر / دقيقة.
- استخدام مراحل المحمول للفصل الكروماتوغرافي مع المعلمات الواردة في الجدول 2 .
- الحصول على كامل أطياف المسح الضوئي الشامل في وضع التأين الإيجابية والسلبية لنافي مطياف الكتلة المناسب الذي يغطي نطاقا يتراوح بين 50 و 1500 م / ض.
11. استخراج البروتين والهضم والتحليل 16
- إعادة تعليق غسلها البروتين / النشا / خلية بيليه الجدار (من الخطوة 7.8) في 200 ميكرولتر من العازلة استخراج البروتين من الاختيار. ملاحظة: نحن نستخدم اليوريا / ثيوريا العازلة (5 M اليوريا، 2 ملي ثيوريا، 15 ملي دت، 2٪ تشابس والبروتياز ومثبطات الفوسفاتيز) 27 .
- يصوتن العينات لمدة 10 دقيقة في حمام سونيك تبريد الجليد.
- احتضان عينات لمدة 30 دقيقة على شاكر المداري (100 دورة في الدقيقة) في درجة حرارة الغرفة.
- الطرد المركزي البروتينات الذائبة في 10،000 × ز لمدة 5 دقائق.
- جمع طاف البروتين في أنبوب جديد.
- تحديد تركيز البروتين من طاف التي تم جمعها 28 .
- هضم 50 ميكروغرام من البروتين في حل مع بروتوكول الاختيار. عادة، استخدم التربسين / ليس-C مزيج أكوردينغ إلى دليل التعليمات.
- بعد الهضم، أداء تحلية الببتيدات قبل الطيف الكتلي باستخدام C 18 نصائح المرحلة وأزل الببتيدات هضمها 29 .
- ركز العينات إلى جفاف قريب في مكثف فراغ دون تسخين.
- إعادة تعليق العينات في العازلة التحميل المناسبة (على سبيل المثال 5٪ أسيتونتريل، 0.5٪ حمض الفورميك) وتحليل مخاليط الببتيد بواسطة لك-مس / مس باستخدام مطياف الكتلة عالية الدقة متصلة بنظام نانو لك.
ملاحظة: في مجموعة البيانات بروتيوميكس النموذجية المعروضة في هذا البروتوكول، استخدمنا التدرج كما هو موضح في الجدول 3 . - تعيين مطياف الكتلة، وذلك باستخدام أعلى 15 استراتيجية، حيث أعقبت واحدة مسح كامل (فس) من قبل ما يصل إلى 15 بيانات تعتمد مس / مس المسح الضوئي، إلى المعلمات التالية: كان فس في نطاق واسع 200-2000 م / ض في وهو قرار من 70،000 مع قيمة مستهدفة 3X10 6 أيونات. الحصول على البيانات التي تعتمد على البيانات مس / مس بالاشعة العليارجي التفكك الاصطدام (هد). تعيين القيم المستهدفة لل مس / مس إلى 1e 5 أيونات، مع الوقت ملء أيون القصوى من 50 مللي ثانية، نافذة عزل 4.0 م / ض، والطاقة الاصطدام تطبيع (نس) من 30٪ ونسبة وندرفيل 1٪. قياس أيونات مس / مس في قرار 17.500 واستبعد دينامية إلى 60 ثانية.
Representative Results
مجموعات البيانات الشاملة متعددة اوميس لا تقدر بثمن لفهم النظم البيولوجية المعقدة. وعادة ما تبدأ استراتيجية التجربة البيولوجية الناجحة من تصميم تجريبي ذي مغزى، وتجربة إعداد وأداء، تليها جمع العينات، والاستخراج، والحصول على البيانات التحليلية، ومعالجة البيانات الخام، وتحليل البيانات الإحصائية، وتحديد الأيض ذات الصلة وتفسير البيانات البيولوجية بما في ذلك رسم الخرائط المسار والتصور ( الشكل 1 ).
