Ett protokoll för omfattande extraktion av lipider, metaboliter och proteiner från biologiska vävnader med ett prov presenteras.
Förståelse av komplexa biologiska system kräver mätning, analys och integration av flera föreningsklasser av levande celler, vanligtvis bestämda av transkriptomiska, proteomiska, metabolomiska och lipidomiska mätningar. I detta protokoll introducerar vi en enkel metod för reproducerbar extraktion av metaboliter, lipider och proteiner från biologiska vävnader med en enda alikvot per prov. Extraktionsmetoden baseras på ett metyl tert -butyleter: metanol: vattensystem för vätska: vätskepartitionering av hydrofoba och polära metaboliter i två oblandbara faser tillsammans med utfällning av proteiner och andra makromolekyler som en fast pellets. Denna metod ger därför tre olika fraktioner av specifik molekylär komposition, vilka är fullständigt kompatibla med vanics-teknologier med hög genomströmning, såsom vätskekromatografi (LC) eller gaskromatografi (GC) kopplad till masspektrometrar. Även om metoden var initIalt utvecklad för analys av olika vävnadsprover har det visat sig vara fullständigt kompatibel för extraktion och analys av biologiska prover från system som är så olika som alger, insekter och däggdjursvävnader och cellkulturer.
Systembiologi, som uppstod i mitten av förra seklet 1 och avancerade genom storskalig analys av genomiska och transkriptomiska dataset 2 , 3 , har utvecklats till ett nytt och oumbärligt tillvägagångssätt för analys av komplexa biologiska system 4 , 5 . Huvudsyftet med systembiologi är att dechiffrera komponentinteraktionerna och beroenden i biologiska system och att överbrygga länken mellan genotyper, deras realisering, molekylära transformationer och resulterande fenotyper. Följaktligen har integrationen av omfattande dataset, som framställts av de olika storskaliga analysmetoderna, nämligen genomics, transcriptomics, metabolomics, lipidomics and proteomics och deras beräkningsanalys, blivit en förutsättning för beskrivning och förståelse av komplexa biologiska system.
Bas På grund av den enorma kemiska mångfalden och komplexiteten hos biologiska komponenter i vilket levande system som helst, bygger produktionen av stora och omfattande omics-datasatser starkt på kvaliteten på den använda extraktionsmetoden 9 . Utöver kvaliteten på extraktionsmetoden är metodens ekonomi viktig. Detta innebär att det vore önskvärt att få så mycket molekylär information från så lite provinmatning som möjligt. Ofta kan provmängder vara begränsande och därför är det mycket önskvärt att använda en extraktionsmetod som kan härleda så många molekylära klasser från en enda extraktion av ett givet prov. Detta innebär att istället för att använda flera specialiserade extraktionsmetoder för extraktion av olika föreningsklasser från olika provalikvoter av samma prov används en sekventiell extraktionsmetod som fraktionerar de molekylära beståndsdelarna i en enda alikvot i olika molekylfraktioner.
Den gemensamma metoden som används för dessa fraktionerade extraktionsmetoder är baserad på tvåfas-lipid-extraktionsmetoden från Folch et al., Utvecklad 1957 10. Denna metod är baserad på en kloroform: metanol / vattenfördelning av polära och hydrofoba metaboliter och var Avsedda att rengöra och avkomplexa prover för högkvalitativ lipidanalys. Med utvecklingen av biomikrobiosystembiologi, blev Folch-metoden ytterligare stegvis förbättrad genom att använda den för provpartitionering av proteiner och polära metaboliter och lipider för Gas- och vätskekromatografibaserad metabolomik och lipidomik av polära och hydrofoba föreningar, förutom vätskekromatografibaserade proteomics 11 , 12 , 13 , 14. Olyckligtvis är alla dessa metoder beroende av en kloroformbaserad extraktionsmetod som inte bara Leder till den oönskade foRation av proteinpelleten som ett mellanfas mellan polär- och lipidfasen men som också är ett oönskat lösningsmedel från ett grönt kemiperspektiv 15 , 16 . Emellertid överväger lösningsmedlet metyl- tert -butyleter (MTBE) båda dessa ovannämnda problem och är en lämplig ersättning för kloroform. Baserat på dessa krav bestämde vi oss för att etablera en MTBE: metanol: vattenbaserad extraktionsmetod som uppfyller alla ovannämnda specifikationer och fungerar därför som en idealisk utgångspunkt för omfattande multi-omics-analys 16 .Detta protokoll guidar användaren steg för steg genom det enkla, snabba och reproducerbara arbetsflödet i provberedningen, inklusive felsökning av vanliga problem. Vidare kommer vi kort att introducera exempel på analytiska data från ultraprestandad vätskekromatografi-masspektrometri (UPLC-MS) -basEd lipidomics, metabolomics och proteomics profilering från vävnadsprover. Trots att de givna exemplen härrör från 50 mg av ett Arabidopsis thaliana-bladvävnadsprov , har detta protokoll använts för flera andra biologiska prover och vävnader, inklusive alger 17 , 18 , insekter 19 och däggdjursceller, organ och vävnad 20 , 21 , 22 . Omfattningen av det presenterade extraktionsprotokollet är att tillhandahålla en tydlig och detaljerad beskrivning av för-extraktionsprovhanteringen och själva extraktionsproceduren. Trots att vi ger tre korta exempel på analytisk tillämpning, kan vi få detaljerade uppgifter om för- och postanalytisk datahantering från våra tidigare publikationer 16 , 23 , 24 , <supClass = "xref"> 25 , 26 .
