Summary
Denne protokollen beskriver en Drosophila læring og minne analyse kalt courtship conditioning. Denne klassiske analysen er basert på en reduksjon av mannlig oppførsel etter seksuell avvisning av en ikke-mottakelig premiert kvinne. Denne naturlige form for atferdsmessig plastisitet kan brukes til å teste læring, kortsiktig hukommelse og langtidshukommelse.
Abstract
Mange innsikt i molekylære mekanismer som ligger til grunn for læring og minne, er blitt uttalt ved bruk av enkle atferdsanalyser i modellorganismer som fruktfluen , Drosophila melanogaster . Drosophila er nyttig for å forstå de grunnleggende nevrobiologiske underliggende kognitive underskuddene som skyldes mutasjoner i gener forbundet med menneskelige kognitive forstyrrelser, slik som intellektuell funksjonshemning (ID) og autisme. Dette arbeidet beskriver en metode for å teste læring og minne ved hjelp av et klassisk paradigme i Drosophila, kjent som kriminalitetskonflikt. Mann flyr rettferdige kvinner med et tydelig mønster av lett gjenkjennelig atferd. Forlovede hunner er ikke mottakelige for parring og vil avvise mannens koplingsforsøk. Som svar på denne avvisningen, reduserer mannlige fluer sin oppførsel. Denne lærte reduksjonen i rettssaker er målt over tid, og tjener som en indikator på læring og minne. Den grunnleggende talletRical utgang av denne analysen er frieriindeksen (CI), som er definert som prosentandelen av tid som en mann bruker tilbringer i løpet av 10 minutter. Læringsindeksen (LI) er den relative reduksjonen av CI i fluer som har blitt utsatt for en premiert kvinne sammenlignet med naive fluer uten tidligere sosiale møter. For statistisk sammenligning av LIs mellom genotyper, brukes en randomiseringstest med bootstrapping. For å illustrere hvordan analysen kan brukes til å adressere rollen som et gen relatert til læring og minne, ble den pan-neuronale knockdown av dihydrohydroksacetonfosfat-acyltransferase ( Dhap-at ) karakterisert her. Den menneskelige ortologen til Dhap-at , glyceronfosfat O-acyltransferase ( GNPT ), er involvert i rhizomelic chondrodysplasia punctata type 2, et autosomalt resessivt syndrom karakterisert ved alvorlig ID. Ved hjelp av kriminalitetskondisjoneringsanalysen ble det bestemt at Dhap-at er nødvendig for langsiktig minne, men ikke forkorttidshukommelse. Dette resultatet tjener som grunnlag for videre undersøkelse av de underliggende molekylære mekanismer.
Introduction
De molekylære mekanismene som ligger til grunn for læring og minne, er bevart gjennom mange arter. Den banebrytende arbeidsscreening Drosophila melanogaster-mutantlinjer for defekter i olfaktorisk læring og minne har gitt nøkkelmolekylær innsikt i prosessene som ligger til grunn for læring og minne 1 . Disse studiene identifiserte noen av de første generene som er involvert i læring og minne, som rutabaga 2 , amnesiac 3 og dunce 4 , som avslører en kritisk rolle for signifikant syklisk adenosinmonofosfat (cAMP) 5 .
Tidlige genetiske skjermbilder for minnemutanter ble primært utført ved bruk av olfaktorisk kondisjonering. Imidlertid har flere metoder for å måle andre former for læring og minne oppstått over tid. Et av de mest brukte lærings- og minneparadigmene, og analysen beskrevet her, er kjent som cVårtship condition, som ble først beskrevet av Siegel og Hall 6 og ble senere raffinert av flere andre forskningsgrupper 7 , 8 , 9 . Courtship-kondisjonering er avhengig av tilstedeværelsen av en spesifikk feromon, cis- va-acetylacetat (cVA), på den kvinnelige buken, som avsettes av hannen under kopiering. Sensing cVA på kvinnenes underliv reduserer naturligvis opphavsrettens adferd, og når den kombineres med kvinners avslag, blir effekten av cVA på mannlig skikkelse reduksjon dramatisk forbedret. Reaksjonen av mannlige fluer i denne analysen kan enkelt kvantifiseres ved å observere deres distinkte adferdsadferd, som er karakterisert ved å orientere seg mot og følge kvinnene, tappe, forlenge og vibrerende vingen, slikker og forsøker kopiering 10 ( figur 1A ). Mannlige fluer lærer å distinguis H mellom mottakelige jomfru og ikke-mottakelige parede kvinner 11 , og etter seksuell avvisning viser de redusert frieri til ikke-mottakelige kvinner i opptil 9 dager 8 . Denne naturlige oppførselen kan brukes til å belyse mekanismene som ligger til grunn for læring, korttidsminne (STM) og langtidsminne (LTM) 8 , 9 , 12 . Læring er definert som den umiddelbare reduksjonen i frierisadferd som oppstår i treningsperioden, og kalles ofte omgående tilbakekallingshukommelse, målt 0 - 30 minutter etter eksponering til en parret kvinne 6 , 8 . STM måles mellom 30 minutter og 1 time etter trening, mens LTM oftest måles 24 timer etter trening 8 ( Figur 1B ). STM kan induseres ved hjelp av en 1-timers treningsperiode, men den varer bare i 2-3 timerS = "xref"> 6 , 8 . I de fleste læringsparadigmene kan LTM bare induseres ved avvikende opplæringsoppgaver. Mcbride et al . (1999) 8 viste at tre avvikende, 1-timers treningsøkter var tilstrekkelige til å indusere hoftehukommelse som varer i opptil 9 dager, i motsetning til 2-3 h fremkalt av en enkelt 1-timers treningsøkt. McBride et al . 8 viste også at en enkelt 5-timers treningsøkt produserte et lignende LTM respons i opptil 9 dager. Fluer rømmer ikke kontinuerlig i løpet av denne 5-timers perioden, og produserer faktisk sin egen spredte opplæring for å indusere LTM i en enkelt treningsøkt. Dette er svært viktig fra et praktisk perspektiv, og øker den enkle måten som denne analysen kan brukes til å undersøke LTM. Nåværende protokoller bruker overvei en enkelt treningsøkt på 7-h for LTM 11 , 12 . Flere studier har undersøkt forskjelligeMutante forhold som har spesifikke feil i ulike aspekter av courtship læring. For eksempel påvirker svampekroppens ablasjon STM og LTM, men ikke lærer 8 . Mutasjoner i amnesiacgenet, som først ble definert som en spesifikk regulator av minne ved bruk av olfaktorisk kondisjonering 3 , påvirker STM, men ikke lærer 6 . Forstyrrelse av oversettelsesregulatoren orb2 (oo18 RNA-bindende (orb) CPEB2-underfamilie) og ecdyson-signalering utelukkende påvirker LTM 9 , 13 . Dermed er disiplinskonditionering et nyttig paradigme for å dissekere mekanismene som ligger bak de ulike stadier av læring og minne.