في بروتوكول استخراج قدم هنا، ونحن نركز على عينة جمع، -handling و- خطوات الاستخراج، والتي يتم وصفها في نظرة عامة مفصلة سير العمل في الشكل 2 . لأغراض العرض التوضيحي، تم اختيار 50 ملغ من الأنسجة ورقة أرابيدوبسيس. تم حصاد هذه المواد، الأرض واستخراجها قبل إخضاعها إلى ثلاثةومنصات تحليلية أوبلك-مس المثالية، وتوفير البيانات التي يمكن استخدامها ل ليبيدوميك المستهدفة وغير مستهدفة، تحليل ميتابولوميك والبروتين. يتضمن الشكلان 2 و 6 بالإضافة إلى ذلك صور تمثيلية للكيفية التي ينبغي أن يبدو بها المذيب المستخلص، في الظروف العادية. بالإضافة إلى ذلك، وترد أمثلة من العينات التي تحتوي على كميات مفرطة من الجزيئات عجلت (البروتينات والنشا) والعينات مع غير لائق عينة التجانس ( الشكل 3 ). وقد تم عرض تحري الخلل وإصلاحه لهذين المشكلتين بشكل موجز في الشكل (3)، إلا أنه نوقش أيضا بمزيد من التفصيل في نشرتنا السابقة 16 .
الأشكال 4 و 5 الخطوط العريضة أمثلة من ثلاثة كروماتوغرام تحليلية المستمدة من الدهون، القطبية / سيمنواتج الأيض القطبية وتحليلات البروتين. الدهون، والتي تم اتخاذها من المرحلة متب العليا ( الشكل 2 )، تم تحليلها من قبل عكس المرحلة (رب) C 8 فائقة الأداء اللوني السائل إلى جانب عالية الدقة مطياف الكتلة. يمكن الحصول على الدهون باستخدام وسائط التأين مس الإيجابية والسلبية ( الشكل 4 ، الجزء العلوي) 16 ، 24 .
تم تحليل المستقلبات الأولية والثانوية القطبية وشبه القطبية من القطبية (المياه / الميثانول) المرحلة ( الشكل 2 ) من خلال عكس المرحلة (رب) C 18 أوبلك-مس 25 . الأسلوب المصور، باستخدام اللوني المرحلة عكس، هو متوافق للغاية لتحليل الأيض شبه القطبية (وهي الأيض من الأيض الثانوي النبات)، والتي يمكن تحليلها باستخدام وسائط التأين الإيجابية والسلبية في مس( الشكل 4 ، الجزء السفلي) 16 . ويمكن تحليل المزيد من الأيضات المائية من هذا الجزء (السكريات والأحماض الأمينية القطبية وغيرها)، والتي لا تظهر الاحتفاظ الجيد على المواد المرحلة عكسها من خلال أساليب تحليلية أخرى مثل غ-مس 16 أو اللوني السائل التفاعل اللوني 30 .
البروتينات، التي تم استرجاعها من بيليه الصلبة في الجزء السفلي من أنبوب استخراج ( الشكل 2 )، كانت في حل هضمها وتحليلها باستخدام بندقية النار لك-مس ( الشكل 5 )، في حين أن بروتوكول لاستخراج النشا وجدار الخلية يمكن الحصول على المواد من بروتوكول نشرنا سابقا 16 .
وباختصار، فإن أكثر من 200 نوع الدهون، 50 مشروح الأيض شبه القطبية وعدة آلاف بروتينس يمكن تحديدها بشكل روتيني من عينات من النوع المستخدم في مثالنا. بالإضافة إلى ذلك، أظهرت طريقة تطبيق واسع باستخدام الأنسجة المختلفة، والأعضاء والمواد خلية الثقافة ( الشكل 6 ).