I denna artikel beskriver vi och illustrerar ett enkelt och mycket tillämpligt extraktionsprotokoll för omfattande lipidomisk, metabolomisk och proteomanalys från ett enda 50 mg bladprov. Metoden har tidigare använts i flera studier, vilka har publicerats i olika artiklar 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 Och bevisat, förutom att det är rakt framåtArbetsflöde och hög användbarhet är robusta och reproducerbara.
De här angivna applikationerna visar några rutinmetoder för inledande screening av ett komplext biologiskt prov. Dessa illustrerade storskaliga metabolomiska och lipidomiska dataset kan tillhandahålla fullständig information om de breda eller specifika förändringarna i metabolism av det analyserade biologiska systemet, medan data som erhållits från analysen av proteiner, ger insikter i kvantitativa (överflöd) och kvalitativa (modifieringar ) Förändringar av enzymer, strukturella proteiner eller transkriptionsfaktorer (TFs) som styr cellulära funktioner och maskiner. Följaktligen har integrativa omics-data potentialen att avslöja initial information om möjliga förändringar som induceras av genetiska eller biotiska och / eller abiotiska störningar av ett biologiskt system, genom att belysa molekylära förändringar av olika molekyler associerade med specifika metaboliska vägar eller cellulära processer.
SjälvklartPå lång sikt är det ganska viktigt för en framgångsrik systembiologianalys att maximera antalet analyserade och annoterade molekylära enheter, vilket möjliggör övervakning av cellulära funktioner och aktiviteter så fullständigt som möjligt. För detta ändamål kan de erhållna fraktionerna appliceras i tillägg till olika analytiska metoder, riktade mot ytterligare föreningar eller föreningsklasser ( Figur 4 ).
Med detta sagt måste det nämnas att den globala analysstrategin för de erhållna data kan följas av två olika strategier: å ena sidan har vi betonat belysningen av cellulära funktioner genom kvantifiering av kända föreningar. Å andra sidan är många av de uppmätta metaboliterna och lipiderna ännu inte kända eller annoterade. Dessa, men icke-annoterade, sammansatta mätningar innehåller också mycket meningsfull information som kan användas av statistiska metoder för klassificering eller diskriminering bEtweengrupper eller behandlingar 20 , 21 , 22 .
Fortfarande måste dessa okända föreningar, särskilt de som är relevanta för gruppklassificering eller betjäning som biomarkörer, identifieras. Denna identifieringsprocess är tyvärr ganska tråkig och kan inte uppnås utan ytterligare analytiska mätningar eller strategier 38 . Som framgår av Figur 4 är antalet icke-antecknade föreningar ganska höga (faktiskt den stora majoriteten). Ändå, som nämnts ovan, kan dessa kromatografiska toppar hanteras inom dataanalysen och därför kan signifikant drabbade enheter belysas och utsättas för ytterligare identifieringsstrategier.
Sammanfattningsvis kan vi dra slutsatsen att det här introducerade protokollet ger flera fördelar för experimentell systembiologi såväl som för klassisk statistisk applikationations.
För det första, eftersom alla fraktioner extraheras från ett enda prov, reduceras variationen mellan de olika experimentella datasætten (lipider, metaboliter, proteiner) betydligt, eftersom varje dataset härrör från samma provalikvot. Detta leder tydligt till ökad jämförbarhet av de erhållna resultaten.
För det andra är metoden lätt skalbar och gör den därför mycket kompatibel med små till stora provmängder. Vi använder rutinmässigt 10-100 mg vävnadsprover, men framgångsrika lipidomiska studier har också utförts på så lite som 20 Arabidopsis-frön 31 . Speciellt kompatibiliteten med små provmängder gör denna metod tillämplig om begränsade mängder biologiska vävnader eller prover är tillgängliga. Även om tillräckligt med provmaterial är tillgängligt, erbjuder metoden som presenteras här fördelen att använda dessa prover i ett större antal experimentreplikat istället för digSjunga dem för olika utvinningsförfaranden. Detta möjliggör en bättre och raffinerad statistisk dataanalys.
