高性能小型光音響トモグラフィーシステム<em>インビボ</em>小動物脳イメージング
Summary
小型動物での高速インビボ脳イメージングのためのコンパクトパルスレーザダイオード光音響トモグラフィ（PLD-PAT）システムが実証されています。
Abstract
インビボ小動物イメージングは、前臨床研究において重要な役割を果たす。光音響トモグラフィー（PAT）は、前臨床および臨床の両方の用途に大きな可能性を示す新興ハイブリッドイメージングモダリティです。従来の光パラメトリック発振器ベースのPAT（OPO-PAT）システムは、かさばって高価であり、高速イメージングを提供することができない。近年、PATの代替励起源として、パルスレーザダイオード（PLD）が成功裏に実証されている。パルスレーザダイオードPAT（PLD-PAT）は、光音響ファントムや生体組織の高速イメージングにも成功しています。この研究は、PLD-PATを用いたインビボ脳イメージングのための視覚化された実験プロトコルを提供する。このプロトコルには、コンパクトなPLD-PATシステム構成とその説明、脳イメージングのための動物の準備、および2D断面ラット脳画像の典型的な実験手順が含まれる。 PLD-PATシステムはコンパクトでコスト効率が良い高速で高品質な画像を提供することができます。 インビボで様々なスキャン速度で収集された脳画像が提示される。
Introduction
光音響トモグラフィ（PAT）は、臨床および前臨床試験1,2,3,4,5の両方において多くの用途を有するハイブリッド撮像モダリティである。 PATでは、ナノ秒のレーザーパルスが生体組織を照射します。組織発色団による入射光の吸収は、局部的な温度上昇をもたらし、次に音波が音波の形態で放出される。超音波検出器は、試料周辺の様々な位置で光音響信号を収集する。光音響（PA）信号は、光音響画像を生成するために様々なアルゴリズム（遅延 – 和アルゴリズムなど） 6を使用して再構成される。
このハイブリッドイメージングモダリティは、高解像度、深部組織イメージングおよび高い光吸収コントラスト7を提供し 、class = "xref"> 8。最近では、より長い波長（約1,064nm）およびリン系フタロシアニンと呼ばれる外因性造影剤の助けを借りて、鶏の乳房組織において約12cmの画像深度9が達成された。この深度感度は、共焦点蛍光顕微鏡法、2光子蛍光顕微鏡法、 10光干渉断層法、 11 等の他の光学法の深度感度よりもはるかに高い.PATは、2つ以上の波長を使用して、器官における構造的および機能的変化。多くの人間の病気について、小動物のモデルは十分に確立されている12,13,14,15。小動物の画像化のために、いくつかの様式が実証されている。これらのアプローチのうち、PAイメージングは、上記の利点のためにかなり迅速に注目を集めています。 PATは、小動物4,16,17,18の組織および器官（ すなわち、心臓、肺、肝臓、眼、脾臓、脳、皮膚、脊髄、腎臓など ）における血管造影の可能性を示している。 PATは、小動物脳画像の確立されたモダリティである。 PA波は発色団による光吸収のために生成されるので、多重波長PATは総ヘモグロビン濃度（HbT）と酸素飽和度（SO 2 ）のマッピングを可能にする19,20,21,22。脳神経血管造影は、外因性造影剤12,23,24の助けを借りて達成された。 PAモダリティは脳の健康をよりよく理解するのに役立ちます分子レベルおよび遺伝子レベルで情報を提供する。
小動物イメージングのために、Nd：YAG / OPOレーザーがPAT励起源として広く使用されている。これらのレーザーは〜10 nsの繰返し率で約5 nsの近赤外パルスをエネルギー（OPO出力ウィンドウで約100 mJ）で照射します。このようなレーザを備えたPAシステムは、高価でかさばり、レーザ光源の繰り返し率が低いため、単一素子超音波トランスデューサ（UST）を用いた低速イメージングを可能にする。そのようなPAシステムにおける典型的なA線獲得時間は、断面25当たり約5分である。このような長い測定時間を有するイメージングシステムは、全身イメージング、時間分解能イメージングなどのための生理学的パラメータを制御することが困難であるため、小動物イメージングには理想的ではない。複数の単一素子USTを採用することによって、アレイベースのUST、または高繰返し率のレーザーを使用すると、PAのイメージング速度を高めることができますシステム。サンプルの周りのすべてのPA信号を収集するために1つの単一素子USTのみを使用することにより、システムのイメージング速度が制限される。高速または高感度のイメージング技術のために、円形または半円形の幾何学配置で配置された複数の単一素子USTが実証されています。線形、半円形、円形、および容積配列などのアレイベースのUST26は、リアルタイムイメージングにうまく使用されています1 。これらのアレイベースのUSTはイメージングスピードを増加させ、測定感度を低下させるが、高価である。しかし、アレイベースのUSTを使用するPAシステムのイメージング速度は、依然としてレーザの繰り返し速度によって制限されています。
パルスレーザ技術は、高繰返し率のパルスレーザダイオード（PLD）を製造するために進歩した。 7,000フレーム/秒臨床超音波プラットフォーム27を使用してPLDでBスキャン光音響イメージングが実証された。このようなPLDは、単一要素のUST円形走査形状であっても、PATシステムである。単一要素のUSTは、アレイベースのUSTとは異なり、安価で高感度です。過去10年間で、PAイメージングの励起源として高繰返し率PLDの使用に関する研究はほとんど報告されていませんでした。ファントム28の PAイメージングのためにファイバベースの近赤外PLDが実証された。低エネルギーPLDを使用して、人間の皮膚より1mm低い深さの血管のインビボイメージングが実証された29 。 PLDベースの光学解像度光音響顕微鏡（ORPAM）が報告された。 PLDを使用して、0.43Hzのフレームレートで〜1.5cmの深さのイメージングが実証されました30 。非常に最近、PLD-PATシステムが報告され、生物組織25,31において〜3秒程度の短時間および〜2cmの画像深度で画像が提供された。この研究は、このような低コストでコンパクトなシステムが高クオ高速でも画像を表示できます。 PLD-PATシステムは、高フレームレート（7,000fps）光音響イメージング、表面血管イメージング、指関節イメージング、2cm深部組織イメージング、小動物脳イメージングなどに使用することができる。 PLDからの低パルスエネルギーパルスは、その適用をマルチスペクトルおよび深部組織イメージングに限定する。実験は、前臨床応用に使用されたのと同じPLD-PATシステムを用いて小動物に対して行われている。この研究の目的は、小型動物のインビボ 2D断面脳画像化のためのPLD-PATシステムの視覚化実験デモを提供することである。