Dette arbeidet demonstrerer et optimalisert eksperimentelt oppsett som muliggjør den relativt høye gjennomstrømmingsprøven av courtship-kondisjonering. Videre beskriver det et statistisk analyseskript og diskuterer kritiske faktorer for analysen. Det er shEier her at Drosophila- genet Dihydroxyacetonfosfat-acyltransferase ( Dhap-at ) Er nødvendig i nevroner for LTM, men ikke for STM. Den menneskelige orthologen til dette genet, glyceronfosfat O-acyltransferase ( GNPAT ), er mutert i rhizomelic chondrodysplasia punctata type 2 14 , en autosomal-recessiv lidelse karakterisert ved alvorlig intellektuell funksjonshemning, anfall og flere andre kliniske egenskaper 15 . I denne sammenhengen kan kriminalitetskondisjonering brukes til å validere funksjonen av menneskelige sykdomsgener i læring og minne, og danner grunnlag for mekanistiske studier.
Protocol
MERK: I protokollen som er skissert nedenfor, er det beskrevet en kopi av samling, trening og testing. For å teste reproduserbarheten av resultatene, bør disse trinnene gjentas parallelt, på flere dager, og med separate grupper av fluer ( Tabell 1) . Protokollen er basert på en 10-dagers livssyklus fra egg til voksen, noe som er normalt ved oppdrett av fluer under konstante forhold på 25 ° C, 70% fuktighet og en 12 h lys / mørk syklus. Alle aspekter av denne protokollen antar at forholdene holdes konstante gjennom hele analysen. Tider er angitt som timer før lysene slås på (BLO) eller etter at lysene slås på (ALO) i inkubatoren, da dette lett kan innstilles avhengig av forskerens foretrukne tidspunkt på dagen. Bruk kun CO 2 -gass for opprinnelig samling av naive mannlige fluer og for innsamling av premierte kvinner. Denne protokollen for advokatkondisjonering består av følgende trinn:
- EEtablering av premierte kvinnelige samlingskulturer
- Etablering av kulturer for innsamling av mannlige testpersoner
- Forberedelse av boligblokker
- Etablering av parringsflasker for produksjon av standardiserte premierte kvinner
- Innsamling av mannlige testpersoner
- Opplæring
- testing
- Video dataanalyse og statistikk
1. Etablering av Premated Female Collection Cultures
- Forbered strømforsyning 16 . Kok 0,8% (vekt / volum) agar, 8% (vekt / volum) gjær, 2% (vekt / volum) gjærekstrakt, 2% (w / v) pepton, 3% (vekt / volum) sukrose, 6% W / v) glukose, 0,05% (vekt / volum) MgS04 og 0,05% (w / v) CaCl2 i vann i 15 minutter. La løsningen avkjøles til 70 ° C før tilsetning av 0,05% (w / v) metylparaben (FORSIKTIG: giftig) og 0,5% (volum / volum) propionsyre (FORSIKTIG: giftig). Bland godt ved omrøring under avkjøling ytterligere til 50 ° C for å oppnå en homogen løsning.
- Før maten såLokkes ved romtemperatur, tilsett ca. 50 ml strømtilførsel til hvert 175 ml hetteglass. La maten kjøle seg videre. Lukk hetteglasset med en plugg.
MERK: Powerfood er en spesialisert matblanding formulert spesielt for produksjon av store antall fluer, antagelig ved å indusere egglegging. Powerfood brukes ikke til å produsere mannlige fluer som vil bli brukt til atferdsanalyse (trinn 2) fordi atypisk diett og potensiell trengsel kan påvirke utviklingen. - På dag -11 ( Tabell 1 ) starter 5-20 wildtype kulturer med ca. 60-100 fluer (en blanding av hanner og kvinner) i kraftfettflasker; Disse vil bli brukt i trinn 4 for å produsere standardiserte premierte kvinner 17 . Legg et filterpapir til hvert hetteglass for å øke det området larven kan pusse på; Dette vil øke antallet flyr som kan lukke seg.
- Gjenta periodisk trinn 1.1-1.3 gjennom hele eksperimentet for å oppnå tilstrekkelige, nyskapende fluer som input for"Etablering av parringsflasker for produksjon av standardiserte premierte kvinner" (trinn 4).
2. Etablering av kulturer for innsamling av mannlige testpersoner
- Forbered normal mat 16 , laget med 0,5% (vekt / volum) agar, 2,75% (vekt / volum) gjær, 5,2% (vekt / volum) kornmel, 11% (vekt / volum) sukker, 0,05% ) Metylparaben og 0,5% (vol / vol) propionsyre i vann, som beskrevet i trinnene 1.1 og 1.2. Lukk de 175 ml plastflasker med en flaskflaskeplugg.
- På dag -10 ( tabell 1 ), plasser ca 10-20 hanner med ca. 30-75 jomfruhunner ( Materialer / Utstyrstabell ) i hvert 175 ml hetteglass som inneholder normal mat. Legg til et filterpapir for å øke overflaten for pupering og for å maksimere produktiviteten.
- Opprett tre til seks 175 ml hetteglass per genotype for å oppnå det nødvendige antall testpersoner menn.
