En protokoll for omfattende utvinning av lipider, metabolitter og proteiner fra biologiske vev ved bruk av en prøve presenteres.
Forståelse av komplekse biologiske systemer krever måling, analyse og integrasjon av flere sammensatte klasser av levende celle, vanligvis bestemt av transkriptomiske, proteomiske, metabolomiske og lipidomiske målinger. I denne protokollen presenterer vi en enkel metode for reproduserbar ekstraksjon av metabolitter, lipider og proteiner fra biologiske vev ved bruk av en enkelt alikvot per prøve. Ekstraksjonsmetoden er basert på et metyl tert -butyleter: metanol: vannsystem for væske: flytende partisjonering av hydrofobe og polare metabolitter i to ublandbare faser sammen med utfelling av proteiner og andre makromolekyler som en fast pellet. Denne metoden gir derfor tre forskjellige fraksjoner av spesifikk molekylær sammensetning, som er fullt kompatible med vanics-teknologier med høy gjennomstrømning, slik som væskekromatografi (LC) eller gaskromatografi (GC) koblet til massespektrometre. Selv om metoden var initIalt utviklet for analyse av forskjellige plantevevsprøver, har det vist seg å være fullt kompatibelt for utvinning og analyse av biologiske prøver fra systemer som er så forskjellige som alger, insekter og pattedyrsvev og cellekulturer.
Systembiologi, som kom fram i midten av forrige århundre 1 og ble avansert ved storskalaanalyse av genomiske og transkriptomiske datasett 2 , 3 , har utviklet seg til en ny og uunnværlig tilnærming til analyse av komplekse biologiske systemer 4 , 5 . Hovedmålet med systembiologi er å dechiffrere komponentinteraksjonene og avhengighetene i biologiske systemer og å bygge broen mellom genotyper, deres realisering, molekylære transformasjoner og resulterende fenotyper. Følgelig er integrasjonen av omfattende datasett, produsert av de ulike storskala analytiske tilnærmingene, nemlig genomics, transkriptomics, metabolomics, lipidomics og proteomics og deres beregningsanalyse, blitt en forutsetning for beskrivelse og forståelse av komplekse biologiske systemer.
Bas Redegjort for det store kjemiske mangfoldet og kompleksiteten av biologiske komponenter i ethvert levende system, bygger produksjonen av store og omfattende "omics" datasett sterkt på kvaliteten på den anvendte ekstraksjonsmetoden 9 . I tillegg til kvaliteten på ekstraksjonsmetoden er metodenes økonomi viktig; Dette betyr at det ville være ønskelig å få så mye molekylær informasjon fra så lite prøveinngang som mulig. Eksempelvis kan mengder av prøver være begrensende, og det er derfor svært ønskelig å benytte seg av en ekstraksjonsmetode som kan utlede så mange molekylære klasser fra en enkelt ekstraksjon av en gitt prøve. Dette betyr at i stedet for å bruke flere spesialiserte ekstraksjonsmetoder for ekstraksjon av forskjellige sammensatte klasser fra forskjellige prøveallikser av samme prøve, anvendes en sekvensiell ekstraksjonsmetode som fraksjonerer de molekylære bestanddelene av en enkelt alikvot i forskjellige molekylfraksjoner.
Den vanlige fremgangsmåten anvendt for disse fraksjonerte ekstraksjonsmetoder er basert på tofase-lipidekstraksjonsmetoden fra Folch et al., Utviklet i 1957 10. Denne metoden er basert på en kloroform: metanol / vann-oppdeling av polare og hydrofobe metabolitter og var Ment for å rydde opp og de-komplekse prøver for høy kvalitet lipid analyse. Med utviklingen av multi-omics systembiologi ble Folch-metoden ytterligere trinnvis forbedret ved å benytte den til prøvepartisjonering av proteiner og polare metabolitter og lipider for Gass- og væskekromatografibasert metabolomikk og lipidomik av polare og hydrofobe forbindelser, i tillegg til væskekromatografi-baserte proteomika 11 , 12 , 13 , 14. Dessverre er alle disse metodene avhengig av en kloroformbasert ekstraksjonsmetode, som ikke bare Fører til den uønskede foRation av proteinpellet som en interfase mellom polar- og lipidfasen, men som også er et uønsket løsningsmiddel fra et grønt kjemiperspektiv 15 , 16 . Løsningsmiddelet metyl- tert -butyleter (MTBE) overvinner imidlertid begge disse ovennevnte problemer og er en egnet erstatning for kloroform. Basert på disse kravene bestemte vi oss for å etablere en MTBE: metanol: vannbasert utvinningsmetode, som oppfyller alle ovennevnte spesifikasjoner og derfor fungerer som et ideelt utgangspunkt for omfattende multi-omics analyse 16 .Denne protokollen veileder brukeren trinn for trinn gjennom den enkle, raske og reproduserbare arbeidsflyten i prøvepreparatet, inkludert feilsøking av vanlige observerte problemer. Videre vil vi kort introdusere eksempler på analytiske data fra ultra-ytelse væskekromatografi-massespektrometri (UPLC-MS) -basEd lipidomics, metabolomics og proteomics profilering fra plantevevsprøver. Selv om de givne eksemplene er avledet fra 50 mg av en Arabidopsis thaliana leaf- vevsprøve , har denne protokollen blitt brukt til flere andre biologiske prøver og vev, inkludert alger 17 , 18 , insekter 19 og pattedyrceller, organer og vev 20 , 21 , 22 . Omfanget av den presenterte ekstraksjonsprotokollen er å gi en klar og detaljert beskrivelse av forhåndsekstraksjonsprøvehåndteringen og selve utvinningsfremgangsmåten. Selv om vi gir tre korte eksempler på analytisk søknad, kan du få detaljert informasjon om før og etter analytisk datahåndtering fra våre tidligere publikasjoner 16 , 23 , 24 , <supClass = "xref"> 25 , 26 .