الشكل 1: سير العمل العام لتحليل أوميكس غير المستهدف على نطاق واسع. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 : إعداد العينة واستخراج سير العمل لتحليل الدهون، الأيض والبروتينات من قسامة واحدة من عينة البيولوجية.الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3 : أمثلة توضيحية للمشكلات الشائعة الملاحظة باستخدام بروتوكولات استخراج التقسيم ذات مرحلتين. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4 : كروماتوغرامز الممثل من الدهون و الأقطاب شبه القطبية من أرابيدوبسيس ثاليانا أوراق مقتطفات. قاعدة الكروماتوغرام الذروةثانية من الدهون (الجزء العلوي) ونواتج الأيض شبه القطبية (الجزء السفلي) تحليلها في وضع التأين إيجابي 16 . الرسوم البيانية الدائرية في الزاوية اليمنى العليا من كل اللوني يبين عدد الدهون المحددة والأيض المخصصة لفئات الكيميائية المختلفة. تشل، الكلوروفيلز؛ داغ، داسيلغليسريد؛ دغد، ديغالاكتوسيلدياسيلجليسيرول. فا، الأحماض الدهنية. ليسوك، ليسوفوسفاتيديلكولين. مغدغ، مونوغالاكتوسيلدياسيلجليسيرول؛ بيسي، فوسفاتيديلكولين؛ بي، فسفاتيديل إيثانولامين؛ بغ، فسفاتيديل غليسيرول؛ بي، فسفاتيديلينوسيتول؛ بس، فسفاتيديل. سب، سفينغوليبيد؛ سدغ، سلفوكينوفوسيلدياسيلجليسيرول. تاج، ثلاثي الشحوم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5
ويبين الرسم البياني الدائري في الزاوية اليمنى العليا يشير إلى عدد من البروتينات المحددة المخصصة لعمليات بيولوجية مختلفة 16 . الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6 : أمثلة استخراج الممثل من أنواع الأنسجة المختلفة من البرية نوع أرابيدوبسيس ثاليانا .
تم استخراج جميع العينات باستخدام 50 مجم من الوزن الطازج من الأنسجة المشار إليها."> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| الوقت (بالدقائق) | ٪ المخزن المؤقت A إلى المخزن المؤقت B | |
| 0 إلى 1 دقيقة | 45٪ أ | العازلة a: 1٪ 1m NH4-- خلات، 0.1٪ حمض الخليك في أوبلك مس الصف المياه |
| 1 إلى 4 دقائق | الخطي التدرج من 45٪ A إلى 25٪ A | العازلة B: 1٪ 1M NH4 خلات، 0.1٪ حمض الخليك في أسيتونيتريل / الأيزوبروبانول 7: 3، (v: V) |
| 4 إلى 12 دقيقة | الخطي التدرج من 25٪ A إلى 11٪ A | معدل التدفق 400 ميكرولتر / دقيقة |
| 12 إلى 15 دقيقة | الخطي التدرج من 11٪ A إلى 0٪ A | حجم حقن 2 ميكرولتر |
| 15 إلى 19.5 دقيقة | غسل العمود لمدة 4.5 دقيقة مع 0٪ A | |
| عد إلى 45٪ أ | ||
| 19،51 إلى 24 دقيقة | تتوازن مع 45٪ a |
الجدول 1: معلمات التدرج ل رب-أوبلك فصل الدهون. رب، عكس المرحلة. أوبلك، فائقة الأداء اللوني السائل.
| الوقت (بالدقائق) | ٪ المخزن المؤقت A إلى المخزن المؤقت B | |
| 0 إلى 1 دقيقة | 99٪ أ | العازلة A: 0.1٪ حمض الفورميك في المياه الصف أوبلك |
| 1 إلى 11 دقيقة | الخطي التدرج من 99٪ A إلى 60٪ A | العازلة B: 0.1٪ حمض الفورميك في أوبلك غراد أسيتونتريل |
| 11 إلى 13 دقيقة | الخطي التدرج من 60٪ A إلى 30٪ A | معدل التدفق 4001؛ L / دقيقة |
| 13 إلى 15 دقيقة | الخطي التدرج من 30٪ A إلى 1٪ A | حجم حقن 2 ميكرولتر |
| 15 إلى 16 دقيقة | غسل العمود لمدة 1 دقيقة مع 1٪ A | |
| 16 إلى 17 دقيقة | الخطي التدرج from1٪ A إلى 99٪ A | |
| 17 إلى 20 دقيقة | تتوازن لمدة 3 دقائق في 99٪ A |
الجدول 2: معلمات التدرج ل رب-أوبلك فصل الأيض القطبية وشبه القطبية. رب، عكس المرحلة. أوبلك، فائقة الأداء اللوني السائل.
