Summary
Detta protokoll beskriver en Drosophila- lärande- och minnesanalys som kallas förbandskonditionering. Den här klassiska analysen är baserad på en minskning av manliga förhörsbeteenden efter sexuell avvisning av en icke-mottaglig premierad kvinna. Denna naturliga form av beteendets plasticitet kan användas för att testa inlärning, korttidsminnet och långsiktigt minne.
Abstract
Många insikter i molekylära mekanismer som ligger till grund för lärande och minne har blivit upplysta genom användning av enkla beteendeanalyser i modellorganismer som fruktflugan , Drosophila melanogaster . Drosophila är användbar för att förstå de grundläggande neurobiologiska underliggande kognitiva underskotten som härrör från mutationer i gener som är förknippade med humana kognitiva störningar, såsom intellektuell funktionsnedsättning (ID) och autism. I det här arbetet beskrivs en metod för testning av inlärning och minne med hjälp av ett klassiskt paradigm i Drosophila som kallas förkämpning. Mannen flyger domstolshonor med ett distinkt mönster av lätt igenkännliga beteenden. Förkönade kvinnor är inte mottagliga för parning och kommer att avvisa manens samlingsförsök. Som svar på detta avslag reducerar manliga flugor sitt fängelsemönster. Denna inlärda minskning i fängelsepåverkan mäts över tid, som tjänar som en indikator på lärande och minne. Den grundläggande nummenRical utmatning av denna analys är courtship index (CI), som definieras som den procentandel av tid som en man tillbringar hovar under ett 10 min intervall. Inlärningsindexet (LI) är den relativa minskningen av CI i flugor som har blivit utsatta för en premierad kvinna jämfört med naiva flugor utan tidigare sociala möten. För statistisk jämförelse av LIs mellan genotyper används ett randomiseringstest med bootstrapping. För att illustrera hur analysen kan användas för att ta itu med rollen av en gen relaterad till inlärning och minne, karakteriserades den pan- neuronala knockdownen av dihydrohydroacetonfosfatacyltransferas ( Dhap-at ) här. Den mänskliga ortologen för Dhap-at , glycerolfosfat-O-acyltransferas ( GNPT ), är involverad i rhizomelic chondrodysplasia punctata type 2, ett autosomalt recessivt syndrom som kännetecknas av svårt ID. Med hjälp av förhörskonditioneringsanalysen bestämdes att Dhap-at krävs för långsiktigt minne, men inte förkorttidsminne. Detta resultat utgör grunden för ytterligare undersökning av de underliggande molekylära mekanismerna.
Introduction
De molekylära mekanismerna som ligger till grund för lärande och minne är bevarade genom många arter. Det banbrytande arbetet som screenar Drosophila melanogaster-mutantlinjer för defekter i olfaktoriskt lärande och minne har gett nyckelmolekylär insikter i processerna som ligger till grund för lärande och minne 1 . Dessa studier identifierade några av de första gener som är involverade i lärande och minne, såsom rutabaga 2 , amnesiac 3 och dunce 4 , vilket avslöjar en kritisk roll för signalering av cyklisk adenosinmonofosfat (cAMP) 5 .
Tidiga genetiska skärmar för minnesmutanter genomfördes primärt med användning av olfaktorisk konditionering. Men flera metoder för att mäta andra former av inlärning och minne har uppstått över tiden. Ett av de mest använda lärande- och minnesparadigma, och analysen som beskrivs här, är känd som cVårtship-konditionering, som först beskrivits av Siegel och Hall 6 och senare raffinerades av flera andra forskargrupper 7 , 8 , 9 . Courtship-konditionering är beroende av närvaron av en specifik feromon, cis- va-acetylacetat (cVA), på kvinnliga buken, som avsätts av hanen under sampolymerisering. Sensing cVA på kvinnliga buken reducerar naturligt fängelsepåverkan, och när det kombineras med kvinnans avvisningshandling, är effekten av cVA på manlig farkostminskning dramatiskt förbättrad. Svaret hos manliga flugor i denna analys kan enkelt kvantifieras genom att man observerar sitt distinkta uppträdande beteende, vilket kännetecknas av att man riktar sig mot och följer honan, knackar, sträcker sig och vibrerar vingen, slickar och försöker samla 10 ( Figur 1A ). Manliga flugor lär sig att distinguis H mellan mottagliga jungfruliga och icke-mottagliga parade kvinnor 11 och efter sexuell avvisning visar de minskat fientligt beteende mot icke-mottagliga honor i upp till 9 dagar 8 . Detta naturliga beteende kan användas för att belysa de mekanismer som ligger bakom lärandet, korttidsminnet (STM) och det långsiktiga minnet (LTM) 8 , 9 , 12 . Inlärning definieras som den omedelbara minskningen av fientligt beteende som uppträder under träningsperioden och kallas ofta omedelbart återkallande minne, uppmätt 0 - 30 min efter exponering för en parat kvinna 6 , 8 . STM mäts mellan 30 min och 1 h efter träning, medan LTM oftast mäts 24 h efter träning 8 ( Figur 1B ). STM kan induceras med en 1-h träningsperiod, men den varar bara i 2-3 timmarS = "xref"> 6 , 8 . I de flesta inlärningsparadigmer kan LTM endast induceras genom avvikande upprepningar av upprepad träning. Mcbride et al . (1999) 8 visade att tre distanserade 1-timmars träningssessioner var tillräckliga för att inducera förbandsminnet varar i upp till 9 dagar, i motsats till 2-3 h framkallade av en enda 1 h träningspass. McBride et al . 8 visade också att en enda 5-timmars träningspass resulterade i ett liknande LTM-svar i upp till 9 dagar. Fluor löper inte ständigt under denna 5-timmarsperiod, och producerar i själva verket sin egen åtskilda träning för att inducera LTM i en enda träningspass. Detta är mycket viktigt ur praktiskt perspektiv, vilket väsentligt ökar den lätthet som denna analys kan användas för att undersöka LTM. Nuvarande protokoll använder övervägande en enda träningspass på 7-h för LTM 11 , 12 . Flera studier har undersökt olikaMutanta förhållanden som har specifika defekter i olika aspekter av förhörsinlärning. Till exempel påverkar svampkroppablationen STM och LTM, men inte lärande 8 . Mutationer i amnesiacgenen, som först definierades som en specifik minnesregulator med hjälp av olfaktorisk konditionering 3 , påverkar STM men inte lär sig 6 . Störning av översättningsregulatorn orb2 (oo18 RNA-bindande (orb) CPEB2-subfamilj) och ecdyson-signalering uteslutande påverkar LTM 9 , 13 . Kriminalvårdskonditionering är således ett användbart paradigm för att dissekera mekanismerna bakom de olika stadierna av lärande och minne.