I denne artikkelen beskriver og illustrerer vi en enkel og svært anvendelig ekstraksjonsprotokoll for omfattende lipidomisk, metabolomisk og proteomanalyse fra en enkelt 50 mg bladprøve. Metoden har tidligere vært brukt i flere studier, som har blitt publisert i forskjellige artikler 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 Og viste seg, i tillegg til sin rett fremArbeidsflyt og høy anvendelighet for å være robust og reproduserbar.
De her angitte søknadene viser noen rutinemetoder for den første screening av en kompleks biologisk prøve. Disse illustrerte storskala metabolomiske og lipidomiske datasettene kan gi omfattende informasjon om de brede eller spesifikke forandringene i metabolismen av det analyserte biologiske systemet, mens dataene som er oppnådd ved analyse av proteiner, gir innsikt i kvantitative (overflod) og kvalitative (modifikasjoner ) Endringer av enzymer, strukturelle proteiner eller transkripsjonsfaktorer (TFs) som styrer cellefunksjoner og maskiner. Følgelig har integrative omics-data potensial til å avsløre innledende informasjon om mulige forandringer indusert av genetiske eller biotiske og / eller abiotiske forstyrrelser i et biologisk system ved å belyse molekylære endringer av forskjellige molekyler assosiert med bestemte metabolske veier eller cellulære prosesser.
SelvfølgeligPå lang sikt er det ganske viktig, for en vellykket systembiologianalyse, å maksimere antall analyserte og annoterte molekylære enheter, slik at overvåking av mobilfunksjoner og aktiviteter så fullstendig som mulig. For dette formål kunne de oppnådde fraksjoner påføres i tillegg til forskjellige analysemetoder, rettet mot ytterligere forbindelser eller sammensatte klasser ( figur 4 ).
Når det er sagt, må det nevnes at den globale analysestrategien for de innhentede dataene kan følges av to forskjellige strategier: På den ene side har vi lagt vekt på å avklare cellulære funksjoner ved kvantifisering av kjente forbindelser. På den annen side er mange av de målte metabolitter og lipider ennå ikke kjent eller merket. Disse, men likevel ikke-annoterte sammensatte målinger inneholder også rikelig med meningsfylt informasjon, som kan benyttes ved statistiske metoder for klassifisering eller diskriminering bEtween grupper eller behandlinger 20 , 21 , 22 .
Likevel, disse ukendte forbindelsene, spesielt de som er relevante for gruppeklassifisering eller betjening som biomarkører, må identifiseres. Denne identifiseringsprosessen er dessverre ganske kjedelig og kan ikke oppnås uten ytterligere analytiske målinger eller strategier 38 . Som det fremgår av figur 4 , er antall ikke-merkede forbindelser ganske høye (faktisk det store flertallet). Likevel, som nevnt ovenfor, kan disse kromatografiske topper håndteres i dataanalysen, og derfor kan signifikant berørte enheter bli belyst og utsatt for ytterligere identifikasjonsstrategier.
Sammendrag kan vi konkludere med at den her introduserte protokollen gir flere fordeler for eksperimentell systembiologi, så vel som for klassisk statistisk applikasjonasjon.
For det første, siden alle fraksjoner trekkes ut fra en enkelt prøve, blir variasjonen mellom de forskjellige eksperimentelle datasettene (lipider, metabolitter, proteiner) signifikant redusert siden hvert datasett er avledet fra samme prøveallikott. Dette fører klart til økt sammenligning av de oppnådde resultatene.
For det andre er metoden lett skalerbar og gjør den derfor svært kompatibel med små til store mengder. Vi bruker rutinemessig 10-100 mg vevsprøver, men vellykkede lipidomiske studier har også blitt utført på så lite som 20 Arabidopsis-frø 31 . Spesielt kompatibiliteten med små prøvebeløp gjør denne metoden anvendelig dersom begrensede mengder biologiske vev eller prøver er tilgjengelige. Likevel, selv om tilstrekkelig prøvemateriale er tilgjengelig, gir metoden som presenteres her fordelen å bruke disse prøvene i et større antall eksperimentelle replikater i stedet for degSyng dem for forskjellige utvinningsrutiner. Dette muliggjør en bedre og raffinert statistisk dataanalyse.