| الوقت (بالدقائق) | ٪ المخزن المؤقت B إلى المخزن المؤقت A | |
| 0 إلى 5 دقائق | التدرج الخطي من 0 إلى 10٪ | العازلة A: 0.1٪ حمض الفورميك في المياه الصف أوبلك |
| 5 إلى 80 دقيقة | الخطي التدرج من 10٪ إلى 40٪ | العازلة ب: 0.1٪ حمض الفورميك في 60٪ أوبلك الصف أسيتونتريل |
| 80 إلى 85 دقيقة | الخطي التدرج من 40٪ إلى 60٪ | معدل التدفق 300 نل / دقيقة |
| 85 إلى 86 دقيقة | التدرج الخطي من 60٪ إلى 95٪ | حجم حقن 5 ميكرولتر |
| 86 إلى 91 دقيقة | غسل العمود لمدة 5 دقائق مع 95٪ | |
| 91 إلى 92 دقيقة | الخطي التدرج من 95٪ إلى 0٪ | |
| 93 إلى 110 دقيقة | موازنة العمود لمدة 17 دقيقة عند 0٪ |
الجدول 3: معلمات التدرج ل نانو-لك فصل الببتيدات. لك، اللوني السائل.
Discussion
في هذه المقالة، ونحن تصف وتوضيح بروتوكول استخراج بسيطة ومتطورة للغاية ل ليبيدوميك شامل، ميتابولوميك وتحليل البروتين من عينة واحدة 50 ملغ ورقة. وقد استخدمت هذه الطريقة سابقا في العديد من الدراسات التي نشرت في مواد متنوعة 17 و 18 و 19 و 20 و 21 و 22 و 23 و 24 و 25 و 26 و 31 و 32 و 33 و 34 و 35 و 36 و 37 وثبت، بالإضافة إلى مباشرة إلى الأماموسير العمل وتطبيق عالية لتكون قوية وقابلة للتكرار.
وتظهر التطبيقات المقدمة هنا بعض الطرق الروتينية للفحص الأولي لعينة بيولوجية معقدة. هذه مجموعات بيانات ميتابولوميك و ليبيدوميك على نطاق واسع يمكن أن توفر معلومات شاملة عن التغيرات واسعة أو محددة في عملية التمثيل الغذائي للنظام البيولوجي تحليلها، في حين أن البيانات التي تم الحصول عليها من تحليل البروتينات، ويقدم نظرة ثاقبة في الكمية (وفرة) والنوعية (التعديلات ) التغيرات في الإنزيمات والبروتينات الهيكلية أو عوامل النسخ (تفس) التي تتحكم في الوظائف الخلوية والآلات. وبناء على ذلك، فإن البيانات التكاملية أوميكس لديها القدرة على الكشف عن المعلومات الأولية عن التغيرات المحتملة الناجمة عن الاضطرابات الجينية أو الحيوية و / أو غير الحيوية للنظام البيولوجي، من خلال توضيح التغيرات الجزيئية للجزيئات المتنوعة المرتبطة مسارات الأيض محددة أو العمليات الخلوية.
بالتاكيد، على المدى الطويل، فمن الضروري جدا، لتحليل ناجح لعلم الأحياء النظم، لتحقيق أقصى قدر من عدد من الكيانات الجزيئية تحليلها والمشروح، والسماح لرصد الوظائف الخلوية والأنشطة بقدر الإمكان. لهذا الغرض، يمكن تطبيق الكسور التي تم الحصول عليها بالإضافة إلى أساليب تحليلية متنوعة، واستهداف المزيد من المركبات أو الطبقات المركبة ( الشكل 4 ).