Protocol
Representative Results
Discussion
この研究は、PLD-PATシステムを用いてラットのインビボ脳イメージングを行うためのプロトコールを提示する。このプロトコルには、イメージングシステムとそのアラインメントの詳細な説明と、ラットの脳イメージングのイラストが含まれています。既存のOPOベースのPATシステムは高価で大型であり、5〜10分で1つの断面画像を提供することができる。 PLD-PATシステムは、コンパクトで…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、シンガポール教育省（ARC2 / 15：M4020238）とシンガポール保健省国立医学研究評議会（NMRC / OFIRG / 0005/2016：M4062012）が資金を提供するTier 2助成金によって支えられています。作者は機械ショップの助けを借りてChow Wai Hoong Bobbyに感謝したいと思います。
Materials
| Pulsed laser diode | Quantel, France | QD-Q1910-SA-TEC | It is the excitation laser source with specifications 803 nm, 1.4mJ per pulse, 136 ns pulse, 7kHz maximum, dimentions : 11.0 x 6.0 x 3.6 cm, weight: ~150 gm |
| Stepper motor with gearbox | LIN Engineering (Servo Dynamics) | Motor: CO-5718-01P, Gearbox: DPL64/1, I = 10 for NEMA 23; power supply PW100-48 | To move the detector holder in a circular geometry. Torque: 2.08 N-m, Rotor inertia: 2.6 kg-cm2 |
| Ultrasonic pulser/receiver | Olympus | 5072PR | To receive, filter and ampligy the PA signal from UST. Its bandwidth is 35MHz, and gain is ±59 dB. |
| Ultrasound Transducer | Olympus | V306-SU-NK-CF1.9IN/Q4200069 | Ultrasonic sensors used for photoacoustic detection. Central freqency 2.25 MHz, 0.5 in, Cylindrical focus 1.9 inch |
| PCIe DAQ (Data acquisition) Card | GaGe | CSE4227/ A6000610/B0E00610 | 12 bit, 100 Ms/s, 2 channels, 1 Gs on board memory, PCIe x16 interface |
| Rats | In Vivos Pte Ltd, Singapore | NTac:SD, Sprague Dawley / SD | Female, weight 100±10g |
| Acrylic water tank | NTU workshop | Custom-made | It contains the water that acts as an acoustic coupling medium between brain and detector |
| Circular Scanner | NTU workshop | Custom-made | Scanner is made out of Alluminum |
| Anesthetic Machine | medical plus pte ltd | Non-Rebreathing Anaesthesia machine with oxygen concentrator. | Supplies oxygen and isoflurane to animal |
| Pulse Oxymeter portable | Medtronic | PM10N with veterinary sensor | Monitors the pulse oxymetry of the animal |
| Ultrasound gel | Progress/parker acquasonic gel | PA-GEL-CLEA-5000 | Clear ultrasound gel |
| Data acqusison software | National Instruments Corporation,Austin,TX,USA) | NI LabVIEW 2015 SP1 | LabVIEW based program was developed in our laboratory for controlling the stepper motor and acquring the PA singnals from the detector |
