Viene presentato un protocollo per l'estrazione totale dei lipidi, dei metaboliti e delle proteine dai tessuti biologici utilizzando un campione.
La comprensione di sistemi biologici complessi richiede la misura, l'analisi e l'integrazione di più classi composti della cellula vivente, di solito determinate da transcrizioni, proteomiche, metabolomiche e lipidomiche. In questo protocollo, introduciamo un metodo semplice per l'estrazione riproducibile di metaboliti, lipidi e proteine dai tessuti biologici utilizzando una singola aliquota per campione. Il metodo di estrazione è basato su un metodo di metile di terzo – butile: metanolo: acqua per liquido: suddivisione liquida di metaboliti idrofobici e polari in due fasi immiscibili insieme alla precipitazione di proteine e di altre macromolecole come pellet solido. Questo metodo fornisce quindi tre diverse frazioni di composizione molecolare specifica, che sono pienamente compatibili con le tecnologie comuni ad alta trasmissione "omics" come la cromatografia liquida (LC) o la gascromatografia (GC) accoppiata a spettrometri di massa. Anche se il metodo era initSviluppata per l'analisi di diversi campioni di tessuti vegetali, si è dimostrata pienamente compatibile per l'estrazione e l'analisi di campioni biologici provenienti da sistemi diversi come alghe, insetti, tessuti e colture cellulari di mammiferi.
La biologia dei sistemi, emersa nella metà del secolo scorso 1 ed è stata avanzata dall'analisi su larga scala di set di dati genomici e trascrizionali 2 , 3 , si è sviluppata in un approccio nuovo e indispensabile per l'analisi di sistemi biologici complessi 4 , 5 . L'obiettivo principale della biologia dei sistemi è quello di decifrare le interazioni di componenti e le dipendenze nei sistemi biologici e di colmare il legame tra i genotipi, la loro realizzazione, le trasformazioni molecolari ei fenotipi che ne derivano. Di conseguenza, l'integrazione di set di dati completi, prodotti dai vari approcci analitici su larga scala, quali la genomica, la trascrizione, la metabolomica, la lipidomica e la proteomica e la loro analisi computazionale, è diventata un prerequisito per la descrizione e la comprensione di sistemi biologici complessi.
Bas Sull'enorme diversità chimica e la complessità dei componenti biologici in qualsiasi sistema vivente, la produzione di set di dati "omici" grandi e completi si basa fortemente sulla qualità del metodo di estrazione applicato 9 . Oltre alla qualità del metodo di estrazione, l'economia del metodo è importante; Ciò significa che sarebbe auspicabile ottenere tutte le informazioni molecolari dal minor numero possibile di campioni. Spesso gli importi del campione possono limitare e pertanto è estremamente auspicabile far uso di un metodo di estrazione che può derivare tante classi molecolari da una singola estrazione di un determinato campione. Ciò significa che, invece di utilizzare diversi metodi di estrazione specializzati per l'estrazione di diverse classi composto da diverse aliquote di campione dello stesso campione, viene utilizzato un metodo di estrazione sequenziale che fraziona i costituenti molecolari di una singola aliquota in frazioni molecolari differenti.
Il metodo comune impiegato per questi metodi di estrazione frazionati si basa sul metodo di estrazione lipidica a due fasi di Folch et al. Sviluppato nel 195710. Questo metodo si basa su una suddivisione di cloroformio: metanolo / acqua di metaboliti polari e idrofobici ed è stata Con l'evoluzione della biologia dei sistemi multi-omici, il metodo Folch è stato ulteriormente gradualmente migliorato usandolo per il partizionamento del campione di proteine e metaboliti polari e lipidi per Le metabolomiche a base di gas e liquido e le lipidomiche dei composti polari e idrofobici, oltre alla proteomica a base di cromatografia a liquido 11 , 12 , 13 , 14. Purtroppo, tutti questi metodi si basano su un metodo di estrazione a base di cloroformi che non solo Porta al fo non desideratoRmation del pellet proteico come interfaase tra la polare e la fase lipidica, ma che è anche un solvente indesiderato da una prospettiva chimica verde 15 , 16 . Tuttavia, il solvente metil tert- butil etere (MTBE) supera entrambi questi problemi e rappresenta un adeguato sostituto per il cloroformio. Sulla base di questi requisiti, abbiamo deciso di stabilire un metodo di estrazione MTBE: metanolo: a base di acqua, che soddisfa tutte le specifiche di cui sopra e quindi funge da punto di partenza ideale per un'analisi completa multi-omics 16 .Questo protocollo guida l'utente passo-passo attraverso il flusso di lavoro semplice, rapido e riproducibile della preparazione del campione, compresa la risoluzione dei problemi comunemente osservati. Inoltre, illustreremo brevemente dati analitici esemplari da cromatografia liquida a ultrasuoni a spettrometria di massa (UPLC-MS) -basI lipidomi, la metabolomica e la proteomica da campioni di tessuti vegetali. Anche se gli esempi sono stati derivati da 50 mg di un campione di tessuti a foglia Arabidopsis thaliana , questo protocollo è stato utilizzato per diversi altri campioni e tessuti biologici, tra cui le alghe 17 , 18 , gli insetti 19 e le cellule dei mammiferi, gli organi e i tessuti 20 , 21 , 22 . L'ambito del protocollo di estrazione presentato è quello di fornire una descrizione chiara e dettagliata del trattamento dei campioni di pre-estrazione e della stessa procedura di estrazione. Anche se forniamo tre brevi esempi di applicazione analitica, informazioni dettagliate sul trattamento dei dati pre- e post-analitico possono essere ottenute dalle nostre precedenti pubblicazioni 16 , 23 , 24 , <supClass = "xref"> 25 , 26 .