Det här arbetet visar en optimerad experimentell inställning som möjliggör en relativt hög genomströmningstestning av kriminalvårdskonditionering. Dessutom beskriver det ett statistiskt analysskript och diskuterar kritiska faktorer i analysen. Det är shÄger här att Drosophila - gendihydroxiacetonfosfatacyltransferaset ( Dhap-at ) Krävs i neuroner för LTM, men inte för STM. Den mänskliga orthologen av denna gen, glyceronfosfat-O-acyltransferas ( GNPAT ), muteras i rhizomelic chondrodysplasia punctata type 2 14 , en autosomal-recessiv sjukdom som kännetecknas av svår intellektuell funktionsnedsättning, anfall och flera andra kliniska egenskaper 15 . I detta sammanhang kan kriminalvårdsbehandling användas för att funktionellt validera rollen som mänskliga sjukdomsgener i lärande och minne, vilket utgör grunden för mekanistiska studier.
Protocol
OBS! I protokollet som beskrivs nedan beskrivs en replik av samling, träning och testning. För att testa reproducerbarheten av resultaten, bör dessa steg upprepas parallellt, på flera dagar och med separata grupper av flugor ( Tabell 1) . Protokollet är baserat på en livslängd på 10 dagar från ägg till vuxen, vilket är normalt vid uppfödning av flugor under konstanta förhållanden av 25 ° C, 70% fuktighet och en 12 h ljus / mörk cykel. Alla aspekter av detta protokoll förutsätter att villkoren hålls konstanta under hela analysen. Tiderna är angivna som timmar innan lamporna tänds (BLO) eller efter att lamporna slås på (ALO) i inkubatorn, eftersom det här bekvämt kan ställas in beroende på forskarens föredragna tidpunkt. Använd endast CO 2 -gas för den första insamlingen av naiva manliga flugor och för uppsamling av premierade honor. Detta protokoll för förhörskonditionering består av följande steg:
- EEtablering av premierade kvinnliga samlingskulturer
- Etablering av kulturer för insamling av manliga testpersoner
- Förberedelse av bostadshus
- Upprättande av paraplyflaskor för produktion av standardiserade premerade kvinnor
- Insamling av manliga testpersoner
- Utbildning
- Testning
- Videodata analys och statistik
1. Upprättande av förkroppsliga kvinnliga samlingskulturer
- Förbered energiförbrukning 16 . Koka 0,8% (vikt / volym) agar, 8% (vikt / vol) jäst, 2% (vikt / volym) jästextrakt, 2% (vikt / volym) pepton, 3% (vikt / volym) sackaros, 6% Vikt / volym) glukos, 0,05% (vikt / volym) MgS04 och 0,05% (vikt / volym) CaCl2 i vatten under 15 min. Låt lösningen svalna till 70 ° C innan man tillsätter 0,05% (vikt / volym) metylparaben (VARNING: giftig) och 0,5% (volym / volym) propionsyra (VARNING: giftig). Blanda väl genom omröring under ytterligare kylning till 50 ° C för att erhålla en homogen lösning.
- Innan maten såLäcker vid rumstemperatur, tillsätt ~ 50 ml kraftmat till varje 175 ml plastflaska. Låt maten svalna ytterligare. Stäng flaskan med en plugg.
OBS: Powerfood är en specialiserad matblandning som är formulerad speciellt för produktion av ett stort antal flugor, förmodligen genom att framkalla äggläggning. Powerfood används inte för att producera manliga flugor som kommer att användas för beteendeanalys (steg 2) eftersom atypisk diet och potentiell trängsel kan påverka utvecklingen. - På dag -11 ( Tabell 1 ) startar 5-20 vildtypskulturer med cirka 60-100 flugor (en blandning av män och kvinnor) i flaskor med kraftfood. Dessa kommer att användas i steg 4 för att producera standardiserade premierade honor 17 . Lägg ett filterpapper till varje injektionsflaska för att öka det område som larverna kan poppa på. Detta kommer att öka antalet flugor som kan närma sig.
- Upprepa stegen 1.1-1.3 regelbundet genom experimentet för att erhålla tillräckliga nyslutande flugor som inmatning för"Etablering av parningsflaskor för framställning av standardiserade premierade honor" (steg 4).
2. Etablering av kulturer för insamling av manliga testämnen
- Förbered normal mat 16 , gjord med 0,5% (vikt / volym) agar, 2,75% (vikt / vol) jäst, 5,2% (vikt / volym) majsmjöl, 11% (vikt / volym) socker, 0,05% ) Metylparaben och 0,5% (volym / volym) propionsyra i vatten, såsom beskrivits i steg 1,1 och 1,2. Stäng de 175 ml plastflaskorna med en flaska med flaskflaskor.
- På dag -10 ( tabell 1 ), placera cirka 10-20 män med cirka 30-75 jungfru kvinnor ( Material / Utrustningstabell ) i varje 175 ml injektionsflaska innehållande normal mat. Lägg till ett filterpapper för att öka ytan för pupering och maximera produktiviteten.
- Upprätta tre till sex 175 ml ampuller per genotyp för att erhålla det erforderliga antalet försökspersoner.