وقد قلت هذا، لا بد من الإشارة إلى أن استراتيجية التحليل العالمي للبيانات التي تم الحصول عليها يمكن أن تكون متبعة من قبل اثنين من استراتيجيات مختلفة: من ناحية، ونحن قد تم التأكيد على توضيح الوظائف الخلوية عن طريق القياس الكمي للمركبات المعروفة. من ناحية أخرى، العديد من الأيض المقاسة والدهون ليست معروفة بعد أو المشروح. ومع ذلك، فإن قياسات المركب غير المشروح تحتوي أيضا على الكثير من المعلومات المفيدة، التي يمكن استخدامها من خلال الأساليب الإحصائية للتصنيف أو التمييز ببين المجموعات أو العلاجات 20 ، 21 ، 22 .
ومع ذلك، لا بد من تحديد هذه المركبات غير المعروفة، لا سيما تلك المتعلقة بتصنيف المجموعة أو التي تعمل كعلامات حيوية. ومن المؤسف أن عملية تحديد الهوية هذه مملة للغاية ولا يمكن تحقيقها بدون قياسات أو استراتيجيات تحليلية إضافية 38 . وكما يتضح من الشكل 4 ، فإن عدد المركبات غير المشروحة مرتفع جدا (في الواقع الغالبية العظمى). ومع ذلك، وكما ذكر أعلاه، يمكن التعامل مع هذه القمم الكروماتوغرافية ضمن تحليل البيانات وبالتالي يمكن التأثير بشكل كبير على الكيانات المتأثرة وخضوعها لمزيد من استراتيجيات تحديد الهوية.
باختصار، يمكننا أن نخلص إلى أن بروتوكول هنا قدم يوفر العديد من المزايا لبيولوجيا النظم التجريبية وكذلك لتطبيق الإحصائي الكلاسيكيبالجمع.
أولا، حيث يتم استخراج جميع الكسور من عينة واحدة، والتغير بين مجموعات البيانات التجريبية المختلفة (الدهون، الأيض والبروتينات) بشكل ملحوظ منذ كل مجموعة البيانات مشتق من نفس قسامة العينة. وهذا يؤدي بوضوح إلى زيادة قابلية المقارنة للنتائج التي تم الحصول عليها.
ثانيا، طريقة قابلة للتطوير بسهولة ويجعلها متوافقة للغاية مع كميات عينة صغيرة إلى كبيرة. نحن نستخدم بشكل روتيني 10-100 ملغ من عينات الأنسجة، ولكن أجريت دراسات ليبيدوميك ناجحة أيضا على ما لا يقل عن 20 بذور أرابيدوبسيس 31 . خصوصا التوافق مع كميات عينة صغيرة يجعل هذه الطريقة قابلة للتطبيق إذا كميات محدودة من الأنسجة البيولوجية أو العينات المتاحة. ومع ذلك، حتى إذا كانت عينة كافية من المواد المتاحة، الطريقة المعروضة هنا يوفر ميزة الاستفادة من هذه العينات في عدد أكبر من مكررات تجريبية بدلا من شالغناء لهم إجراءات استخراج مختلفة. وهذا يسمح بتحليل بيانات إحصائية أفضل وصقل.