MERK: Flere hetteglass kan være nødvendig, avhengig av produktiviteten til ønsket genotype.
3. Fremstilling av boligblokker ( figur 2A )
- Smelt omtrent 50 ml strømtilførsel per husblokk i en mikrobølgeovn, eller lag den frisk.
- Tilsett 500 mikroliter strømforsyning til hver brønn i en 96-brønn, flatt bunnblokk ved hjelp av en pipette med flere pipetter.
- La maten stivne ved romtemperatur.
- Dekk blokkene med PCR-limfilm og bruk en nål for å lage minst 4 hull per brønn for å gi frisk luft til fluene.
- For å kunne åpne hver brønn, bruk et knivblad for å kutte limfilmen i lengderetningen mellom hver rad. La filmen være intakt i den ene enden av blokken.
- Blokkene kan lagres ved 4 ° C i opptil 2 dager.
MERK: Tillat blokkene å balansere til romtemperatur før bruk.
4. Etablering av parringsflasker for produksjon av standardpregede kvinner
- På dag -1, fjern ogKast alle voksne wildtype fluer fra premierte kvinnelige samlingskulturer ved 2-5 timer BLO.
- Samle fluer ved hjelp av aspiratoren ( figur 2B ) fra disse hetteglassene i 2- til 3-timers intervaller ( f.eks. Ved 30 min, 2,5 timer og 5 timer ALO) og plasser dem i et nytt hetteglass med strømtilførsel supplert med en liten mengde gjær Lim inn og filtrer papir.
- For å unngå overbelastning og for å fremme en optimal parringsatmosfære, ikke overfør mer enn 150-200 fluer til hvert nytt hetteglass. Sørg for parring av alle kvinner ved å gi minst 25% hanner. Sørg for at tilstrekkelige kvinner er tilstede i parringsflasker for å imøtekomme størrelsen på forsøket.
MERK: Siden dette er et avgjørende skritt i protokollen, må du sørge for at bare nyoppløste fluer og ingen gamle fluer, larver eller pupper overføres til det nye paraplyet. - Inkubér disse "paringshettene" i fire dager for å gi nok tid til at alle kvinner har parret.
5. ColLeksjon av mannlige testpersoner
- På dag 1 ( tabell 1 ) ved 2-3 timer BLO, bruk CO 2 for å fjerne alle voksne fluer fra hylsene til mannlig oppsamling (trinn 2), Men la flere fluer eclose over de neste timene.
- I løpet av de neste 5-6 timer, fjern nyluftede fluer hver 20-30 minutter med CO 2 og sett hver mann i en enkelt brønn i husblokken (trinn 3) ved hjelp av aspiratoren ( figur 2B ).
- Forsegl brønnen med den klebende PCR-filmen.
MERK: Dette er et viktig skritt i protokollen. Mennene skal samles ofte. Innsamlede hanner skal isoleres i boligblokken i nærheten av tidspunktet for eclosion, når de viser blek pigmentering og tilstedeværelsen av mekoniet i den gjennomskinnelige buken.
MERK: Lett bruk av aspiratoren tillater overføring av fluer; Uegnet bruk vil imidlertid understreke fluene, forårsaker varians i analysen (se diskusjonen). - Sikt mot coLlect opptil 48 menn per genotype. Dette gir et lite overskudd til det maksimale antall menn som trengs for analyse av både naive og trente forhold, noe som tillater noe tap under senere overføringstrinn.
6. Trening
- Fjern fluene fra paringsflasken (trinn 4.2) ved å bruke CO 2, og skill de premierte kvinnene fra hannene.
- Ved hjelp av aspiratoren, legg til en enkelt bedøvet, premiert kvinne til hver brønn i en rad av en ny boligblokk.
- Ved å bruke aspiratoren og uten anestesi, overfør en individuell naiv mann fra husblokken satt opp i trinn 5.2 til brønnen som inneholder en premasert kvinne. Etter at hanen er plassert i brønnen, forsegles umiddelbart med limfilmen; Ikke la hannen flykte.
MERK: Overfør hanflyvninger fra aspiratoren til boligblokken ved å utnytte sin naturlige "negative geotaksis" -adferd (se diskusjonen). - Gjenta trinnene6,2-6,3 til det er nok mannlige par til å bli etablert. Ideelt sett etablerer du 24 par, to fulle rader av en boligblokk, per genotype. La de resterende naive mennene i den originale boligblokken settes opp i trinn 5.2.
- La mannhunnsparrene stå uforstyrret i treningsperioden ( tabell 2 , figur 1B ).
MERK: I løpet av denne tiden vil mannen avvises og bli avvist av den premierte kvinnelige. For læring og STM er treningsperioden 1 time og for LTM er treningsperioden 7-9 timer. - Avslutt trening ( Tabell 2 , Figur 1B ) ved å bruke en aspirator for å forsiktig skille hannen fra den premierte hunen; Ikke bruk anestesi. Plasser den separerte hanen i en ny boligblokk.
- Bruk aspiratoren til å overføre alle naive menn forsiktig og uten anestesi fra husblokken satt opp i trinn 5.2 til en ny boligblokk.
MERK: Dette trinnet er valgfritt for STM og LEARning, men det er veldig viktig for LTM fordi fluene er plassert i ytterligere 24 timer for å teste LTM. - For STM og LTM, la mennene hvile i henholdsvis 1 time og 24 timer ( tabell 2 , figur 1B ) før testing (trinn 7).
- For å lære, test straks de trente og naive mennene (trinn 7).
7. Testing
- Samle fluer fra parringsflasker (trinn 4.2) ved å bruke CO 2 og skille premierte kvinner fra hannene.
- La hunnene komme seg fra anestesien i minst 1 time i et hetteglass med vanlig mat.
- Monter videoopptakeren på forhånd ( figur 2C ) for å få alt utstyr klart før testingen starter.
- Start testingen i henhold til de forskjellige tidslinjer for læring, STM og LTM ( Tabell 2 , Figur 1B ). Utfør testing straks etter treningFor læring, 1 time etter trening for STM, og 24 timer etter trening for LTM.