OBS! Mer flaskor kan behövas beroende på produktiviteten hos den önskade genenotype.
3. Framställning av husblock ( Figur 2A )
- Smält cirka 50 ml kraftmatning per husblock i en mikrovågsugn, eller förbered den fräsch.
- Tillsätt 500 μl kraftmat till varje brunn i ett 96-brunnsplattblock med en multidispenserpipett.
- Låt maten stelna vid rumstemperatur.
- Täck blocken med PCR-självhäftande film och använd en nål för att göra minst 4 hål per brunn för att ge frisk luft till flugorna.
- För att kunna öppna varje brunn, använd ett rakblad för att skära limfilmen i längdriktningen mellan varje rad. Lämna filmen intakt i ena änden av blocket.
- Blocken kan lagras vid 4 ° C i upp till 2 dagar.
OBS: Låt blocken återjämnas till rumstemperatur före användning.
4. Etablering av parringsflaskor för tillverkning av standardpensionerade kvinnor
- På dag -1, ta bort ochKassera alla vuxna vildtypsvingar från premierade kvinnliga samlingskulturer vid 2-5 h BLO.
- Samla flugor med hjälp av aspiratorn ( Figur 2B ) från dessa injektionsflaskor i intervall av 2- till 3-h ( t.ex. vid 30 min, 2,5 h och 5 h ALO) och placera dem i ett nytt fettflaska med tillsats av tillsats med en liten mängd jäst Klistra in och filtrera papper.
- För att undvika trängsel och för att främja en optimal parringsatmosfär, överför inte mer än 150-200 flugor till varje ny flaska. Se till att alla kvinnor får parning genom att ge minst 25% män. Se till att tillräckligt med honor förekommer i de sammankopplade flaskorna för att rymma experimentets storlek.
OBS! Eftersom detta är ett avgörande steg i protokollet, se till att endast nyskapade flugor och inga gamla flugor, larver eller puppar överförs till den nya paraplyen. - Inkubera dessa "parningsflaskor" i fyra dagar för att ge tillräckligt med tid för att alla honor har parat.
5. ColLektion av manliga testämnen
- På dag 1 ( tabell 1 ) vid 2-3 h BLO, använd CO 2 för att avlägsna alla vuxna flugor från hopsamlingsflaskorna (steg 2), Men låt mer flugor hoppa över de närmaste timmarna.
- Under de närmaste 5-6 timmarna, ta bort nyförslutna flugor var 20-30 minuter med CO 2 och sätt varje man i en individuell brunn i höljet (steg 3) med hjälp av aspiratorn ( Figur 2B ).
- Återförslut brunnen med den självhäftande PCR-filmen.
OBS! Detta är ett viktigt steg i protokollet. Hanarna bör samlas in ofta. Samlade män ska isoleras i bostadshuset nära tidpunkten för eclosion, när de visar blek pigmentering och närvaron av mekonium i den genomskinliga buken.
OBS: Gentag användning av aspiratorn möjliggör överföring av flugor; Emellertid kommer olämplig användning att spänna flugorna, vilket orsakar varians i analysen (se diskussionen). - Syfte med coLlect upp till 48 män per genotyp. Detta ger ett litet överskott till det maximala antalet män som behövs för analys av både naiva och utbildade förhållanden, vilket medger viss förlust under senare överföringssteg.
6. Utbildning
- Ta bort flugorna från den parade flaskan (steg 4.2) med hjälp av CO2 och separera de premierade kvinnorna från männen.
- Använda aspiratorn, lägg till en enda bedövad, förbrukad kvinna till varje brunn i en rad av ett nytt bostadshus.
- Med hjälp av aspiratorn och utan anestesi, överför en enskild naiv man från husblocket som ställts upp i steg 5.2 till brunnen innehållande en förbrukad hona. Efter att hanen är placerad i brunnen, förseglas omedelbart med limfilmen; Låt inte hanen fly undan.
OBS: Överför manliga flugor från aspiratorn till husblocket genom att utnyttja deras naturliga "negativa geotaxis" -beteende (se diskussionen). - Upprepa steg6,2-6,3 tills tillräckligt med manliga och kvinnliga par är etablerade. Idealiskt, skapa 24 par, två fulla rader av ett bostadshus, per genotyp. Lämna de återstående naiva männen i det ursprungliga höljet som ställts in i steg 5.2.
- Låt mankvinnparna vara ostörda under träningsperioden ( Tabell 2 , Figur 1B ).
OBS: Under den här tiden kommer mannen att domstolen och bli avvisad av den föreslagna kvinnan. För lärande och STM är träningsperioden 1 h och för LTM är träningstiden 7-9 h. - Avsluta träningen ( Tabell 2 , Figur 1B ) genom att använda en aspirator för att försiktigt separera hanen från den premierade honan; Använd inte anestesi. Placera den separerade hanen i ett nytt bostadshus.
- Använd aspiratorn för att överföra alla naiva män försiktigt och utan anestesi från det husblock som upprättats i steg 5.2 till ett nytt bostadshus.
OBS: Detta steg är valfritt för STM och LEARning, men det är mycket viktigt för LTM eftersom flugorna är inrymda i ytterligare 24 timmar för att testa LTM. - För STM och LTM, låt männen vila i 1 h och ~ 24 h respektive ( Tabell 2 , Figur 1B ) före provning (steg 7).
- För att lära sig, testa omedelbart de utbildade och naiva männen (steg 7).
7. Testning
- Samla flugor från parningsflaskor (steg 4.2) med hjälp av CO2 och separera de premierade kvinnorna från männen.
- Låt kvinnorna återhämta sig från anestesen i minst 1 h i en flaska innehållande normal mat.
- Montera videobandspelarna i förväg ( Figur 2C ), för att få all utrustning klar innan testningen startar.
- Starta provningen enligt de olika tidslinjerna för inlärning, STM och LTM ( Tabell 2 , Figur 1B ). Utför testning direkt efter träningFör inlärning, 1 h efter träning för STM och 24 h efter träning för LTM.