ثالثا، نظرا لأن الطريقة تقوم على تجزئة السائل السائل من الجزيئات القطبية وغير القطبية، فإنه يوفر، على النقيض من أساليب بسيطة على مرحلة واحدة استخراج ( مثل استخراج الميثانول) خطوة كبيرة دي تعقيد في الإجراء. هذه العينة كفاءة إزالة تعقيد يؤدي إلى تنقية جزئية من الكسور الفردية بسبب فصل الجزيئات المسببة كيميائيا من بعضها البعض. وبناء على ذلك، فإن عملية التقسيم الكيميائي لا توفر فقط ميزة عملية للتقسيم المنهجي للعينات المستخلصة في فئات كيميائية مختلفة، بل تحسن أيضا القياسات التحليلية الفردية، لأنها تزيل المركبات الملوثة من الكسور المختلفة. من الواضح، يمكننا أن نلاحظ أن خصوصا الدهون، والتي يتم تقسيمها إلى المرحلة العضوية والتي عادة ما تؤثر سلبا علىالتحليل الكروماتوغرافي للمركبات القطبية، سيكون غائبا تماما تقريبا من الجزء القطبي. وينطبق الشيء نفسه على تحليل الدهون مسعور، والتي سيتم استنفاد المركبات القطبية. إلى جانب تنقية المركبات القطبية وغير القطبية من بعضها البعض، ونحن استنفاد وجمع البروتينات وغيرها من الجزيئات الكلية من العينة، والتي لا توفر سوى جزء منفصل، والتي يمكن استخدامها للبروتين والنشا وتحليل جدار الخلية 16 ، ولكن أيضا يؤدي إلى عينة أنظف داخل الكسور الفردية. هذا هو أهمية خاصة، لأنه من المعروف أن وجود جزيئات كبيرة، يؤدي إلى تلف أو على الأقل أقصر عمر الأعمدة التحليلية.
وأخيرا وليس آخرا، فإن طريقة استخراج متب المذكورة، والتي تعتمد على أقل خطورة وأكثر ملاءمة المذيب استبدال الكلوروفورم 15 ، وقد أظهرت بالفعل من قبل العديد من الدراسات من مجموعتنا، لتكون على نطاق واسع أبلإيكابيليتي للعينات البيولوجية المختلفة من النباتات 16 ، الطحالب 17 ، 18 ، الذباب 19 ولكن أيضا العديد من الأنسجة الثدييات، أعضاء أو خلايا 20 ، 21 ، 22 .
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف
Acknowledgments
مس معتمدة من قبل منحة الدكتوراه كاملة من برنامج جيرلس-داد. نود أن نشكر الدكتور أندرو ويسنيوسكي لإثبات القراءة والتعليق على المخطوطة. ونحن ممتنون جدا لجميع أعضاء مختبر جيافاليسكو في معهد ماكس بلانك الفسيولوجيا النباتية الجزيئية، غولم، ألمانيا لمساعدتهم.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and standards | |||
| Ampicillin | Sigma Aldrich | A9393-5G | Internal standard for metabolites |
| Corticosterone | Sigma Aldrich | 27840-500MG | Internal standard for metabolites, HPLC grade |
| 13C Sorbitol | Sigma Aldrich | 605514 | Internal standard for metabolites, ISOTEC® Stable Isotopes |
| 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (17:0 PC) | Avanti Polar Lipids | 850360P | Internal standard for lipids |
| Methanol (MeOH) | Biosolve Chemicals | 13684102 | ULC-MS grade |
| Water | Biosolve Chemicals | 23214102 | ULC-MS grade |
| Methyl tert-butyl ether (MTBE) | Biosolve Chemicals | 13890602 | HPLC grade |
| Trypsin/Lys-C mix | Promega | V5072 | Enzymatic digestion of proteins |
| Equipment | |||
| Balance | Sartorius Corporation | 14 557 572 | |
| Tissue grinding mixer mill | Retsch, Mixer Mill MM 300 | 20.746.0001 | |
| Mortar and pestle | Sigma Aldrich | Z247464-1EA | |
| Vortex mixer | Vortex-Genie 2, Model G560 | SI-0236 | |
| Vacuum concentrator | Scan Speed Maxi Vac Alpha Evaporators | 7.008.500.002 | |
| 2 mL Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120094 | Used for sample extarction |
| 1.5 mL Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | Used for fractions |
| Shaker | Eppendorf Thermomixer 5436 | 2050-100-05 | |
| Sonicator | USC 300 TH | 142-0084 | |
| Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf, model 5427R | 22620701 | |
| UPLC system | Waters Acquity UPLC system (Waters, Machester, UK) | ||
| MS system | Exactive, Orbitrap-type, MS (Exactive, Thermo-Fisher, Bremen, Germany). | ||
| Reversed Phase (RP) Bridged Ethyl Hybrid (BEH) C8 column (100 mm × 2.1 mm containing 1.7 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186002878 | Analysis of lipids |
| RP High Strength Silica (HSS) T3 column (100 mm × 2.1 mm containing 1.8 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186003539 | Analysis of metabolites |
| Q ExactivePlus high resolution mass spectrometer connected to an EASY-nLC 1000 system | Thermo-Fisher, Bremen, Germany | Analysis of peptides |
References
- Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve. J Physiol. 117 (4), 500-544 (1952).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Yang, M. Q., et al. The emerging genomics and systems biology research lead to systems genomics studies. BMC Genomics. 15, Suppl 11 1 (2014).