För det tredje, eftersom förfarandet är baserat på en flytande-vätskefraktionering av polära och icke-polära molekyler, tillhandahåller det, i motsats till enkla enfasutsugningsmetoder ( t ex metanolekstraktioner) ett signifikant de-komplexbildningssteg i proceduren. Denna effektiva provdekomplexering leder till en partiell rening av de individuella fraktionerna på grund av separationen av kemiskt störande molekyler från varandra. Följaktligen ger den kemiska partitionsprocessen inte bara en praktisk fördel för systematisk alikvotering av de extraherade proven i olika kemiska klasser men förbättrar också de individuella analytiska mätningarna eftersom det avlägsnar förorenande föreningar från de olika fraktionerna. Det är tydligt att vi kan observera att speciellt lipiderna, vilka är partitionerade till den organiska fasen och som vanligtvis påverkarKromatografisk analys av polära föreningar kommer nästan att vara frånvarande från polarfraktionen. Detsamma gäller för analysen av de hydrofoba lipiderna, vilka kommer att vara utarmade av de polära föreningarna. Förutom rening av polära och nonpolära föreningar från varandra, bryter vi ut och samlar proteiner och andra makromolekyler från provet, vilket inte bara ger en separat fraktion, vilken kan användas för protein, stärkelse och cellvägganalys 16 , men också Leder till ett renare prov inom de enskilda fraktionerna. Detta är särskilt relevant, eftersom det är känt att närvaron av stora makromolekyler leder till skada eller åtminstone kortare livslängd hos de analytiska kolumnerna.
Sist men inte minst har den beskrivna MTBE-extraktionsmetoden, som bygger på det mindre farliga och fördelaktiga kloroformutbyteslösningsmedlet 15 , redan visats av flera studier från vår grupp, att vara allmänt tillämpligIcability för olika biologiska prover från växter 16 , alger 17 , 18 , flyger 19 men också flera däggdjursvävnader, organ eller celler 20 , 21 , 22 .
The authors have nothing to disclose.
MS stöds av ett fullt PhD-stipendium från GERLS-DAAD-programmet. Vi vill tacka Dr Andrew Wiszniewski för korrekturläsning och kommentera manuskriptet. Vi är mycket tacksamma för alla medlemmar av Giavalisco-labbet på Max-Planck Institute of Molecular Plant Physiology, Golm, Tyskland för deras hjälp.
Reagents and standards | |||
Ampicillin | Sigma Aldrich | A9393-5G | Internal standard for metabolites |
Corticosterone | Sigma Aldrich | 27840-500MG | Internal standard for metabolites, HPLC grade |
13C Sorbitol | Sigma Aldrich | 605514 | Internal standard for metabolites, ISOTEC® Stable Isotopes |
1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (17:0 PC) | Avanti Polar Lipids | 850360P | Internal standard for lipids |
Methanol (MeOH) | Biosolve Chemicals | 13684102 | ULC-MS grade |
Water | Biosolve Chemicals | 23214102 | ULC-MS grade |
Methyl tert-butyl ether (MTBE) | Biosolve Chemicals | 13890602 | HPLC grade |
Trypsin/Lys-C mix | Promega | V5072 | Enzymatic digestion of proteins |
Equipment | |||
Balance | Sartorius Corporation | 14 557 572 | |
Tissue grinding mixer mill | Retsch, Mixer Mill MM 300 | 20.746.0001 | |
Mortar and pestle | Sigma Aldrich | Z247464-1EA | |
Vortex mixer | Vortex-Genie 2, Model G560 | SI-0236 | |
Vacuum concentrator | Scan Speed Maxi Vac Alpha Evaporators | 7.008.500.002 | |
2 ml Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120094 | Used for sample extarction |
1.5 ml Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | Used for fractions |
Shaker | Eppendorf Thermomixer 5436 | 2050-100-05 | |
Sonicator | USC 300 TH | 142-0084 | |
Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf, model 5427R | 22620701 | |
UPLC system | Waters Acquity UPLC system (Waters, Machester, UK) | ||
MS system | Exactive, Orbitrap-type, MS (Exactive, Thermo-Fisher, Bremen, Germany). | ||
Reversed Phase (RP) Bridged Ethyl Hybrid (BEH) C8 column (100 mm×2.1 mm containing 1.7 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186002878 | Analysis of lipids |
RP High Strength Silica (HSS) T3 column (100 mm×2.1 mm containing 1.8 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186003539 | Analysis of metabolites |
Q ExactivePlus high resolution mass spectrometer connected to an EASY-nLC 1000 system | Thermo-Fisher, Bremen, Germany | Analysis of peptides |