Clock Scan Protocol voor Image Analysis: ImageJ Plugins

Summary

Dit artikel beschrijft twee nieuwe ImageJ-plugins voor 'Clock Scan' beeldanalyse. Deze plugins vergroten de functionaliteit van het oorspronkelijke Visual Basic 6-programma en, belangrijker, maakt het programma beschikbaar voor een grote onderzoeksgemeenschap door het te bundelen met het ImageJ gratis beeldanalysesoftwarepakket.

Abstract

Het klokscanprotocol voor beeldanalyse is een efficiënt instrument om de gemiddelde pixelintensiteit binnen, aan de grens en buiten (achtergrond) een gesloten of gesegmenteerd convexvormig gebied van belang te kwantificeren, wat leidt tot het genereren van een gemiddelde integrale radiale pixel- Intensiteitsprofiel. Dit protocol werd oorspronkelijk in 2006 ontwikkeld, als een visuele basis 6 script, maar als zodanig heeft het een beperkte distributie gehad. Om dit probleem aan te pakken en om andere recente inspanningen van anderen aan te sluiten, hebben we de oorspronkelijke klok-scanprotocolcode omgezet in twee op Java gebaseerde plugins die compatibel zijn met NIH-gesponsorde en vrij beschikbare beeldanalyseprogramma's zoals ImageJ of Fiji ImageJ. Bovendien hebben deze plugins verschillende nieuwe functies, waardoor het bereik van mogelijkheden van het oorspronkelijke protocol verder wordt uitgebreid, zoals analyse van meerdere regio's van interesse en beeldstapels. Het laatste kenmerk van het programma is vooral handig in toepassingen waarin het belangrijk is om de verwante veranderingen te bepalenNaar tijd en locatie. Zo kan de klokscananalyse van stapels biologische afbeeldingen mogelijk worden toegepast op het verspreiden van Na ⁺ of Ca ⁺⁺ binnen een enkele cel, evenals de analyse van spreidende activiteit ( bijv . Ca ⁺⁺ golven) in synaptische populaties -verbonden of kloofverbinding-gekoppelde cellen. Hier beschrijven we deze nieuwe klok scan plugins en tonen enkele voorbeelden van hun applicaties in beeldanalyse.

Introduction

Het doel van dit werk is het presenteren van een Clock Scan-protocol dat platformvrij en vrij beschikbaar is voor elke onderzoeker die geïnteresseerd is in dit type beeldanalyse. Het protocol voor Clock Scan is oorspronkelijk ontwikkeld in 2006 ¹ , met als doel het verbeteren van bestaande methoden van pixelintensiteitskwantificering binnen convexvormige belangengebieden (ROI), een methode die een betere integratieve capaciteit en verbeterde ruimtelijke resolutie heeft. Tijdens de overname verzamelt het protocol opeenvolgende meerdere radiale pixelintensiteitsprofielen, gescand van het ROI-centrum naar de grens of op een vooraf bepaalde afstand buiten de ROI om de pixelintensiteit van de achtergrond te meten. Het protocol schaal deze profielen volgens de celradius, gemeten in de richting van de scan. Zo is de afstand van het centrum tot de ROI grens van elke individuele radiale scan altijd 100% van de X-schaal. Tenslotte is het programma gemiddeld deze persoonAl profielen in één integraal radiaal pixel-intensiteit profiel. Door middel van schalen hangt het gemiddelde pixelintensiteitsprofiel, dat is geproduceerd door het "Clock Scan" protocol, niet op de ROI-grootte, noch binnen redelijke grenzen, op de ROI-vorm. Met deze methode kan directe vergelijking of, indien nodig, de gemiddelde of aftrekking van profielen van verschillende ROI's worden vergeleken. Het protocol maakt het ook mogelijk om de integrale pixelintensiteitsprofielen van elk object voor achtergrondgeluid te corrigeren door een eenvoudige aftrekking van de gemiddelde intensiteit van de pixels buiten het object te plaatsen. Hoewel het alleen in biologische monsters is getest, biedt ons protocol een waardevolle aanvulling op andere bestaande beeldanalyse-instrumenten die worden toegepast in studies van beelden van fysieke of chemische processen die rondom een ​​punt van herkomst worden geregeld (zoals diffusie van stoffen uit een puntbron ) ¹ .