In questo articolo descriviamo e illustriamo un semplice e estremamente applicabile protocollo di estrazione per una completa analisi lipidomica, metabolomica e proteomica da un singolo campione di foglie da 50 mg. Il metodo è stato precedentemente utilizzato in diversi studi, che sono stati pubblicati in diversi articoli 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 E dimostrato, oltre al suo diretto avanzamentoFlusso di lavoro e alta applicabilità per essere robusti e riproducibili.
Le applicazioni qui fornite mostrano alcuni metodi di routine per lo screening iniziale di un campione biologico complesso. Questi set di dati metabolomici e lipidomi su larga scala illustrati possono fornire informazioni complete sulle variazioni ampie o specifiche del metabolismo del sistema biologico analizzato, mentre i dati ottenuti dall'analisi delle proteine forniscono approfondimenti sulle quantità (abbondanti) e qualitative (modifiche ) Cambiamenti di enzimi, proteine strutturali o fattori di trascrizione (TFs) che controllano funzioni cellulari e macchinari. Di conseguenza, i dati omic integrativi hanno il potenziale per rivelare le informazioni iniziali su possibili cambiamenti indotti da perturbazioni genetiche o biotiche e / o abiotiche di un sistema biologico, illustrando i cambiamenti molecolari di molecole diverse associate a percorsi metabolici specifici o processi cellulari.
Ovviamente, A lungo termine, è abbastanza essenziale per un'analisi della biologia dei sistemi di successo per massimizzare il numero di entità molecolari analizzate e annotate, permettendo il più possibile il monitoraggio delle funzioni e delle attività cellulari. A tal fine, le frazioni ottenute possono essere applicate in aggiunta a metodi analitici diversi, mirando a ulteriori composti o classi composti ( Figura 4 ).
Detto questo, va ricordato che la strategia di analisi globale dei dati ottenuti può essere seguita da due diverse strategie: da un lato abbiamo sottolineato la spiegazione delle funzioni cellulari mediante la quantificazione di composti noti. D'altra parte, molti dei metaboliti misurati ei lipidi non sono ancora noti o annotati. Queste, tuttavia, le misurazioni composte non annotate contengono anche molte informazioni significative, che possono essere utilizzate con metodi statistici per la classificazione o discriminazione bTra gruppi o trattamenti 20 , 21 , 22 .
Tuttavia, questi composti sconosciuti, in particolare quelli rilevanti per la classificazione del gruppo o che servono come biomarcatori, devono essere identificati. Questo processo di identificazione è purtroppo abbastanza noioso e non può essere raggiunto senza ulteriori misurazioni analitiche o strategie 38 . Come si può vedere dalla figura 4 , il numero di composti non annotati è abbastanza elevato (in realtà la stragrande maggioranza). Tuttavia, come sopra ricordato, questi picchi cromatografici possono essere gestiti all'interno dell'analisi dei dati e quindi le entità significativamente interessate possono essere chiarite e sottoposte a ulteriori strategie di identificazione.
In sintesi, possiamo concludere che il protocollo qui introdotto offre diversi vantaggi per la biologia dei sistemi sperimentali e per applicazioni statistiche classichezioni.
In primo luogo, poiché tutte le frazioni vengono estratte da un singolo campione, la variazione tra i diversi set di dati sperimentali (lipidi, metaboliti, proteine) è significativamente ridotta poiché ogni set di dati è derivato dalla stessa aliquota del campione. Ciò porta chiaramente alla maggiore comparabilità dei risultati ottenuti.
In secondo luogo, il metodo è facilmente scalabile e lo rende quindi altamente compatibile con quantità di campioni da piccole a grandi dimensioni. Utilizziamo regolarmente 10-100 mg di campioni di tessuti, ma sono stati eseguiti anche studi lipidomiali su un numero di soli 20 semi di Arabidopsis 31 . Soprattutto la compatibilità con piccole quantità di campioni rende questo metodo applicabile se sono disponibili quantità limitate di tessuti o campioni biologici. Tuttavia, anche se è sufficiente un materiale sufficiente per il campione, il metodo qui presentato offre il vantaggio di utilizzare questi campioni in un numero maggiore di replicazioni sperimentali anziché uLi canta per diverse procedure di estrazione. Ciò consente un'analisi statistica migliore e raffinata dei dati statistici.