| Data processing software | Matlab (Mathworks, Natick, MA, USA) | Matlab R2012b | Matlab code for reconstruction of PA images was developed in our lab |
| Temperature controller | LaridTech, MO,USA | MTTC1410 | It will constantly control temperature of the PLD |
| 12 V power supply | Voltcraft | PPS-11810 | To supply operating voltage for PLD |
| Variable power supply | BASETech | BT-153 | To change the laser output power |
| Funtion generator | Funktionsgenerator | FG250D | To change the repetetion rate of the PLD. It will provide TTL signal to synchronize the DAQ with the laser excitation. |
| Animal distributor | In Vivos Pte Ltd, Singapore | Animal distributor that supplies small animals for research purpose. | |
| Animal holder | NTU workshop | Custom-made | Used for holding the animal on its abdomen |
| Breathing mask | NTU workshop | Custom-made | Used along with animal holder to supply anesthesia mixture to the animal |
| Pentobarbital sodium | Valabarb | Used for euthanizing the animal after the expeirment. | |
| Optical diffuser | Thorlabs | DG10-1500 | Used to to make the laser beam homogeneous |
References
- Upputuri, P. K., Pramanik, M. Recent advances toward preclinical and clinical translation of photoacoustic tomography: a review. J Biomed Opt. 22 (4), 041006 (2017).
- Strohm, E. M., Moore, M. J., Kolios, M. C. Single Cell Photoacoustic Microscopy: A Review. IEEE Sel Top Quantum Electron. 22 (3), 6801215 (2016).
- Valluru, K. S., Willmann, J. K. Clinical photoacoustic imaging of cancer. Ultrasonography. 35 (4), 267 (2016).
- Zhou, Y., Yao, J., Wang, L. V. Tutorial on photoacoustic tomography. J Biomed Opt. 21 (6), 061007 (2016).
- Yao, J., Wang, L. V. Photoacoustic Brain Imaging: from Microscopic to Macroscopic Scales. Neurophotonics. 1 (1), 011003 (2014).
- Kalva, S. K., Pramanik, M. Experimental validation of tangential resolution improvement in photoacoustic tomography using a modified delay-and-sum reconstruction algorithm. J Biomed Opt. 21 (8), 086011 (2016).
- Strohm, E. M., Moore, M. J., Kolios, M. C. High resolution ultrasound and photoacoustic imaging of single cells. Photoacoustics. 4 (1), 36-42 (2016).
- Upputuri, P. K., Wen, Z. -. B., Wu, Z., Pramanik, M. Super-resolution photoacoustic microscopy using photonic nanojets: a simulation study. J Biomed Opt. 19 (11), 116003 (2014).
- Zhou, Y., et al. A Phosphorus Phthalocyanine Formulation with Intense Absorbance at 1000 nm for Deep Optical Imaging. Theranostics. 6 (5), 688-697 (2016).
- Upputuri, P. K., Wu, Z., Gong, L., Ong, C. K., Wang, H. Super-resolution coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy with photonic nanojets. Opt Express. 22 (11), 12890-12899 (2014).