For det tredje, siden metoden er basert på en væskefluid fraksjon av polære og ikke-polare molekyler, gir det i motsetning til enkle enfase-ekstraksjonsmetoder ( f.eks. Metanolekstraksjoner) et signifikant de-kompleksdannelsestrinn i prosedyren. Denne effektive prøve-de-kompleksdannelse fører til delvis rensing av de enkelte fraksjoner på grunn av separasjon av kjemisk forstyrrende molekyler fra hverandre. Følgelig gir kjemisk partisjoneringsprosess ikke bare en praktisk fordel for systematisk alikvotering av de ekstraherte prøver i forskjellige kjemiske klasser, men forbedrer også de enkelte analytiske målinger, siden det fjerner forurensende forbindelser fra de forskjellige fraksjoner. Det er klart at vi kan observere det spesielt lipidene, som er partisjonert i den organiske fasen, og som vanligvis påvirker negativtKromatografisk analyse av polære forbindelser, vil være nesten helt fraværende fra polarfraksjonen. Det samme gjelder for analysen av de hydrofobe lipidene, som vil bli utarmet av de polare forbindelser. I tillegg til rensing av polare og ikke-polare forbindelser fra hverandre, bryter vi ut og samler proteiner og andre makromolekyler fra prøven, som ikke bare gir en egen fraksjon, som kan benyttes til protein, stivelse og cellevegganalyse 16 , men også Fører til en renere prøve i de enkelte fraksjoner. Dette er spesielt relevant, siden det er kjent at tilstedeværelsen av store makromolekyler, fører til skade eller minst kortere levetid for de analytiske kolonnene.
Sist men ikke minst, har den beskrevne MTBE-ekstraksjonsmetoden, som er basert på det mindre farlige og gunstigere kloroformutskiftningsmiddelet 15 , allerede vist ved flere studier fra vår gruppe, for å være meget applIcability for forskjellige biologiske prøver fra planter 16 , alger 17 , 18 , flyr 19, men også flere pattedyrvev, organer eller celler 20 , 21 , 22 .
The authors have nothing to disclose.
MS støttes av et fullt PhD-stipend fra GERLS-DAAD-programmet. Vi vil gjerne takke Dr. Andrew Wiszniewski for korrekturlesing og kommentere manuskriptet. Vi er svært takknemlige for alle medlemmene av Giavalisco-laboratoriet ved Max-Planck Institute of Molecular Plant Physiology, Golm, Tyskland for deres hjelp.
Reagents and standards | |||
Ampicillin | Sigma Aldrich | A9393-5G | Internal standard for metabolites |
Corticosterone | Sigma Aldrich | 27840-500MG | Internal standard for metabolites, HPLC grade |
13C Sorbitol | Sigma Aldrich | 605514 | Internal standard for metabolites, ISOTEC® Stable Isotopes |
1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (17:0 PC) | Avanti Polar Lipids | 850360P | Internal standard for lipids |
Methanol (MeOH) | Biosolve Chemicals | 13684102 | ULC-MS grade |
Water | Biosolve Chemicals | 23214102 | ULC-MS grade |
Methyl tert-butyl ether (MTBE) | Biosolve Chemicals | 13890602 | HPLC grade |
Trypsin/Lys-C mix | Promega | V5072 | Enzymatic digestion of proteins |
Equipment | |||
Balance | Sartorius Corporation | 14 557 572 | |
Tissue grinding mixer mill | Retsch, Mixer Mill MM 300 | 20.746.0001 | |
Mortar and pestle | Sigma Aldrich | Z247464-1EA | |
Vortex mixer | Vortex-Genie 2, Model G560 | SI-0236 | |
Vacuum concentrator | Scan Speed Maxi Vac Alpha Evaporators | 7.008.500.002 | |
2 ml Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120094 | Used for sample extarction |
1.5 ml Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | Used for fractions |
Shaker | Eppendorf Thermomixer 5436 | 2050-100-05 | |
Sonicator | USC 300 TH | 142-0084 | |
Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf, model 5427R | 22620701 | |
UPLC system | Waters Acquity UPLC system (Waters, Machester, UK) | ||
MS system | Exactive, Orbitrap-type, MS (Exactive, Thermo-Fisher, Bremen, Germany). | ||
Reversed Phase (RP) Bridged Ethyl Hybrid (BEH) C8 column (100 mm×2.1 mm containing 1.7 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186002878 | Analysis of lipids |
RP High Strength Silica (HSS) T3 column (100 mm×2.1 mm containing 1.8 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186003539 | Analysis of metabolites |
Q ExactivePlus high resolution mass spectrometer connected to an EASY-nLC 1000 system | Thermo-Fisher, Bremen, Germany | Analysis of peptides |