In terzo luogo, dal momento che il metodo si basa su una frazionamento liquido-liquido di molecole polari e non polari, esso fornisce, in contrasto con semplici metodi di estrazione di una fase ( es. Estrazioni di metanolo), un significativo processo di decompletamento nella procedura. Questo decompletamento efficiente del campione porta ad una purificazione parziale delle singole frazioni a causa della separazione delle molecole interferenti chimicamente l'una dall'altra. Di conseguenza, il processo di partizione chimica non solo fornisce un vantaggio pratico per l'aliquota sistematica dei campioni estratti in classi chimiche diverse ma migliora anche le singole misurazioni analitiche, in quanto rimuove i composti contaminanti dalle diverse frazioni. Chiaramente, possiamo notare che soprattutto i lipidi, che sono partizionati alla fase organica e che di solito influenzano negativamente ilL'analisi cromatografica dei composti polari sarà quasi assente dalla frazione polare. Lo stesso vale per l'analisi dei lipidi idrofobici, che saranno esauriti dai composti polari. Oltre alla purificazione di composti polari e non polari l'uno dall'altro, esauriremo e raccogliamo proteine e altre macro-molecole dal campione, che non solo fornisce una frazione separata che può essere utilizzata per l'analisi della proteina, dell'amido e della parete cellulare 16 ma anche Porta ad un campione più pulito all'interno delle singole frazioni. Ciò è particolarmente rilevante, poiché è noto che la presenza di grandi macromolecole porta a danni oa vita di almeno la durata delle colonne analitiche.
Ultimo ma non meno importante, il metodo di estrazione MTBE descritto, che si basa sul solvente di sostituzione cloroformio meno rischioso 15 , è già stato dimostrato da diversi studi del nostro gruppo, per essere ampiamente applPer i campioni biologici diversi dalle piante 16 , le alghe 17 , 18 , le mosche 19, ma anche diversi tessuti, organi o cellule di mammiferi 20 , 21 , 22 .
The authors have nothing to disclose.
MS è supportato da una borsa di studio completa del programma GERLS-DAAD. Vorremmo ringraziare il dottor Andrew Wiszniewski per la lettura delle prove e commentare il manoscritto. Siamo molto grati a tutti i membri del laboratorio Giavalisco dell'Istituto Max-Planck di Fisiologia delle Piante Molecolari, Golm, Germania per il loro aiuto.
Reagents and standards | |||
Ampicillin | Sigma Aldrich | A9393-5G | Internal standard for metabolites |
Corticosterone | Sigma Aldrich | 27840-500MG | Internal standard for metabolites, HPLC grade |
13C Sorbitol | Sigma Aldrich | 605514 | Internal standard for metabolites, ISOTEC® Stable Isotopes |
1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (17:0 PC) | Avanti Polar Lipids | 850360P | Internal standard for lipids |
Methanol (MeOH) | Biosolve Chemicals | 13684102 | ULC-MS grade |
Water | Biosolve Chemicals | 23214102 | ULC-MS grade |
Methyl tert-butyl ether (MTBE) | Biosolve Chemicals | 13890602 | HPLC grade |
Trypsin/Lys-C mix | Promega | V5072 | Enzymatic digestion of proteins |
Equipment | |||
Balance | Sartorius Corporation | 14 557 572 | |
Tissue grinding mixer mill | Retsch, Mixer Mill MM 300 | 20.746.0001 | |
Mortar and pestle | Sigma Aldrich | Z247464-1EA | |
Vortex mixer | Vortex-Genie 2, Model G560 | SI-0236 | |
Vacuum concentrator | Scan Speed Maxi Vac Alpha Evaporators | 7.008.500.002 | |
2 ml Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120094 | Used for sample extarction |
1.5 ml Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | Used for fractions |
Shaker | Eppendorf Thermomixer 5436 | 2050-100-05 | |
Sonicator | USC 300 TH | 142-0084 | |
Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf, model 5427R | 22620701 | |
UPLC system | Waters Acquity UPLC system (Waters, Machester, UK) | ||
MS system | Exactive, Orbitrap-type, MS (Exactive, Thermo-Fisher, Bremen, Germany). | ||
Reversed Phase (RP) Bridged Ethyl Hybrid (BEH) C8 column (100 mm×2.1 mm containing 1.7 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186002878 | Analysis of lipids |
RP High Strength Silica (HSS) T3 column (100 mm×2.1 mm containing 1.8 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186003539 | Analysis of metabolites |
Q ExactivePlus high resolution mass spectrometer connected to an EASY-nLC 1000 system | Thermo-Fisher, Bremen, Germany | Analysis of peptides |