De belangrijkste beperking van de oorspronkelijke beeldanalysemethode was echter dat het protocol was gewijdUitgebracht als Visual Basic 6 (VB6) (code en daarom was het platformafhankelijk en moeilijk te distribueren (VB6 vereist). Om dit probleem aan te pakken en om aan te sluiten bij soortgelijke recente inspanningen van andere onderzoekers ² , hebben we de VB6 Clock Scan omgezet Programmacode in twee op Java gebaseerde plugins, compatibel met de NIH-gesponsorde en vrij toegankelijke open-source en platform onafhankelijke beeldanalyseprogramma's, ImageJ ³ en Fiji ImageJ ^4. Bovendien hebben deze plugins nu verschillende nieuwe functies die de mogelijkheden uitbreiden Van het oorspronkelijke protocol om meerdere ROI's en beeldstapels te verwerken. Veel beeldanalyseprogramma's zijn niet gebruiksvriendelijk, wat betreft het uitvoeren van statistische analyse van meerdere objecten, en dus worden vaak alleen representatieve gegevens weergegeven. Met de multi Clock Scan ImageJ-plugin, Het is mogelijk om tegelijkertijd de analyse van meerdere objecten te vergemakkelijken. Een robuuste statistische evaluatie van microscopiedata,Met betrekking tot de signaalintensiteit verdeling in enkele cellen / objecten, is nu mogelijk met deze plugin extensie. Hier beschrijven we de Clock Scan plugins en tonen voorbeelden van hun applicaties in beeldanalyse.

Protocol

1. Software installatie

1. Installeer de nieuwste versies van gebundelde Java en ImageJ of Fiji ImageJ zoals aanbevolen op de betreffende websites (zie materiaaltabel voor links naar de betreffende websites). In de onderstaande tekst worden beide programma's aangeduid als "ImageJ".
2. Kopieer "Clock_Scan-1.0.1. Jar" en "Multi_Clock_Scan-1.0.1.jar" pluginbestanden met behulp van de link die in de materialetabel is geplaatst en plak ze in de ImageJ-plugin directory. Als alternatief gebruik je de optie 'Plugins | Installeer plugin' om deze bestanden te installeren nadat ze op de harde schijf van de computer zijn opgeslagen.