- Använd aspiratorn genom att försiktigt överföra en enskild man från det vilande bostadsblocket eller från träningsblocket om lärandet testas (steg 6.7, utbildat, steg 6.8, naivt) till hälften av en arresteringsarena med divideraren stängd ( Figur 2D ; Se Arkiv S1 för en byggplan).
ANMÄRKNING: Användningen av det naturliga "negativa geotaxis" -beteendet bör vara tillräckligt för att överföra manliga flugorna från aspiratorn till fördomararenan (Diskussion). - Snabbt men försiktigt flytta ingångshålet till nästa arena och upprepa steg 7.5 tills alla 18 arenor innehåller en man.
- Använd aspiratorn och utan CO2, tillsätt en premierad kvinna (samlad i steg 7.2) till den andra halvan av alla 18 arenor.
- Placera förhörskammaren försiktigt under kameran, med brunnarnas öppning nedåt ( Figur 2C
- Ta bort arenorens delare för att möjliggöra direkt växelverkan mellan män och premierade honor.
- Börja omedelbart spela in beteendet i minst 10 minuter.
OBS! När du använder en tvåkamera-inställning kan parallellinspelningen av två skivplattor utföras i överlappande tidsramar för att maximera effektiviteten. - Töm domstolarna med hjälp av en handhållen dammsugare och låt domkammaren ventilera före återanvändning.
- Upprepa steg 7.4-7.11 tills provningen av alla genotyper och förhållanden ( dvs. naiv och utbildad) har slutförts.
8. Videodataanalys och statistik
- Beräkna courtship indexet (CI), definierat som den procentandel av tiden som manliga domstolar under de första 10 minuterna av testperioden, för varje enskild manlig flygning.
OBS: Det här kan göras manuellt genom att observera stereotypa förhörsbeteenden ( Figur 1A ) eller av digSjunga datorprogramvara för automatisk kvantifiering av domstolsbeteende (Diskussion).
OBS! Det rekommenderas att analysera 40-60 män per tillstånd under tre dagar för att uppnå tillräcklig statistisk effekt och att bedöma konsistensen av CI-data. - Beräkna inlärningsindex (LI), definierat som procentuell minskning i medelvärdet av utbildade män jämfört med naiva män (LI = (CI naiv - CI utbildad ) / CI naiv ). Utvärdera LI för varje testdag och jämföra den med det kumulativa LI beräknat från alla testdagar kombinerat.
- Skapa en separat flikfil med två kolumner med "Genotype" och "CI" som rubrikerna.
OBS: Dessa rubriker är skiftlägeskänsliga. Genotypens namn för varje CI måste bestå av en beskrivning av genotypen följd av ett understreck och träningsförhållandet ( t.ex. genotype_N och genotype_LTM, etc., där N = naiv och LTM = lång siktminne; Se kompletterande fil S2 för ett exempel). Denna anmärkning är nödvändig, eftersom funktionen analearn identifierar utbildade och naiva flyger baserade på de tecken som finns efter den första underskriften i kolumnen "Genotyp". - Använd analearn R-skriptet (kompletterande fil S3) för att utföra ett randomiseringstest för att bedöma den statistiska signifikansen av skillnaderna mellan LI-värdena från olika genotyper.
- Käll manuset (kompletterande fil S3) i R 18 , som definierar en funktion som heter "analearn."
OBS: Funktionsdefinitionen är: analearn <- funktion (nboot = 10,000, naivelevel = 'N', refmutation = NA, datnamn = NA, header = TRUE, seed = NA, writeoutput = TRUE). - Starta funktionen genom att ange "analearn ()" i R-kommandoraden och välj den datafil som ska analyseras (producerad i steg 8.3) via popup-fönstret.
- Välj referensmutation, vilkenÄr kontrollgenotypen genom att ange motsvarande nummer och trycka på enter.
OBS! Efter att ha valt referensgenotypen tar skriptet flera sekunder för att utföra 10 000 bootstrap-replikat. - Observera utdatabordet (Tabell 3), som innehåller genotypen, inlärningsförhållandet ( dvs. inlärning, STM eller LTM), medelvärde CI naivt, medelvärdet CI utbildat, LI, skillnaden mellan kontrollens LI jämfört med försöksförhållandet (LI dif), den nedre gränsen (LL) och den övre gränsen (UL) för 95% konfidensintervallet för LI dif och p- värdet indikerar sannolikheten att det inte finns någon signifikant skillnad.
OBS: analearn lagrar en utdatatekstfil i katalogen där datafilen finns. Utmatningstabellen visas emellertid också i R-Studio-konsolen. Standardnamnet är byggt baserat på namnet på den angivna datafilen. - Det finns flera argument i analearn-funktionen som kan användas för att ändra deFel inställningar för funktionen för att justera parametrarna för bootstrapping.
OBS: "nboot" definierar antalet bootstrap-replikat och är som standard inställd på 10.000. Detta värde kan ändras till ett heltal som är större än noll. Tabell 5 antecknar flera argument som kan användas för att ändra standardinställningarna för funktionen. Det rekommenderas dock inte att använda data som produceras med ett litet antal bootstrap-replikat.
- Käll manuset (kompletterande fil S3) i R 18 , som definierar en funktion som heter "analearn."