- Ved hjelp av aspiratoren, overfør forsiktig en mannlig mann fra hvilemodusblokken eller fra treningshusblokken dersom læringen blir testet (trinn 6.7, utdannet, trinn 6.8, naivt) til halvparten av en voldsomhetsarena med dividereren stengt ( figur 2D , Se Fil S1 for en byggeplan).
MERK: Bruken av den naturlige "negative geotaksis" -adferdigheten bør være tilstrekkelig til å overføre mannlige fluer fra aspiratoren til domstolsarenaen (Diskusjon). - Raskt, men forsiktig flytte inngangshullet til neste arena og gjenta trinn 7.5 til alle 18 arenaer inneholder en mann.
- Bruk aspiratoren og uten CO 2 , tilsett en premassert kvinne (samlet i trinn 7.2) til den andre halvdelen av alle 18 arenaer.
- Legg forsiktig kammerkammeret under kameraet, med åpningen av brønnene nedover ( figur 2C
- Fjern delaren av arenaene for å tillate direkte samspill mellom hannene og premierte kvinner.
- Begynn umiddelbart å registrere oppførelsen i minst 10 minutter.
MERK: Ved bruk av et to-kameraoppsett kan parallellopptaket av to festeskilt gjøres i overlappende tidsrammer for å maksimere effektiviteten. - Tøm advokatarenaene med en håndholdt støvsuger og la domstolskammeret ventilere før gjenbruk.
- Gjenta trinn 7.4-7.11 til testen av alle genotyper og forhold ( dvs. naiv og trent) er fullført.
8. Video data analyse og statistikk
- Beregn courtship-indeksen (CI), definert som prosentandelen av tiden som mannlige baner i løpet av de første 10 minuttene av testperioden, for hver enkelt mannlig flyve.
MERK: Dette kan gjøres manuelt ved å observere stereotyp frieriadferd ( Figur 1A ) eller av degSynge dataprogramvare for automatisert kvantifisering av opphavsrettsadferd (Diskusjon).
MERK: Det anbefales å analysere 40-60 hanner per tilstand i løpet av tre dager for å oppnå tilstrekkelig statistisk kraft og for å bedømme konsistensen av CI-dataene. - Beregn læringsindeksen (LI), definert som prosentvis reduksjon i gjennomsnittlig CI for trente menn sammenlignet med naive menn (LI = (CI naiv - CI trent ) / CI naiv ). Vurder LI for hver testdag og sammenlign den med den kumulative LI beregnet fra alle testdager kombinert.
- Lag en egen to-kolonne fanedatabase med "Genotype" og "CI" som overskriftene.
MERK: Disse overskriftene er saksfølsomme. Navnet på genotypen for hvert CI må bestå av en beskrivelse av genotypen etterfulgt av en underskrift og treningstilstanden ( f.eks. Genotype_N og genotype_LTM, etc., der N = naiv og LTM = lang sikthukommelse; Se tilleggsfil S2 for et eksempel). Denne annotasjonen er viktig, da funksjonalarmene identifiserer trente og naive fluer basert på tegnene som er tilstede etter den første underskriften i kolonnen "Genotype". - Bruk analearn R-skriptet (Supplemental File S3) til å utføre en randomiseringstest for å bedømme den statistiske signifikansen av forskjeller mellom LI-verdiene fra forskjellige genotyper.
- Kilde skriptet (Supplemental File S3) i R 18 , som definerer en funksjon som heter "analearn."
MERK: Funksjonsdefinisjonen er: analearn <- funksjon (nboot = 10.000, naivevel = 'N', refmutation = NA, datnavn = NA, header = TRUE, seed = NA, writeoutput = TRUE). - Start funksjonen ved å skrive "analearn ()" i R-kommandolinjen og velg datafilen som skal analyseres (produsert i trinn 8.3) via popup-vinduet.
- Velg referansemutasjonen, somEr kontrollgenotypen ved å taste inn det tilsvarende nummeret og trykke på enter.
MERK: Etter at du har valgt referansegenotypen, tar skriptet flere sekunder for å utføre 10.000 oppstartsprosemplarer. - Se utgangstabellen (tabell 3), som inneholder genotypen, læringsbetingelsen ( dvs. læring, STM eller LTM), gjennomsnittlig CI naiv, gjennomsnittlig CI trent, LI, forskjellen mellom kontrollen LI i forhold til eksperimentell tilstand (LI dif), den nedre grensen (LL) og øvre grense (UL) av 95% konfidensintervallet for LI dif, og p- verdien indikerer sannsynligheten for at det ikke er noen signifikant forskjell.
MERK: analearn lagrer en utgående tekstfil i katalogen der datafilen er plassert. Utgangstabellen vises imidlertid også i R-Studio-konsollen. Standardnavnet er konstruert basert på navnet på den oppgitte datafilen. - Det er flere argumenter i analearn-funksjonen som kan brukes til å endre deFeilinnstillinger for funksjonen for å justere parametrene for oppstartstrapping.
MERK: "nboot" definerer antall bootstrap-replikater og er satt til 10 000 som standard. Denne verdien kan endres til et heltall som er større enn null. Tabell 5 angir flere argumenter som kan brukes til å endre standardinnstillingene til funksjonen. Det anbefales imidlertid ikke å bruke data som er produsert med et lavt antall bootstrap-replikater.
- Kilde skriptet (Supplemental File S3) i R 18 , som definerer en funksjon som heter "analearn."