2. Clock Scan analyse

1. Standaard klok scan plugin ( afbeelding 1 ):
   1. Gebruik de menuoptie ImageJ "File | Open" om een ​​interessant beeld te openen.
   2. Klik op het 'polygoon' gereedschap, of 'gesegmenteerde lijn selectie'Tool, en trek vervolgens de afbeelding aan om de gehele ROI of een segment van deze regio te schetsen. Zie figuur 1 A voor een voorbeeld van veelhoekselectie (binnenste streeplijn).
      OPMERKING: Andere selectiegereedschappen, die beschikbaar zijn in de software (rechthoekige, ovale en vrije handlijn selectie), kunnen ook worden gebruikt.
   3. Selecteer "Plugins | Clock Scan" in het menu om het standaard pop-up-venster voor het openen van de klok te openen. Merk op dat dit commando ook het ROI Manager-venster zal openen met de omtrek die er automatisch bij wordt toegevoegd.
   4. Gebruik het invoegtoepassingsvenster om het volgende te doen.
      1. Controleer en verander de X- en Y-coördinaten van het ROI-centrum (automatisch berekend als coördinaten van het fysieke massacenter) door middel van scrollbalkjes of de waarden in de bijbehorende invoerdozen te wijzigen. Zie figuur 1 B.
      2. Afhankelijk van hoeveel van de achtergrond regio buiten het object shoAls u wilt scannen, moet u de scanlimieten aanpassen door gebruik te maken van de scrollbar. Zie figuur 1 A.
         OPMERKING: Scanlimiet is het fractionele getal dat aangeeft hoe ver de scan in een bepaalde richting verder gaat dan de rand van de objecten; De standaardwaarde is 1,20, wat aangeeft dat de scanlengte 20% langer zal zijn dan de objectradius in de richting van de scan; Zie figuur 1 A , buitenste streeplijn).
      3. Wijzig de uitvoer van de plugin met behulp van "echte straal", "aftrek achtergrond", "polaire transformatie" en / of de "plot met standaard afwijking" checkboxen.
      4. Klik op "OK" om de plugin uit te voeren. Zie figuur 1 C-H .
         OPMERKING: Voorbeelden van de uitvoer van het protocol met "plot met standaardafwijking" en "polaire transformatie" of "echte straal" en "polaire transfectOrm "-opties worden weergegeven in respectievelijk Figuur 1 C en 1D en Figuur 1 E en 1F . Merk op dat de berekende standaardafwijkingen (SD) -waarden de variatie tussen afzonderlijke radiale pixelintensiteitscanningen van het object vertegenwoordigen. Let ook op de" ROI-selectie Lengte "in het invoegvenster, waarin de informatie wordt weergegeven op de lengte van de ROI-omtrek, gemeten in pixels.
   5. Gebruik in het gegenereerde "Platenprofiel Plot" de opdracht "Lijst" om waarden te plotten die worden weergegeven in twee, X- en Y-kolommen van gegevens voor grijsschaalafbeeldingen en in X- en vier Y-kolommen gegevens voor RGB-afbeeldingen, waarvan Y0, Y1, Y2 en Y3 kolommen worden gevuld met integrale en individuele (rode, groene en blauwe) kleurkanaal pixel intensiteit waarden.
2. Meerdere ROI Clock Scan plugin - werken met meerdere ROI ( ):
   1. Open een afbeelding met meerdere ROI.
   2. Open de ROI Manager door op 'Analyseer | Tools | ROI Manager' te klikken.
   3. Sequentially overzicht (zie stap 2.1.2) en voeg elke ROI toe aan de ROI Manager door op "Add" in het ROI Manager venster te klikken; Doe dit voor alle ROI's binnen de afbeelding. Gebruik de opdracht 'Analyse | Maatregel' als ROI-statistieken van belang zijn.
      1. Zie Figuur 2 A voor een voorbeeld van meerdere segmentenlijn selecties en Figuur 2 E voor een voorbeeld van meerdere polygoon selecties.
   4. Selecteer "Multi Clock Scan" in het menu "Plugins" om het pop-upvenster voor protocolopties te openen.
   5. Gebruik het protocolvenster om het volgende te doen.
      1. Herstel indien nodig de scanlimiet zoals in stap 2.1.4.2; Standaardwaarde is 1,20.
      2. Selecteer indien nodig de optIon om het gemiddelde klokscanprofiel met SD-balkjes te plotten door het vak "Plot with standard deviation" te openen. Zie figuur 2 C en D.
         OPMERKING: De berekende SD-waarden vertegenwoordigen variatie tussen integrale klokscanprofielen van verschillende objecten. Let ook op de regel in het pluginvenster met informatie over het aantal geselecteerde ROI's.
      3. Klik op "OK" om het protocol uit te voeren.
   6. Gebruik in het gegenereerde "Plotprofiel van de klok" de opdracht "Lijst" om de waarden te plotten die in het venster "Plotwaarden" worden weergegeven. Zie de "Multi Clock Scan Profile Plot" -vensterlegenda voor kolomaanwijzing per kleurkanaal.
   7. Merk op dat de ROI's genummerd zijn en hun klokscanprofielen voor een bepaald kleurkanaal worden getekend in dezelfde volgorde waarin de ROI's zijn geschetst en toegevoegd aan de "ROI Manager".
3. MulTiple ROI Clock Scan plugin - werken met een beeldstapel ( afbeelding 3 ):
   1. Open een beeldstapel van interesse.
   2. Open de ROI Manager door op 'Analyseer | Tools | ROI Manager' te klikken.
   3. Schets de ROI van de afbeeldingen binnen de stapel en voeg deze toe aan ROI manager zoals beschreven in stappen 2.1.2 en 2.2.3. Gebruik de opdracht 'Analyse | Maatregel' als de ROI-statistieken van belang zijn.
   4. Selecteer "Multi Clock Scan" in het menu "Plugins" om het pop-upvenster voor protocolopties te openen.
   5. Gebruik het protocolvenster om het volgende te doen.
      1. Reset de scanlimiet zoals beschreven in stap 2.1.4.2; Standaardwaarde is 1,20.
      2. Selecteer de optie om het gemiddelde klokscanprofiel met SD-balkjes te plotten door het vak 'Plot with standard deviation' te selecteren.
         OPMERKING: De berekende SD-waarden vertegenwoordigen variatie tussen verschillende voorbeelden van het object dat is geselecteerd in de afbeelding stack. Let ook op de regel in het invoegvenster dat informatie toont over het aantal beelden in de stapel.
      3. Klik op "OK" om het protocol uit te voeren.
   6. Klik in het venster 'Clock Scan Profile Plot' op 'List' om de waarden te plotten die in het venster 'Plot Values' worden weergegeven, waar het Y-kolomnummer de beeldpositie in de stapel vertegenwoordigt - 1.