Representative Results
Förhörskonditioneringsanalysen kan användas för att mäta inlärning och minne i Drosophila . För att demonstrera detta analyserar resultaten som presenteras här STM och LTM i kontrollflugor jämfört med flugor med den neuronspecifika knockdownen av Dhap-at. Kontrollmanar uttrycker en RNA-interferens hårnålsekvens som riktar sig mot en Caenorhabditis elegansspecifik gen, förmodat zinkfingerprotein C02F5.12 19 . Denna kontrollstam säkerställer ett lika stort antal uppströms aktiverande sekvens (UAS) -element mellan knockdownen och kontrollen i samma genetiska bakgrund, och kontrollen RNAi hårnål står för eventuella icke-specifika effekter av RNAi-systemet. Kontroll män (genotyp: UAS-dcr2 / +; P {KK108109} VIE-260B / +; elav-Gal4 / + ) visar en signifikant minskning av CI i utbildad kontra naiv för båda STM ( Figur 3A , p = 1,2 x 10 - 4 , Mann-WhitneY-U-test) och LTM ( Figur 3B , p = 1,2 x 10-4 , Mann-Whitney U-test). Detta resultat återspeglar den normala kapaciteten för lärande och minne i dessa flugor. Dhap-at- knockdown-flugor (genotyp: UAS-dcr2 / +; P {KK101437} VIE-260B / +; elav-Gal4 / + ) visar också en signifikant minskning av CI i utbildade versus naiva flugor för STM ( Figur 3A , p = 1,2 x 10 -4 , Mann-Whitney U-test). De visar emellertid inte en signifikant minskning av CI efter LTM-träning ( Figur 3B , p = 0,33, Mann-Whitney U-test). Mann-Whitney U-testet användes för att jämföra det genomsnittliga CI för naiva och utbildade flugor på grund av den icke parametriska fördelningen av CI-data för vissa tillstånd ( Figur 3A och 3B ). Skillnaderna observerade genom analys av CIs återspeglas av LI för varje genotyp, vilket mäter procentuella reductiPå CI i naiva mot utbildade flugor ( Figur 3C ). Det finns ingen signifikant skillnad i LI mellan kontroller och Dhap-at-knockdown-flugor för STM ( p = 0.115, 10.000 bootstrap-replikat, Figur 3C , Tabell 3 ), medan LI för LTM är signifikant lägre i Dhap-at- knockdown-flugor ( p = 0,0034, 10 000 bootstrap replikat, Figur 3C , Tabell 3 ). För jämförelse av LI mellan genotyper anpassades ett randomiseringsprov 20 från en metod som först rekommenderades av Kamyshev et al. 7 användes. Eftersom LI är ett enda värde som härrör från befolkningsdata ( dvs. genomsnittlig CI-naiv och medellång CI-utbildad), tillämpas standard statistiska metoder som är beroende av experimentellt härledda distributioner inte. Randomiseringstestet är distributionsfritt och använder bootstrapping ( dvs slumpmässig sampliNg med ersättning) för att generera hypotetiska dataset som härrör från de faktiska data. Analearn-skriptet (File S3) genererar en uppsättning hypotetiska LIs för varje genotyp och beräknar skillnaden mellan kontrollen och testgenotypen (LIdiff). Denna process upprepas 10 000 gånger, och de resulterande värdena används för att bestämma 95% konfidensintervallet för LIdiff ( Tabell 3 ). Denna data används för att generera en p- värde som indikerar sannolikheten för att LI för de två genotyperna är annorlunda. Resultaten som visas här visar att Dhap-at krävs i neuroner för LTM men inte för STM.
För att kontrollera för den dagliga variabiliteten jämförs CI och LI mellan replikerade dagar ( Tabell 4 ). Även om vissa fluktuationer i LI observeras från dag till dag, är resultaten i allmänhet reproducerbara. Det är viktigt att notera att CI-data kan variera mycket beroende på kontrollstrAnvänt och miljöförhållandena för testning. De CI-data som visas här är typiska för denna kontrollgenotyp, men andra genotyper kan uppvisa ett högre eller lägre medelvärde för CI och distribution.
Figur 1: Bestämning av domstolsindex och experimentell översikt. ( A ) Bilder som visar stereotypa manliga åskådningsbeteenden mot en kvinnlig flygning. Olika stadier av förvaltningsbeteende visas: orientering (I), efter (II), vingsvibration (förlängning) och tappning (III), slickning (IV) och försökskopulation (V). ( B ) Schematisk översikt över tränings- och testtider i förhållande till inkubatorljuscykeln, märkt i timmar. Träningstider anges med staplar, viloperioder för STM och LTM anges med streckad linje, och teststartpunkten anges som en pil. Observera attTesttiden för LTM är dagen efter efter träning. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Utrustning som används för Drosophila Courtship Conditioning Assay. ( A ) Höljet är ett platt bottenblock med 500 μL kraftmat per brunn. Den är förseglad med en qPCR-adhesivfilm med minst 4 hål per brunn som skapades med en sprutnål med en diameter på 0,8 mm. Individuella rader skärs längs i remsor med ett rakblad för att tillåta öppning och stängning. ( B ) Aspiratorn krävs för en försiktig överföring av manliga och kvinnliga flugor utan användning av anestesi. Insatsen visar spetsen på aspiratorn, sluten med en bit bomullEp flugorna inom spetsen. ( C ) Uppställning av ett tvåkamera system för samtidig registrering av två fackkammare. ( D ) En domstolskammare med 18 arenor. Sliding entry hål används för att placera flugorna i arenorna. De vita delarna kan samtidigt öppnas för att initiera växelverkan mellan män och kvinnor. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Analys av STM och LTM i Control och Dhap-at Knockdown Fluor. ( AB ) Boxplots som visar fördelningen av CI-värden för naiva (N) och utbildade (T) flugor av kontrollen (grå) och Dhap-at- knockdown (vita) genotyper testade för STM (A) och LTM (B). ( C ) CorrespoNding LI-värden för kontroll och Dhap-at- knockdown-flugor testas för STM och LTM. Skillnader i LI mellan kontroll- och knockdowngenotyper jämfördes med ett randomiseratest (10 000 bootstrap-replikat). Felstavar anger standardfelet för medelvärdet som härrör från LI-värdena beräknat på olika testdagar. Genotyperna är: w +, UAS-dcr2 / + ; P {KK108109} VIE-260B / + ; Och elav-Gal4 / + (kontroll) Och w +, UAS-dcr2 / + ; P {KK101437} VIE-260B / +; Och elav-Gal4 / + ( Dhap-at- RNAi). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
| Allmän | Samla | Tåg | Testa | |
| Dag -11 | Starta premierade kvinnliga samlingskulturer (steg 1.3) | |||
| Dag -10 | Starta kulturer för insamling av manliga testpersoner (steg 2.2) | |||
| dag 1 | rep. 1 | |||
| dag 2 | rep. 2 | |||
| Dag 3 | rep. 3 | |||
| Dag 4 | rep. 4 | rep. 1 | ||
| Dag 5 | rep. 2 | rep. 1 | ||
| Dag 6 | rep. 3 | rep. 2 | ||
| Dag 7 | rep. 4 | rep. 3 | ||
| Dag 8 | rep. 4 | |||
| Dag 9 | Videodata analys och statistik (steg 8) | |||
| Rep = repetera | ||||
Tabell 1 : Exempel Tidslinje för testning av LTM över tre replikeringar på enskilda dagar.