- Sheth, B. P., Thaker, V. S. Plant systems biology: insights, advances and challenges. Planta. 240 (1), 33-54 (2014).
- Ideker, T., Galitski, T., Hood, L. A new approach to decoding life: Systems biology. Annu Rev Genom Hum G. 2, 343-372 (2001).
- Somvanshi, P. R., Venkatesh, K. V. A conceptual review on systems biology in health and diseases: from biological networks to modern therapeutics. Syst Synth Biol. 8 (1), 99-116 (2014).
- Oliver, S. G., Winson, M. K., Kell, D. B., Baganz, F. Systematic functional analysis of the yeast genome. Trends Biotechnol. 16 (9), 373-378 (1998).
- Tweeddale, H., Notley-McRobb, L., Ferenci, T. Effect of slow growth on metabolism of Escherichia coli, as revealed by global metabolite pool ("metabolome") analysis. J Bacteriol. 180 (19), 5109-5116 (1998).
- Kim, H. K., Verpoorte, R. Sample preparation for plant metabolomics. Phytochemical analysis : PCA. 21 (1), 4-13 (2010).
- Folch, J., Lees, M., Stanley, G. H. S. A Simple Method for the Isolation and Purification of Total Lipides from Animal Tissues. J Biol Chem. 226 (1), 497-509 (1957).
- Weckwerth, W., Wenzel, K., Fiehn, O. Process for the integrated extraction, identification and quantification of metabolites, proteins and RNA to reveal their co-regulation in biochemical networks. Proteomics. 4 (1), 78-83 (2004).
- Wienkoop, S., et al. Integration of metabolomic and proteomic phenotypes: analysis of data covariance dissects starch and RFO metabolism from low and high temperature compensation response in Arabidopsis thaliana. Mol Cell Proteomics. 7 (9), 1725-1736 (2008).
- Valledor, L., et al. A universal protocol for the combined isolation of metabolites, DNA, long RNAs, small RNAs, and proteins from plants and microorganisms. Plant J. 79 (1), 173-180 (2014).
- Nakayasu, E. S., et al. MPLEx: a Robust and Universal Protocol for Single-Sample Integrative Proteomic, Metabolomic, and Lipidomic Analyses. mSystems. 1 (3), (2016).
- Alfonsi, K., et al. Green chemistry tools to influence a medicinal chemistry and research chemistry based organisation. Green Chem. 10 (1), 31-36 (2008).
- Salem, M. A., Juppner, J., Bajdzienko, K., Giavalisco, P. Protocol: a fast, comprehensive and reproducible one-step extraction method for the rapid preparation of polar and semi-polar metabolites, lipids, proteins, starch and cell wall polymers from a single sample. Plant Methods. 12, 45 (2016).
- Hemme, D., et al. Systems-wide analysis of acclimation responses to long-term heat stress and recovery in the photosynthetic model organism Chlamydomonas reinhardtii. Plant Cell. 26 (11), 4270-4297 (2014).
- Sharma, D. K., et al. UPLC-MS analysis of Chlamydomonas reinhardtii and Scenedesmus obliquus lipid extracts and their possible metabolic roles. J Appl Phycol. 27 (3), 1149-1159 (2015).