Representative Results

De afbeeldingen die hier gebruikt worden voor illustratieve doeleinden, worden genomen uit databases die zijn gecreëerd tijdens onze vorige cel- en weefselbiologische studies ^{5 , 6 , 7} en van de Allen Mouse Brain Atlas ⁸ . Beide plugins werden succesvol getest met behulp van ImageJ 1.50i / Java 1.8.0_77, ImageJ 2.0.0-rc-44 / 1.50e / Java 1.8.9_66 en Fiji ImageJ 2.0.0-rc54 / 1.51g / Java 1.8.0_66 programma omgeving.

Figuur 1 toont representatieve resultaten van beeldanalyse met een standaard Clock Scan plugin. Voor beide plugins zijn de basiscode en de belangrijkste stappen van de klok-scanprocedure in wezen hetzelfde als beschreven in het oorspronkelijke protocol ¹ . Kortom, na de ROI of een segment van de ROI wordt geschetst op de afbeelding ( Figuur 1 A , innerlijke gele omtrek) en een middelpunt van de omtrek wordt bepaald (automatisch of handmatig, met behulp van het plugin-optiescherm; Figuur 1 B ) begint de radiale aftasting van de pixelintensiteit in een richting van het midden naar de eerste pixel van de Celoverzicht en ga verder met de klok mee pixel-bij-pixel langs de omtrek ( figuur 1A; rechte vector en gebogen pijl) totdat alle ROI-radiussen zijn gescand. Om de ROI-achtergrondintensiteit te kwantificeren, kan de lengte van elke radiale scan worden ingesteld om de straal van de ROI in de richting van de scan te overschrijden met een vooraf ingestelde fractienummer (0,2 of 20% van de radius in de standaardwaarde van de waarde van de Clock Scan plugin , Buitenste gele lijn in figuur 1 A ). Gegroepeerde radiale profielen worden dan uitgelijnd door schalen naar de bijbehorende radiussen en gemiddeld om het integrale klokscanintensiteitsprofiel in 2 te produceren56 intensiteitsgraden van grijsschaaleenheden ( Figuur 1C). Voor RGB-beelden produceren beide plugins automatisch onafhankelijke integrale radiale pixelintensiteitsprofielen voor elk kleurkanaal (256 intensiteitsniveaus van rode, groene en blauwe kleuren) naast een gecombineerd kleurenprofiel.