Representative Results
Feilsøkingsanalysen kan brukes til å måle læring og minne i Drosophila . For å demonstrere dette, analyserer resultatene som presenteres her STM og LTM i kontrollfluer sammenlignet med fluer med den neuron-spesifikke nedslagningen av Dhap-at. Kontroll menn uttrykker en RNA interferens hårnål sekvens rettet mot et Caenorhabditis elegans-spesifikt gen, formodet sinkfinger protein C02F5.12 19 . Denne kontrollstammen sikrer et lik antall oppstrøms aktiverende sekvens (UAS) -elementer mellom knockdown og kontroll i samme genetiske bakgrunn, og kontrollen RNAi hårnål står for eventuelle ikke-spesifikke effekter av RNAi-systemet. Kontroller hanner (genotype: UAS-dcr2 / +; P {KK108109} VIE-260B / +; elav-Gal4 / + ) viser en signifikant reduksjon i CI i opplært versus naivt for begge STM ( Figur 3A , p = 1,2 x 10 - 4 , Mann-WhitneY-test) og LTM ( figur 3B , p = 1,2 x 10-4 , Mann-Whitney U-test). Dette resultatet reflekterer den normale kapasiteten for læring og minne i disse fluene. Dhap-at- knockdown-fluer (genotype: UAS-dcr2 / +; P {KK101437} VIE-260B / +; elav-Gal4 / + ) viser også en signifikant reduksjon av CI i trente versus naive fluer for STM ( Figur 3A , p = 1,2 x 10-4 , Mann-Whitney U-test). Imidlertid viser de ikke en signifikant reduksjon i CI etter LTM-trening ( Figur 3B , p = 0,33, Mann-Whitney U-test). Mann-Whitney U-testen ble brukt til å sammenligne gjennomsnittlig CI for naive og trente fluer på grunn av den ikke-parametriske fordeling av CI-dataene under noen betingelser ( Figur 3A og 3B ). Forskjellene observert gjennom analysen av CI er reflektert av LI for hver genotype, som måler prosentreduksjonenPå CI i naiv versus trente fluer ( figur 3C ). Det er ingen signifikant forskjell i LI mellom kontroller og Dhap-at knockdown fluer for STM ( p = 0.115, 10.000 bootstrap replikater, Figur 3C , Tabell 3 ), mens LI for LTM er signifikant lavere i Dhap-at knockdown fluer ( p = 0,0034, 10 000 oppstartsreplikater, Figur 3C , Tabell 3 ). For sammenligning av LI mellom genotyper, ble en randomiseringstest 20 tilpasset fra en metode først anbefalt av Kamyshev et al. 7 ble brukt. Siden LI er en enkelt verdi avledet fra populasjonsdata ( dvs. gjennomsnittlig CI-naiv og gjennomsnittlig CI-utdannet), gjelder ikke standard statistiske metoder som er avhengige av eksperimentelt avledede fordelinger. Randomiseringstesten er distribusjonsfri og bruker bootstrapping ( dvs. tilfeldig sampliNg med erstatning) for å generere hypotetiske datasett som er avledet fra de faktiske dataene. Analearn scriptet (File S3) genererer et sett med hypotetiske LIer for hver genotype og beregner forskjellen mellom kontrollen og testgenotypen (LIdiff). Denne prosessen gjentas 10.000 ganger, og de resulterende verdiene brukes til å bestemme 95% konfidensintervallet for LIdiff ( tabell 3 ). Disse dataene brukes til å generere en p- verdi som indikerer sannsynligheten for at LI av de to genotypene er forskjellig. Resultatene som vises her viser at Dhap-at er nødvendig i nevroner for LTM, men ikke for STM.
For å kontrollere for den daglige variabiliteten, sammenlignes CI og LIer mellom replikatdager ( Tabell 4 ). Selv om noen svingninger i LI observeres fra dag til dag, er resultatene generelt reproduserbare. Det er viktig å merke seg at CI-data kan variere sterkt avhengig av kontrollstrengenBruk og miljøtilstanden for testing. CI-dataene som er vist her, er typiske for denne kontrollgenotypen, men andre genotyper kan vise høyere eller lavere gjennomsnittlig CI og distribusjon.
Figur 1: Bestemmelse av domstolsindeks og eksperimentell oversikt. ( A ) Bilder som viser stereotypisk mannlig oppførsel mot en kvinnelig flyve. Forskjellige stadier av oppførsel er vist: orientering (I), etter (II), vingsvibrasjon (forlengelse) og tapping (III), slikking (IV) og forsøk på kopiering (V). ( B ) Skjematisk oversikt over trenings- og testtider i forhold til inkubatorlys-syklusen, merket i timer. Opplæringstider er angitt med stenger, hvileperioder for STM og LTM er indikert med en strekket linje, og test startpunktet er angitt som en pil. Legg merke til atTesttid for LTM er dagen etter etter trening. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Utstyr brukt til Drosophila Courtship Conditioning Assay. ( A ) Husblokken er en flat, bunnblokk med 500 μl strømtilførsel per brønn. Den er forseglet med en qPCR-klebende film med minst 4 hull per brønn som ble opprettet ved hjelp av en sprøytenål med en diameter på 0,8 mm. Individuelle rader kuttes i lengderetningen i strimler ved hjelp av et knivblad for å tillate åpning og lukking. ( B ) Aspiratoren er nødvendig for forsiktig overføring av han- og kvinnelige fluer uten bruk av anestesi. Innlegget viser spissen av aspiratoren, lukket med et stykke bomull til keEp fluene i spissen. ( C ) Oppsett av et to-kamera system for samtidig registrering av to frieri-kamre. ( D ) Et domstolskammer med 18 arenaer. Glidebrytende hull brukes til å legge fluene i arenaene. De hvite skillelinjene kan åpnes samtidig for å starte samspillet mellom menn og kvinner. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Analyse av STM og LTM i Control og Dhap-at Knockdown Fluer. ( AB ) Boxplotter som viser fordelingen av CI-verdier for naive (N) og trente (T) fluer av kontrollen (grå) og Dhap-at knockdown (hvite) genotyper testet for STM (A) og LTM (B). ( C ) CorrespoNding LI verdier for kontroll og Dhap-at knockdown fluer testet for STM og LTM. Forskjeller i LI mellom kontroll- og knockdowngenotyper ble sammenlignet ved hjelp av en randomiseringstest (10.000 bootstrap replikater). Feilbjelker angir standardfeilen til gjennomsnittet avledet fra LI-verdiene beregnet på forskjellige testdager. Genotypene er: w +, UAS-dcr2 / + ; P {KK108109} VIE-260B / + ; Og elav-gal4 / + (kontroll) Og w +, UAS-dcr2 / + ; P {KK101437} VIE-260B / +; Og elav-Gal4 / + ( Dhap-at- RNAi). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Generell | Samle inn | Tog | Test | |
| Dag -11 | Start premierte kvinnelige samlingskulturer (trinn 1.3) | |||
| Dag -10 | Start kulturer for innsamling av mannlige testpersoner (trinn 2.2) | |||
| dag 1 | rep. 1 | |||
| Dag 2 | rep. 2 | |||
| Dag 3 | rep. 3 | |||
| Dag 4 | rep. 4 | rep. 1 | ||
| Dag 5 | rep. 2 | rep. 1 | ||
| Dag 6 | rep. 3 | rep. 2 | ||
| Dag 7 | rep. 4 | rep. 3 | ||
| Dag 8 | rep. 4 | |||
| Dag 9 | Video data analyse og statistikk (trinn 8) | |||
| Rep = gjenta | ||||
Tabell 1 : Eksempel Tidslinje for å teste LTM over tre replikater på individuelle dager.