- Raghunathan, R., Singh, M., Dickinson, M. E., Larin, K. V. Optical coherence tomography for embryonic imaging: a review. J Biomed Opt. 21 (5), 050902 (2016).
- Burton, N. C., et al. Multispectral opto-acoustic tomography (MSOT) of the brain and glioblastoma characterization. Neuroimage. 65 (2), 522-528 (2013).
- Su, R., Ermilov, S. A., Liopo, A. V., Oraevsky, A. A. Three-dimensional optoacoustic imaging as a new noninvasive technique to study long-term biodistribution of optical contrast agents in small animal models. J Biomed Opt. 17 (10), 101506 (2012).
- Hu, S., Maslov, K., Wang, L. V. In vivo functional chronic imaging of a small animal model using optical-resolution photoacoustic microscopy. Med Phys. 36 (6), 2320-2323 (2009).
- Zhang, E. Z., Laufer, J., Pedley, R. B., Beard, P. 3D photoacoustic imaging system for in vivo studies of small animal models. Proc SPIE. 6856, 68560 (2008).
- Deng, Z., Li, W., Li, C. Slip-ring-based multi-transducer photoacoustic tomography system. Opt Lett. 41 (12), 2859-2862 (2016).
- Tang, J., Coleman, J. E., Dai, X., Jiang, H. Wearable 3-D Photoacoustic Tomography for Functional Brain Imaging in Behaving Rats. Sci Rep. 6, 25470 (2016).
- Pramanik, M., et al. In vivo carbon nanotube-enhanced non-invasive photoacoustic mapping of the sentinel lymph node. Phys Med Biol. 54 (11), 3291-3301 (2009).
- Yao, J., Xia, J., Wang, L. V. Multiscale Functional and Molecular Photoacoustic Tomography. Ultrason Imaging. 38 (1), 44-62 (2016).
- Huang, S., Upputuri, P. K., Liu, H., Pramanik, M., Wang, M. A dual-functional benzobisthiadiazole derivative as an effective theranostic agent for near-infrared photoacoustic imaging and photothermal therapy. J Mat Chem B. 4 (9), 1696-1703 (2016).
- Olefir, I., Mercep, E., Burton, N. C., Ovsepian, S. V., Ntziachristos, V. Hybrid multispectral optoacoustic and ultrasound tomography for morphological and physiological brain imaging. J Biomed Opt. 21 (8), 086005 (2016).
- Hu, S., Maslov, K., Tsytsarev, V., Wang, L. V. Functional transcranial brain imaging by optical-resolution photoacoustic microscopy. J Biomed Opt. 14 (4), 040503 (2009).
- Yao, J. J., et al. Noninvasive photoacoustic computed tomography of mouse brain metabolism in vivo. Neuroimage. 64 (1), 257-266 (2013).
- Hu, S., Wang, L. V. Neurovascular photoacoustic tomography. Front Neuroenergetics. 2, 10 (2010).
- Upputuri, P. K., Pramanik, M. Performance characterization of low-cost, high-speed, portable pulsed laser diode photoacoustic tomography (PLD-PAT) system. Biomed Opt Express. 6 (10), 4118-4129 (2015).
- Yang, X., et al. Photoacoustic tomography of small animal brain with a curved array transducer. J Biomed Opt. 14 (5), 054007 (2009).
- Sivasubramanian, K., Pramanik, M. High frame rate photoacoustic imaging at 7000 frames per second using clinical ultrasound system. Biomed Opt Express. 7 (2), 312-323 (2016).
- Allen, J. S., Beard, P. Pulsed near-infrared laser diode excitation system for biomedical photoacoustic imaging. Opt Lett. 31 (23), 3462-3464 (2006).
- Kolkman, R. G. M., Steenbergen, W., van Leeuwen, T. G. In vivo photoacoustic imaging of blood vessels with a pulsed laser diode. Lasers Med Sci. 21 (3), 134-139 (2006).
- Daoudi, K., et al. Handheld probe integrating laser diode and ultrasound transducer array for ultrasound/photoacoustic dual modality imaging. Opt Express. 22 (21), 26365-26374 (2014).
- Upputuri, P. K., Pramanik, M. Pulsed laser diode based optoacoustic imaging of biological tissues. Biomed Phys Eng Express. 1 (4), 045010-045017 (2015).
- . . American National Standard for Safe Use of Lasers ANSI Z136.1-2000. , (2000).