| Inlärning | STM | LTM | |
| Träningsdags | 1 h. | 1 h. | 8 h. |
| Vilodag | 0 h. | 1 h. | ~ 24 h. |
| Börja träna | 0h. ALO | 0 h. ALO | 4 h. BLO |
| Sluta träna | 1 h. ALO | 1 h. ALO | 4 h. ALO |
| Starttest | 1 h. ALO | 2 h. ALO | 0 h. ALO (nästa dag) |
| ALO = efter att lamporna tänds, BLO = innan lamporna tänds, STM = korttidsminnet, LTM = långsiktigt minne | |||
Tabell 2 : Utbildningsvaraktighet, träningstider och testtider för lärande, STM och LTM.
| Genotyp | Inlärning skick | CI naiv | CI tränad | LI | LI skillnad | Lägre gräns (95% konfidensintervall) | Övre gräns (95% konfidensintervall) | p-värde |
| Kontrollera | STM | 0,467 | 0,116 | 0,752 | NA | NA | NA | NA |
| DHAP-at-RNAi | STM | 0,699 | 0,257 | 0,633 | 0,119 | -0,030 | 0,265 | 0,116 |
| Kontrollera | LTM | 0,590 | 0,384 | 0,348 | NA | NA | NA | NA |
| DHAP-at-RNAi | LTM | 0,697 | 0,650 | 0,068 | 0,280 | 0,103 | 0,446 | 0,003 |
| Kontrollera | DHAP-at-RNAi | ||||||
| Genomsnittlig CI naivt | Genomsnittlig CI utbildad | LI | Genomsnittlig CI naivt | Genomsnittlig CI utbildad | LI | ||
| STM | Dag 1 | 0,300 | 0,125 | 0,584 | 0,679 | 0,239 | 0,648 |
| Dag 2 | 0,634 | 0,107 | 0,831 | 0,720 | 0,276 | 0,617 | |
| Alla dagar | 0,467 | 0,116 | 0,752 | 0,699 | 0,257 | 0,633 | |
| LTM | Dag 1 | 0,590 | 0,441 | 0,252 | 0,630 | 0,646 | -0,027 |
| Dag 2 | 0,640 | 0,363 | 0,432 | 0,709 | 0,710 | -0,002 | |
| Dag 3 | 0,547 | 0,349 | 0,363 | 0,738 | 0,598 | 0,190 | |
| Alla dagar | 0,590 | 0,384 | 0,348 | 0,697 | 0,650 | 0,068 |
Tabell 4 : CI- och LI-värden erhållna på separata testdagar.
| "Naivelevel" bestämmer texten som kommer att identifiera naiva värden för varje genotyp. Standard är "N", men det kan ändras till någon annan alfanumerisk text. |
| "Refmutation" är inställd på "NA" (ej tillämplig) som standard, men kan ändras till namnet på kontrollen eller genotypen för att utföra statistiska jämförelser. Detta kommer att orsaka sCript att automatiskt välja kontrollgenotypen. |
| "Datnamn" avser namnet på datafilen och kan specificeras i det här argumentet istället för standardfilvalet. |
| "Header" kan användas för att ange huruvida datafilen innehåller kolumnrubriker. Standard är "TRUE", men en fil utan rubriker kan användas när detta argument ändras till "FALSE." |
| "Seed" initierar slumptalsgeneratorn. Detta är som standard inställt på "NA" och säkerställer ett slumpmässigt nummer varje gång man använder skriptet. Genom konstruktion ger en bootstrap-analys något annorlunda resultat varje gång den körs, även när man använder samma datafil. När fröet specificeras med ett heltal som är större än noll, erhålls samma uppsättning slumpmässiga uppstartsprover. |
| "skriva ut Put "kan ställas in på" TRUE "eller" FALSE "för att bestämma om en utdatafil ska genereras. Standardvärdet är "TRUE". |
Tabell 5: Argument som används i Analearn-funktionen som kan ändra standardinställningarna för funktionen för att justera parametrarna för Bootstrapping
Kompletterande fil S1: Byggplan för en domstolskammare. Filen kan öppnas med alla program som tillåter .stp-tillägg (CAD-filer) . Vänligen klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil S2 : Exempel på en Input-fil för Analearn Script .S2.zip "target =" _ blank "> Vänligen klicka här för att ladda ner den här filen.