| læring | STM | LTM | |
| Trenings tid | 1 time. | 1 time. | 8 timer. |
| Hviletid | 0 timer. | 1 time. | ~ 24 timer. |
| Start trening | 0h. ALO | 0 timer. ALO | 4 timer. BLO |
| Slutte å trene | 1 time. ALO | 1 time. ALO | 4 timer. ALO |
| Start test | 1 time. ALO | 2 timer. ALO | 0 timer. ALO (neste dag) |
| ALO = etter at lysene slås på, BLO = før lysene slås på, STM = korttidsminne, LTM = langtidshukommelse | |||
Tabell 2 : Treningsvarighet, treningstider og testtider for læring, STM og LTM.
| genotype | læring betingelse | CI naiv | CI trent | LI | LI forskjell | Nedre grense (95% konfidensintervall) | Øvre grense (95% konfidensintervall) | p-verdien |
| Kontroll | STM | 0,467 | 0,116 | 0,752 | NA | NA | NA | NA |
| Dhap-at-RNAi | STM | 0,699 | 0,257 | 0,633 | 0,119 | -0,030 | 0.265 | 0,116 |
| Kontroll | LTM | 0,590 | 0,384 | 0,348 | NA | NA | NA | NA |
| Dhap-at-RNAi | LTM | 0,697 | 0,650 | 0,068 | 0.280 | 0,103 | 0,446 | 0,003 |
| Kontroll | Dhap-at-RNAi | ||||||
| Gjennomsnittlig CI naivt | Gjennomsnittlig CI trent | LI | Gjennomsnittlig CI naivt | Gjennomsnittlig CI trent | LI | ||
| STM | Dag 1 | 0,300 | 0,125 | 0,584 | 0,679 | 0.239 | 0,648 |
| Dag 2 | 0,634 | 0,107 | 0,831 | 0.720 | 0,276 | 0.617 | |
| Alle dager | 0,467 | 0,116 | 0,752 | 0,699 | 0,257 | 0,633 | |
| LTM | Dag 1 | 0,590 | 0,441 | 0.252 | 0,630 | 0,646 | -0,027 |
| Dag 2 | 0,640 | 0,363 | 0,432 | 0,709 | 0,710 | -0,002 | |
| Dag 3 | 0,547 | 0,349 | 0,363 | 0,738 | 0,598 | 0.190 | |
| Alle dager | 0,590 | 0,384 | 0,348 | 0,697 | 0,650 | 0,068 |
Tabell 4 : CI- og LI-verdier oppnådd på separate testdager.
| "Naivelevel" bestemmer teksten som vil identifisere naive verdier for hver genotype. Standard er "N", men dette kan endres til noen annen alfanumerisk tekst. |
| "Refmutation" er satt til "NA" (ikke aktuelt) som standard, men kan endres til navnet på kontrollen eller genotypen for å utføre statistiske sammenligninger. Dette vil føre til at sCript å automatisk velge kontrollgenotypen. |
| "Datavn" refererer til navnet på datafilen og kan angis i dette argumentet i stedet for standard filvalg. |
| "Header" kan brukes til å indikere om datafilen inneholder kolonneoverskrifter eller ikke. Standard er "TRUE", men en fil uten overskrifter kan brukes når dette argumentet er endret til "FALSE." |
| "Frø" initialiserer tilfeldig talgeneratoren. Dette er som standard satt til "NA" og sikrer et tilfeldig tall hver gang skriptet brukes. Ved oppstart vil en bootstrap-analyse gi litt forskjellige resultater hver gang det kjøres, selv når du bruker den samme datafilen. Når frøet er spesifisert med et heltall tall som er større enn null, oppnås det samme settet av tilfeldige oppstartsprøver. |
| "skrive ut Sett "kan settes til" TRUE "eller" FALSE "for å bestemme om en utdatafil skal genereres. Standard er "SANT". |
Tabell 5: Argumenter brukt i Analearn-funksjonen som kan endre standardinnstillingene til funksjonen for å justere parametrene for oppstartstrappen
Supplerende fil S1: Byggeplan for et kammerkammer. Filen kan åpnes med ethvert program som tillater .stp-utvidelser (CAD-filer) . Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende fil S2 : Eksempel på en Input-fil for Analearn Script .S2.zip "target =" _ blank "> Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende fil S3 : Analysenavn. Filen kan åpnes med R-studio 18 . Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Rettferdiggjøringsanalysen er et klassisk paradigme for analyse av læring og minne i Drosophila . Protokollen som presenteres her følger den generelle metoden beskrevet tidligere 6 , 7 , 8 , 9, men inkluderer unike aspekter som praktiske retningslinjer, spesialutstyr og et dataanalyseskript 9 , 12 for randomiseringstester. Ved hjelp av denne protokollen er det mulig å analysere store antall fluer parallelt ved bruk av 96-brønn flate bunnblokker ( figur 2A ) for å samle og trene hanner. Blokkene er forseglet med PCR-limfilm, noe som gjør flyene lett tilgjengelige når det er nødvendig. I tillegg tillater de unike domstolskamrene som beskrives her, samtidig parring av 18 mannlige par i et nesten todimensjonalt rom som jegS optimal for videoanalyse. De tilpassede designkamrene er enkle å bruke, og en byggeplan er gitt ( File S1 , Figur 2D ). Denne protokollen, fra etableringen av kulturer som brukes til å samle testpersoner til oppkjøpet av videodata, tar omtrent 20 dager ( tabell 1 ). Ytterligere tid kreves for analyse av videodata. I vår erfaring er STM-analysen ekstremt robust. LTM-analysen er også ganske robust, men det er mer følsom for å forstyrre miljøvariabler og kan derfor være vanskeligere å mestre.