Standaard vertegenwoordigt de x-schaal van het pixelintensiteitsprofiel van de klokscan de genormaliseerde ROI-radius, waarbij 100% van de schaal pixels vertegenwoordigt die zich aan de grens van ROI bevinden ( Figuur 1C). Het profiel getoond in Figuur 1 C werd gegenereerd met de optie 'Plot met standaardafwijking' geselecteerd, en daarom geeft de grafiek ook de SD berekend voor elk gegevenspunt langs de X-schaal van het profiel. Wanneer de optie "aftrek achtergrond" is geselecteerd, wordt het gehele intensiteitsprofiel gecorrigeerd voor achtergrondnummerIse door punt-voor-punt aftrekking van de gemiddelde intensiteit van pixels tussen de ROI grens en de grens grens grens (buitenste gele lijn in figuur 1 A ; data niet getoond). Als de optie "polaire transformatie" is geselecteerd, genereert de klok scan plugin een extra uitvoer venster. Het bevat een polaire transformatie van het beeld van de geselecteerde regio, inclusief het gebied van de scangrens, waarbij het beeld in elke radiale scanrichting zodanig is aangepast dat de afstand van het midden naar de rand van de objecten altijd genormaliseerd wordt tot 100 % En vertegenwoordigd door 100 pixels. Ongeacht de werkelijke grootte van het object, zijn de verticale en horizontale afmetingen van zijn polaire transformatiebeeld twee keer de scanlimiet in pixels (240 pixels x 240 pixels in het voorbeeld weergegeven in Figuur 1 D ). Tenslotte, het selecteren van de "echte straal" optie zal resulteren in de generatie van de klok scan prOfile en een polaire transformatieafbeelding, geschaald volgens de werkelijke gemiddelde straal van het object en in de eenheden van ruimtelijke kalibratie van het oorspronkelijke beeld ( figuren 1E en F , respectievelijk).

Figuur 1G en H illustreren aanvullende beeldanalyseopties met behulp van de objectgrootte- en vormonafhankelijke polaire transformatie en de geïntegreerde ImageJ-commando's en -gereedschappen. Voorbeelden van commando's, die voor bepaalde soorten beeldanalyse nuttig kunnen worden geacht, zijn de segmentatie van het lijngereedschap en het commando 'Analyse | Plotprofiel' ( Figuur 1 G ) en het commando 'Analyse | Oppervlakteplot' ( Figuur 1 H ).

Figuur 2 en 3 tonen representatieve resultaten van beeldanalyse met de Multi Clock Scan plugin. De uitvoer van deMulti-klok scan plugin bestaat uit twee grafieken: de eerste grafiek toont individuele klok scan profielen van de geselecteerde objecten ( Figuur 2 C ) en de tweede grafiek geeft het gemiddelde van deze individuele klok scan profielen (± SD, optioneel; Figuur 2 D ) . Voor RGB-afbeeldingen ( Figuur 2 E ) wordt het klokscaneprofiel berekend voor elk afzonderlijk kleurkanaal ook weergegeven voor elke geselecteerde ROI ( Figuur 2F ) en wordt het gemiddelde berekend binnen een bepaald kanaal voor alle geselecteerde objecten ( Figuur 2G) . Op dezelfde manier worden de individuele en gemiddelde klokscanprofielen voor objecten in de beeldstap weergegeven na het uitvoeren van de klokscananalyse van de stapel ( Figuren 3A-3D , het gemiddelde klokscanprofiel wordt niet getoond). Zoals eerder vermeld, de numeriekeAl data worden gebruikt om deze plots te genereren door het plot "List" commando uit te voeren.