Supplerande fil S3 : Analysera.R. Filen kan öppnas med R-studio 18 . Vänligen klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Kriminalvårdsanalysen är ett klassiskt paradigm för analys av lärande och minne i Drosophila . Protokollet som presenteras här följer den allmänna metoden som beskrivits tidigare 6 , 7 , 8 , 9 men innehåller unika aspekter såsom praktiska riktlinjer, specialutrustning och ett dataanalysskript 9 , 12 för randomiseringstester. Med hjälp av detta protokoll är det möjligt att analysera ett stort antal flugor parallellt med 96-brunns platta block ( Figur 2A ) för att samla och träna män. Blocken är förseglade med PCR-limfilm, vilket gör att flugorna är lättillgängliga vid behov. Dessutom möjliggör de unika fackkammare som beskrivs här det samtidiga paret av 18 man-kvinnliga par i ett nästan tvådimensionellt utrymme som jagS optimalt för videoanalys. De skräddarsydda förmyndarkammarna är enkla att använda, och en byggplan tillhandahålls ( File S1 , Figur 2D ). Detta protokoll, från upprättandet av de kulturer som används för att samla testämnen till förvärv av videodata, tar ungefär 20 dagar ( tabell 1 ). Ytterligare tid krävs för analys av videodata. Enligt vår erfarenhet är STM-analysen extremt robust. LTM-analysen är också ganska robust, men det är mer känslig för förvirrande miljövariabler och kan därför vara svårare att behärska.
Djurbeteende kan vara ganska varierande. Därför måste kritiska steg i protokollet utföras med försiktighet för att minska denna varians. Först kommer mild användning av aspiratorn ( Figur 2B ) att minska den stress som kan åläggas genom grov hantering eller genom att blåsa ut för starkt. En föreslagen metod att överföra individFlugor ut ur aspiratorn är med hjälp av negativ geotaxis. Som flugor tenderar att gå upp kan man helt enkelt peka upp aspiratorns spets Strax före flygningen når spetsen, är ett försiktigt slag tillräckligt för att flyga ut. För att låta männen gå in i domstolskammaren innan de testas är det ofta inte nödvändigt med ett slag.
Ett annat viktigt steg är insamling och generering av manliga testpersoner. Alla män måste samlas när de är mycket unga och socialt naiva. Detta kan uppnås genom frekvent insamling under toppperioderna av eclosion (steg 5.2). Om manar inte samlas in i denna snäva tidsram, kan de få tidiga sociala interaktioner, vilket kan leda till dåligt lärande eller hög variation i CI. En annan faktor av manliga testpersoner som ska bedömas är den genetiska bakgrunden. Olika genetiska bakgrunder uppvisar olika nivåer av naivt frieri och kan också skilja sig åt i allmän aktivitet eller lokomotorisk förmåga. När kompaRing flera genotyper, bör man ta hänsyn till genetisk bakgrund för att undvika dessa confounding faktorer som kan påverka LI poäng. Dessutom bör fördelningen av CI-data noggrant bedömas. CI-data kan vara både parametriska och icke parametriska, beroende på genotypen eller andra miljöfaktorer. I vissa fall, om fördelningen av CI är dramatiskt skevad bort från en normal fördelning, kan det vara bättre att använda median CI istället för medelvärdet för beräkningen av LI. Men enligt vår erfarenhet gör användningen av median eller medelvärdet inte någon skillnad i den statistiska tolkningen av data, och användningen av det genomsnittliga CI är vanligt förekommande i litteraturen.
För framgångsrik förhörskonditionering är det aktiva avslaget på manliga fängelseprojekt av premierade kvinnor avgörande under träningsperioden. Det är viktigt att se till att de premierade kvinnorna som används i denna analys har varit effektivt parade och ärVilket således inte tillåter sammansättning. Denna förblandning är etablerad i de parningsflaskor framställda i steg 4, där manliga och kvinnliga flugor hyses tillsammans i 4 dagar ( tabell 1 ). Därefter kan parning övervakas genom regelbunden undersökning av testvideor och genom att observera man-kvinnliga par under träning. Om parning uppstår, finns det flera åtgärder som kan vidtas under förberedelsen av premierade honor. Först bör premierade kvinnor uppfödas under optimala avelsbetingelser. Injektionsflaskor kan kompletteras med jästpasta och ett veckat filterpapper för att öka potentiella parningsytor. Inkubationen av flugor under de här beskrivna förhållandena har producerat robusta premerade kvinnor tidigare, men detta kan variera i olika laboratorier och med användning av olika genetiska stammar. Därför kan det vara nödvändigt att optimera genereringen av premierade honor genom att variera inkubationstiden och förhållandena.
Kvantifiering av domstolsbeteende ärEtt annat kritiskt steg i detta protokoll. Detta kan göras manuellt eller automatiskt med hjälp av specialiserade program 9 . Automatiserad kvantifiering är snabb och, i princip, objektiv. Flera program har publicerats 21 , 22 , 23 ; De är dock inte enkla att använda, ofta kräver specialiserade videoformat och avancerade beräkningskunskaper. Manuell kvantifiering är lätt och korrekt, men det är mycket arbetskrävande och föremål för individuell variation och förspänning. Det är viktigt att betona att detta protokoll inte uppfyller kraven för videoformatering som potentiellt krävs för automatisk kvantifiering av CI. För manuell kvantifiering, använd en enkel videoinspelningsenhet som har potential att producera en video av tillräcklig kvalitet för att exakt observera domstolsbeteende. För automatiserad kvantifiering kommer det sannolikt att vara annorlundaKrav beroende på vilken programvara som används, och användarna bör undersöka detta noggrant om automatiserad kvantifiering är önskvärd.