Dyreadferd kan være ganske variabel. Derfor må kritiske trinn i protokollen utføres med forsiktighet for å redusere denne variansen. For det første vil mild bruk av aspiratoren ( Figur 2B ) redusere stresset som kan pålegges ved grov håndtering eller ved å blåse ut for sterkt. En foreslått metode for overføring av individFluer ut av aspiratoren er ved hjelp av negative geotaksier. Som fluer har en tendens til å gå opp, kan man bare peke toppen av aspiratoren opp; Like før flyet når tippet, er det et forsiktig slag for å la flyet ut. I tillegg, for å la mennene komme inn i domstolskamrene før testing, er det ofte ikke nødvendig med et slag.
Et annet viktig skritt er innsamling og generering av mannlige testpersoner. Alle menn må samles når de er veldig unge og sosialt naive. Dette kan oppnås ved hyppig samling i toppene i eclosion (trinn 5.2). Hvis menn ikke blir samlet inn i denne stramme tidsrammen, kan de få tidlige sosiale interaksjoner, noe som kan føre til dårlig læring eller høy variasjon i CI. En annen faktor av mannlige testpersoner som bør vurderes er den genetiske bakgrunnen. Ulike genetiske bakgrunner vil utvise forskjellige nivåer av naivt frieri og kan også variere i generell aktivitet eller lokomotorisk evne. Når kompaRing flere genotyper, bør det tas hensyn til genetisk bakgrunn for å unngå disse confounding faktorer som kan påvirke LI score. I tillegg skal distribusjonen av CI-data nøye vurderes. CI-data kan være både parametrisk og ikke-parametrisk, avhengig av genotypen eller andre miljøfaktorer. I noen tilfeller, hvis fordelingen av CI er dramatisk skævt bort fra en normal fordeling, kan det være bedre å bruke median CI enn gjennomsnittet for beregning av LIs. Men i vår erfaring, gjør bruk av median eller gjennomsnittlig CI ikke en forskjell i statistisk fortolkning av dataene, og bruken av gjennomsnittlig CI er vanlig praksis i litteraturen.
For vellykket kriminalitetskonditionering er den aktive avvisningen av mannlige opprørsspørsmål av premierte kvinner avgjørende i treningsperioden. Det er viktig å sikre at premierte kvinnene som brukes i denne analysen, har blitt effektivt parret og erDermed ikke tillater kopiering. Denne forutsetningen er etablert i de parringsflasker som er fremstilt i trinn 4, hvor hanner og hunner flyter sammen i 4 dager ( tabell 1 ). Etterfølgende kan parring overvåkes ved regelmessig undersøkelse av testvideoer og ved å observere mannlige par under treningen. Hvis parring skjer, er det flere tiltak som kan tas under forberedelse av premierte kvinner. Først bør premierte kvinner bli oppdrettet under optimale avlssituasjoner. Beholdere kan suppleres med gjærpasta og et brettet filterpapir for å øke potensielle parringsflater. Inkubasjonen av fluer under de forhold som er beskrevet her har produsert robuste premierte hunner tidligere, men dette kan variere i forskjellige laboratorier og ved bruk av forskjellige genetiske stammer. Derfor kan det være nødvendig å optimalisere genereringen av premierte kvinner ved å variere inkubasjonstiden og betingelsene.
Kvantifisering av opphavsrett erEt annet kritisk trinn i denne protokollen. Dette kan gjøres manuelt eller automatisk ved hjelp av spesialiserte programvare 9 . Automatisert kvantifisering er rask og i prinsippet upartisk. Flere programmer har blitt publisert 21 , 22 , 23 ; De er imidlertid ikke enkle å bruke, og krever ofte spesialiserte videoformater og avanserte beregningsevner. Manuell kvantifisering er enkel og nøyaktig, men den er svært arbeidsintensiv og er underlagt individuell variabilitet og forspenning. Det er viktig å understreke at denne protokollen ikke tilfredsstiller kravene til videoformatering som potensielt er nødvendig for den automatiske kvantifiseringen av CIer. For manuell kvantifisering, bruk en hvilken som helst enkel videoopptaksenhet som har potensial til å produsere en video av tilstrekkelig kvalitet for nøyaktig å observere opphavsrett. For automatisert kvantifisering vil det trolig være annerledesKrav, avhengig av hvilken programvare som brukes, og brukerne bør undersøke dette grundig dersom automatisert kvantifisering er ønsket.