Figuur 4 illustreert één aanvullende toepassing van de optie polaire transformatie in de Clock Scan plugin: de geschiktheid voor beeldregistratie en overlay operaties. In deze figuur werden ROI-grootte- en vorm-onafhankelijke polaire transformaties gebruikt om de verdeling van fluorescentie-etikettering van neuronen die α3 natrium- / kalium-ATPase-pomp uitdrukken tussen verschillende muiscorticale gebieden te vergelijken, waarbij het atlasbeeld de grenzen en de anatomische organisatie van Deze gebieden ( figuren 4A-4B ). Met een klok-scanprotocol worden de registratie van referentie (atlas) en de feitelijke afbeeldingen die nodig zijn voor een dergelijke vergelijking beperkt tot een eenvoudige procedure voor het aanpassen van de afbeeldingen, het omschrijven van de structuur van belangstelling in beide afbeeldingen en vervolgens het genereren van ROI-grootte- en vorm- Onafhankelijke polaire transformaties.In het voorbeeld dat in Figuur 4 wordt getoond, laat een vergelijking van polaire transformaties duidelijk een niet-uniforme verdeling van gelabelde cellen in de muisbreincortex zien, waarbij hun dichtheid specifiek hoog is in oppervlakkige gebieden van laag 2/3 van de motorcortex, dorsale deel Van de agranulaire insulaire cortex, de laterale orbitale cortex, en in diepe lagen van de motorcortex ( figuren 4C-4D ).

Figuur 1 : Representatief voorbeeld van toepassing van de Clock Scan Plugin voor Image Analysis. ( A ) Fluorescerend lichtbeeld van een deel van een rat dorsale wortelganglion die immunostained is voor de a3-isoform van de Na + / K + -ATPase (a3 NKA, zie Schneider et al. ³ voor de details van weefselverwerking en -verf).Een van de neuronale profielen, met de grens zwaar gemarkeerd voor α3 NKA (wit), wordt geschetst met behulp van een polygoonlijngereedschap (innerlijke gele lijn). Radiale scan (witte pijl) limieten (buitenste gele lijn) werden ingesteld op 120% van de objectradius, van het objectcentrum (witte punt) naar de eerste pixel van de omtrek, zoals getoond in paneel B (scanbalk scrollbalk). ( B ) Screenshot van het hoofdopties venster van de Clock Scan plugin. ( C ) Plot van integraal pixel-intensiteitsprofiel van de cel die wordt weergegeven in paneel A (gemiddelde van 706 radiale scanprofielen, zie schetslengte in B; verticale strepen zijn SD-staven). ( D ) - Polaire transformatiebeeld van het bestudeerde celprofiel. ( E ) Clock-scan profiel van dezelfde cel verkregen met de "echte straal" optie geselecteerd. Merk op dat de x-schaal van dit profiel in tegenstelling tot het profiel in C toont echte ruimtelijke kalibratie-eenheden (μm). ( F ) Polaire transformatie van dezelfde cel verkregen met de "Echte straal" optie geselecteerd. Merk op dat de schaal van deze transformatie nu in echte ruimtelijke kalibratie-eenheden (μm) ligt. ( G ) De grens van de polaire transformatie, getoond in D, werd geschetst met behulp van het gesegmenteerde lijnwerktuig (lijndikte werd ingesteld op 10 pixels of 10% radiale scanlengte) en geanalyseerd. "Analyse | Plot Profile" commando werd uitgevoerd om de veranderingen in gemiddelde labeling intensiteit langs de rand van het object te meten (elk gegevenspunt van de grafiek vertegenwoordigt de gemiddelde intensiteit van alle pixels over de breedte van de selectielijn). ( H ) Het commando "Analyse | Oppervlakte plot" werd toegepast op het polaire transformatiebeeld dat wordt weergegeven in paneel D om 3-D-weergave van de etiketteringsintensiteit van het object te creëren. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