I kombination med de omfattande verktyg som är tillgängliga för den genetiska manipuleringen av flugor, tillhandahåller konditioneringsanalysen en robust avläsning som kan användas för att dissekera molekylära mekanismer och neuronala nätverk involverade i lärande och minne.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Vi erkänner Wien Drosophila Resurscenter för att tillhandahålla Drosophila-stammarna . Dessutom användes lager från Bloomington Drosophila Stock Center (NIH P40OD018537) i denna studie. Denna forskning stöddes delvis av EU: s FP7 omfattande integrerade nätverksgenkodys till KK, HvB och AS samt NSERC Discovery och CIHR Project Grants till JMK
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| P{KK101437}VIE-260B | VDRC | 101437 | Dhat-at-RNAi in 60100 background |
| P{KK108109}VIE-260B | - | - | Control-RNAi in 60100 background (gift from K. Keleman) |
| w+, UAS-dcr2/yhh;;elav-Gal4 (III) | - | - | panneuronal driver line |
| Containers for plant tissue culture | VWR | 960177 | 175 mL plastic vials |
| Folded filters | Whatman | 10311643 | Filter paper to enlarge area flies can pupate on |
| Flat-bottom blocks (96-wells) | Qiagen | 19579 | Used for housing blocks |
| MicroAmp Clear Adhesive Film | Applied Biosystems | 4306311 | PCR adhesive film as lid on flat-bottom blocks |
| Razor blade | - | - | Any sharp will do |
| Needle | - | - | 0.8 mm diameter |
| Aspirator | - | - | Cut a 1mL pipet tip with scissors in order to have two pieces. The narrow tip of the pipettip is placed as fly entrance in a ~80 cm flexible hose. To prevent a fly from getting in the hose, a normal piece of cotton or small mesh gaze is placed in between the tip and the hose. The other half of the pipettip can be used as mouth piece at the end of the hose. |
| Courtship chambers | - | - | file S1 can be opened with indicated CAD software |
| Camcorder | Sony | - | camera specification: >4M pixels, full HD. For manual quantification, any simple video recording device has the potential to produce a video of sufficient quality to observe courtship behavior accurately. For automated quantification, there will likely be different requirements depending on the software to be used, and users should investigate this thoroughly if automated quantification is desired. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| power food | |||
| Agar | Sigma | A7002 | |
| Yeast | Bruggeman | - | |
| Yeast extract | MP biomedicals | 0210330391 | |
| Peptone | Sigma | P6838 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | |
| CaCl2 | Merck | 1023780500 | |
| Methylparabene (CAUTION) | Sigma | H5501 | |
| Propionic acid (CAUTION) | Sigma | P1386 | |
| Demineralized water | - | ||
| Yeast paste | - | yeast grains and water mixture in a 1:1 ratio | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| normal food | |||
| Agar | MP biomedicals | 215017890 | |
| Yeast | bruggeman | - | |
| Corn flour | de Molen | - | |
| Sugar | de Molen | - | |
| Methylparabene (CAUTION) | Sigma | H5501 | |
| Propionic acid (CAUTION) | Sigma | P1386 | |
| Demineralized water | - |
References
- Quinn, W. G., Harris, W. A., Benzer, S. Conditioned behavior in Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 71, 708-712 (1974).
- Livingstone, M. S., Sziber, P. P., Quinn, W. G. Loss of calcium/calmodulin responsiveness in adenylate cyclase of rutabaga, a Drosophila learning mutant. Cell. 37, 205-215 (1984).
- Quinn, W. G., Sziber, P. P., Booker, R. The Drosophila memory mutant amnesiac. Nature. 277, 212-214 (1979).
- Dudai, Y., Jan, Y. N., Byers, D., Quinn, W. G., Benzer, S. dunce, a mutant of Drosophila deficient in learning. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 73, 1684-1688 (1976).
- Dubnau, J., Tully, T. Gene discovery in Drosophila: new insights for learning and memory. Annu. Rev. Neurosci. 21, 407-444 (1998).
- Siegel, R. W., Hall, J. C. Conditioned responses in courtship behavior of normal and mutant Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 76, 3430-3434 (1979).
- Kamyshev, N. G., Iliadi, K. G., Bragina, J. V. Drosophila conditioned courtship: two ways of testing memory. Learning & memory. 6, 1-20 (1999).
- McBride, S. M., et al. Mushroom body ablation impairs short-term memory and long-term memory of courtship conditioning in Drosophila melanogaster. Neuron. 24, 967-977 (1999).
- Keleman, K., Kruttner, S., Alenius, M., Dickson, B. J. Function of the Drosophila CPEB protein Orb2 in long-term courtship memory. Nature Neurosci. 10, 1587-1593 (2007).
- Hall, J. C. The mating of a fly. Science. 264, 1702-1714 (1994).
- Keleman, K., et al. Dopamine neurons modulate pheromone responses in Drosophila courtship learning. Nature. 489, 145-149 (2012).
- Kramer, J. M., et al. Epigenetic regulation of learning and memory by Drosophila EHMT/G9a. PLoS Biol. 9. 9, e1000569 (2011).
- Ishimoto, H., Sakai, T., Kitamoto, T. Ecdysone signaling regulates the formation of long-term courtship memory in adult Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 6381-6386 (2009).
- Kochinke, K., et al. Systematic Phenomics Analysis Deconvolutes Genes Mutated in Intellectual Disability into Biologically Coherent Modules. Am. J. Hum. Genet. 98, 149-164 (2016).
- Buchert, R., et al. A peroxisomal disorder of severe intellectual disability, epilepsy, and cataracts due to fatty acyl-CoA reductase 1 deficiency. Am. J. Hum. Genet. 95, 602-610 (2014).
- JoVE Science Education Database. Essentials of Biology 1: yeast, Drosophila and C. elegans. Drosophila Maintenance. JoVE. , Cambridge, MA. (2017).
- JoVE Science Education Database. Essentials of Biology 1: yeast, Drosophila and C. elegans. An Introduction to Drosophila melanogaster. JoVE. , Cambridge, MA. (2017).
- R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna (Austria). (2016).
- Stepien, B. K., et al. RNA-binding profiles of Drosophila CPEB proteins Orb and Orb2). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 113, E7030-E7038 (2016).
- Basu, D. Randomization Analysis of Experimental Data: The Fisher Randomization Test. J Am Stat Assoc. 75, 575-582 (1980).
- Dankert, H., Wang, L., Hoopfer, E. D., Anderson, D. J., Perona, P. Automated monitoring and analysis of social behavior in Drosophila. Nat Methods. 6, 297-303 (2009).
- Reza, M. A., et al. Automated analysis of courtship suppression learning and memory in Drosophila melanogaster. Fly. 7, 105-111 (2013).
- Schneider, J., Levine, J. D. Automated identification of social interaction criteria in Drosophila melanogaster. Biol. Lett. 10, 20140749 (2014).