I kombinasjon med de omfattende verktøyene som er tilgjengelige for den genetiske manipuleringen av fluer, gir kriminalprøvningsanalysen en robust avlesning som kan brukes til å dissekere molekylære mekanismer og nevrale nettverk involvert i læring og minne.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi anerkjenner Wien Drosophila Ressursenter for å gi Drosophila- stammene. I tillegg ble aksjer oppnådd fra Bloomington Drosophila Stock Center (NIH P40OD018537) brukt i denne studien. Denne undersøkelsen ble støttet delvis av EUs FP7 omfattende integrerte nettverk Gencodys til KK, HvB og AS og NSERC Discovery og CIHR Project Grants til JMK
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| P{KK101437}VIE-260B | VDRC | 101437 | Dhat-at-RNAi in 60100 background |
| P{KK108109}VIE-260B | - | - | Control-RNAi in 60100 background (gift from K. Keleman) |
| w+, UAS-dcr2/yhh;;elav-Gal4 (III) | - | - | panneuronal driver line |
| Containers for plant tissue culture | VWR | 960177 | 175 mL plastic vials |
| Folded filters | Whatman | 10311643 | Filter paper to enlarge area flies can pupate on |
| Flat-bottom blocks (96-wells) | Qiagen | 19579 | Used for housing blocks |
| MicroAmp Clear Adhesive Film | Applied Biosystems | 4306311 | PCR adhesive film as lid on flat-bottom blocks |
| Razor blade | - | - | Any sharp will do |
| Needle | - | - | 0.8 mm diameter |
| Aspirator | - | - | Cut a 1mL pipet tip with scissors in order to have two pieces. The narrow tip of the pipettip is placed as fly entrance in a ~80 cm flexible hose. To prevent a fly from getting in the hose, a normal piece of cotton or small mesh gaze is placed in between the tip and the hose. The other half of the pipettip can be used as mouth piece at the end of the hose. |
| Courtship chambers | - | - | file S1 can be opened with indicated CAD software |
| Camcorder | Sony | - | camera specification: >4M pixels, full HD. For manual quantification, any simple video recording device has the potential to produce a video of sufficient quality to observe courtship behavior accurately. For automated quantification, there will likely be different requirements depending on the software to be used, and users should investigate this thoroughly if automated quantification is desired. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| power food | |||
| Agar | Sigma | A7002 | |
| Yeast | Bruggeman | - | |
| Yeast extract | MP biomedicals | 0210330391 | |
| Peptone | Sigma | P6838 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | |
| CaCl2 | Merck | 1023780500 | |
| Methylparabene (CAUTION) | Sigma | H5501 | |
| Propionic acid (CAUTION) | Sigma | P1386 | |
| Demineralized water | - | ||
| Yeast paste | - | yeast grains and water mixture in a 1:1 ratio | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| normal food | |||
| Agar | MP biomedicals | 215017890 | |
| Yeast | bruggeman | - | |
| Corn flour | de Molen | - | |
| Sugar | de Molen | - | |
| Methylparabene (CAUTION) | Sigma | H5501 | |
| Propionic acid (CAUTION) | Sigma | P1386 | |
| Demineralized water | - |
References
- Quinn, W. G., Harris, W. A., Benzer, S. Conditioned behavior in Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 71, 708-712 (1974).
- Livingstone, M. S., Sziber, P. P., Quinn, W. G. Loss of calcium/calmodulin responsiveness in adenylate cyclase of rutabaga, a Drosophila learning mutant. Cell. 37, 205-215 (1984).
- Quinn, W. G., Sziber, P. P., Booker, R. The Drosophila memory mutant amnesiac. Nature. 277, 212-214 (1979).
- Dudai, Y., Jan, Y. N., Byers, D., Quinn, W. G., Benzer, S. dunce, a mutant of Drosophila deficient in learning. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 73, 1684-1688 (1976).
- Dubnau, J., Tully, T. Gene discovery in Drosophila: new insights for learning and memory. Annu. Rev. Neurosci. 21, 407-444 (1998).
- Siegel, R. W., Hall, J. C. Conditioned responses in courtship behavior of normal and mutant Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 76, 3430-3434 (1979).
- Kamyshev, N. G., Iliadi, K. G., Bragina, J. V. Drosophila conditioned courtship: two ways of testing memory. Learning & memory. 6, 1-20 (1999).
- McBride, S. M., et al. Mushroom body ablation impairs short-term memory and long-term memory of courtship conditioning in Drosophila melanogaster. Neuron. 24, 967-977 (1999).
- Keleman, K., Kruttner, S., Alenius, M., Dickson, B. J. Function of the Drosophila CPEB protein Orb2 in long-term courtship memory. Nature Neurosci. 10, 1587-1593 (2007).
- Hall, J. C. The mating of a fly. Science. 264, 1702-1714 (1994).
- Keleman, K., et al. Dopamine neurons modulate pheromone responses in Drosophila courtship learning. Nature. 489, 145-149 (2012).
- Kramer, J. M., et al. Epigenetic regulation of learning and memory by Drosophila EHMT/G9a. PLoS Biol. 9. 9, e1000569 (2011).
- Ishimoto, H., Sakai, T., Kitamoto, T. Ecdysone signaling regulates the formation of long-term courtship memory in adult Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 6381-6386 (2009).
- Kochinke, K., et al. Systematic Phenomics Analysis Deconvolutes Genes Mutated in Intellectual Disability into Biologically Coherent Modules. Am. J. Hum. Genet. 98, 149-164 (2016).
- Buchert, R., et al. A peroxisomal disorder of severe intellectual disability, epilepsy, and cataracts due to fatty acyl-CoA reductase 1 deficiency. Am. J. Hum. Genet. 95, 602-610 (2014).
- JoVE Science Education Database. Essentials of Biology 1: yeast, Drosophila and C. elegans. Drosophila Maintenance. JoVE. , Cambridge, MA. (2017).
- JoVE Science Education Database. Essentials of Biology 1: yeast, Drosophila and C. elegans. An Introduction to Drosophila melanogaster. JoVE. , Cambridge, MA. (2017).
- R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna (Austria). (2016).
- Stepien, B. K., et al. RNA-binding profiles of Drosophila CPEB proteins Orb and Orb2). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 113, E7030-E7038 (2016).
- Basu, D. Randomization Analysis of Experimental Data: The Fisher Randomization Test. J Am Stat Assoc. 75, 575-582 (1980).
- Dankert, H., Wang, L., Hoopfer, E. D., Anderson, D. J., Perona, P. Automated monitoring and analysis of social behavior in Drosophila. Nat Methods. 6, 297-303 (2009).
- Reza, M. A., et al. Automated analysis of courtship suppression learning and memory in Drosophila melanogaster. Fly. 7, 105-111 (2013).
- Schneider, J., Levine, J. D. Automated identification of social interaction criteria in Drosophila melanogaster. Biol. Lett. 10, 20140749 (2014).