- Delgado, R., Munoz, Y., Pena-Cortes, H., Giavalisco, P., Bacigalupo, J. Diacylglycerol activates the light-dependent channel TRP in the photosensitive microvilli of Drosophila melanogaster photoreceptors. J Neurosci. 34 (19), 6679-6686 (2014).
- Bozek, K., et al. Organization and evolution of brain lipidome revealed by large-scale analysis of human, chimpanzee, macaque, and mouse tissues. Neuron. 85 (4), 695-702 (2015).
- Khrameeva, E. E., et al. Neanderthal ancestry drives evolution of lipid catabolism in contemporary Europeans. Nat Commun. 5, 3584 (2014).
- Bozek, K., et al. Exceptional evolutionary divergence of human muscle and brain metabolomes parallels human cognitive and physical uniqueness. PLoS Biol. 12 (5), 1001871 (2014).
- Krueger, S., Steinhauser, D., Lisec, J., Giavalisco, P. Analysis of subcellular metabolite distributions within Arabidopsis thaliana leaf tissue: a primer for subcellular metabolomics. Methods Mol Biol. 1062, 575-596 (2014).
- Hummel, J., et al. Ultra performance liquid chromatography and high resolution mass spectrometry for the analysis of plant lipids. FrontPlant Sci. 2, 54 (2011).
- Giavalisco, P., et al. Elemental formula annotation of polar and lipophilic metabolites using (13) C, (15) N and (34) S isotope labelling, in combination with high-resolution mass spectrometry. Plant J. 68 (2), 364-376 (2011).
- Caldana, C., et al. Systemic analysis of inducible target of rapamycin mutants reveal a general metabolic switch controlling growth in Arabidopsis thaliana. Plant J. 73 (6), 897-909 (2013).
- Giavalisco, P., et al. Proteome analysis of Arabidopsis thaliana by two-dimensional gel electrophoresis and matrix-assisted laser desorption/ionisation-time of flight mass spectrometry. Proteomics. 5 (7), 1902-1913 (2005).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
- Spagou, K., et al. Hydrophilic interaction chromatography coupled to MS for metabonomic/metabolomic studies. J Sep Sci. 33 (6-7), 716-727 (2010).
- Hauck, O. K., et al. Uric acid accumulation in an Arabidopsis urate oxidase mutant impairs seedling establishment by blocking peroxisome maintenance. Plant Cell. 26 (7), 3090-3100 (2014).
- Avin-Wittenberg, T., et al. Global analysis of the role of autophagy in cellular metabolism and energy homeostasis in Arabidopsis seedlings under carbon starvation. Plant Cell. 27 (2), 306-322 (2015).
- Watanabe, M., et al. Comprehensive dissection of spatiotemporal metabolic shifts in primary, secondary, and lipid metabolism during developmental senescence in Arabidopsis. Plant physiol. 162 (3), 1290-1310 (2013).
- Lambers, H., et al. Proteaceae from severely phosphorus-impoverished soils extensively replace phospholipids with galactolipids and sulfolipids during leaf development to achieve a high photosynthetic phosphorus-use-efficiency. New Phytol. 196 (4), 1098-1108 (2012).
- Degenkolbe, T., et al. Differential remodeling of the lipidome during cold acclimation in natural accessions of Arabidopsis thaliana. Plant J. 70, 972-982 (2012).
- Bromke, M. A., et al. Liquid chromatography high-resolution mass spectrometry for fatty acid profiling. Plant J. 81 (3), 529-536 (2015).
- Li, N., et al. FAX1, a novel membrane protein mediating plastid fatty acid export. PLoS Biol. 13 (2), 1002053 (2015).
- Kueger, S., Steinhauser, D., Willmitzer, L., Giavalisco, P. High-resolution plant metabolomics: from mass spectral features to metabolites and from whole-cell analysis to subcellular metabolite distributions. Plant J. 70 (1), 39-50 (2012).