E 2 "class =" xfigimg "src =" / bestanden / ftp_upload / 55819 / 55819fig2.jpg "/>
Figuur 2 : Representatief voorbeeld Toepassing van het gebruik van Multi Clock Scan Plugin voor Image Analysis. ( A ) Vier gezichtsvelden werden gevangen binnen het gedeelte van de rat dorsale wortel ganglion immunostained voor α3 NKA (zie Figuur 1 Een legende). Voor het vereenvoudigen van het gebruik van de multi-klok scan plugin werden deze beelden in een stapel geplaatst en vervolgens omgezet in een enkele afbeelding met behulp van de opdracht "Image | Stacks | Make Montage". Rode lijnen en cijfers geven aan op gesegmenteerde lijnkeuzes van vijf regio's die interessant zijn voor deze afbeelding. ( B ) Een schermafbeelding van het venster Multi Clock Scan wordt weergegeven wanneer de plugin wordt gebruikt om een ​​grijsbeeld te analyseren. ( C ) Individuele klok-scanprofielen van vijf ROI's 'weergegeven in paneel A. ( D ) Gemiddeld klokscanprofiel voor geselecteerde ROI's (paneelA) met SD bars (optie "plot met standaard afwijking" geselecteerd). ( E ) RGB beeld van gekweekte muis preBI-lymfocyten, gemarkeerd met 4,6-Diamidino-2-fenylindool (DAPI, nucleaire vlek, blauw) en met fluorescent gelabelde antilichamen voor β1-integrin (groen) en F-actine ; Zie Dobretsov et al. ⁷ voor de celcultuurtechniek en Yuryev et al. ¹¹ voor het kleuren van details). Elf cellen (zie nummerlabels) werden geschetst met behulp van de ImageJ-polygoon selectie tool. Panelen rechts tonen groene en rode kanaalweergave van de cel # 7 (rechthoekige selectie aan het linker paneel) nadat de menu functie "Beeld | Kleur | Splitskanalen" is uitgevoerd. ( F ) Individuele celklok-scanprofielen (samengestelde en rode, groene en blauwe kleurkanaalprofielen worden respectievelijk weergegeven met respectievelijk zwarte, rode, groene en blauwe lijnen). ( G ) Gemiddelde klok-scanprofielen voor alle elf ROI's geselecteerd in het paneelE. Kleurbenamingen zoals in paneel G (geen plot met standaardafwijkingsoptie is gebruikt tijdens de Multi Clock Scan procedure). Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Afbeelding 3 : Multi Clock Scan Plugin en analyse van beeldstacks. ( A ) Montage van geselecteerde en "opgeslagen als stapel" beeldkaders. Een afbeelding van een dorsale wortel ganglion neuron gevangen met differentiële interferentie contrast (DIC) microscopie wordt getoond in het eerste frame. Volgende frames werden verkregen met behulp van epi-verlichtingsfluorescentiemicroscopie om intracellulaire calciumconcentratie te monitoren bij verschillende tijdsintervallen, voor en na elektrische stimulatie van de cel. Getallen naast het respectivE afbeelding geeft tijd in ms ^{6 aan} . De rand van de cel werd geschetst met behulp van de DIC-afbeelding van de stapel (linksboven frame; sterretje geeft de patch-klempipet aan die gebruikt wordt voor het opnemen en vullen van de cel met de calciumgevoelige kleurstof Oregon Green BAPTA-1 (OGB-1) ), En gebruikt vervolgens de Multi Clock Scan procedure op de resterende beelden. ( B ) Screenshot van Multi Clock Scan venster, wanneer het programma wordt uitgevoerd op een stapel afbeeldingen. ( C ) Clock-scan profielen van het OGB-1 fluorescentie signaal op verschillende afstanden van het celcentrum (% van de straal) en op verschillende tijden voor en na elektrische stimulatie (legenda, in ms). Om deze grafieken voor te bereiden werd professionele grafische software gebruikt. ( D ) Veranderingen in de intensiteit van het OGB-1 signaal met tijd in de submembraan en dieper cytoplasmatische celregio's (respectievelijk rood en zwart cirkels en lijnen). Om deze gegevens te verkrijgen, werden de gemiddelde en SD berekend voor elke data punt locatTussen 20-40% en 70-90% van de x-schaal van elk klokscansprofiel dat wordt weergegeven in paneel C (schaduwrijke gebieden) Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4 : Voorbeeld van het gebruik van de Clock Scan Plugin in beeldregistratie en overlay. ( A en B ) Screenshots van plaat 29 uit de coronaire sectie (Allen Mouse Brain Atlas) en een 200 μm dikke vibratoom sectie van de gelatine-ingebedde muisbrein gesneden op ongeveer hetzelfde niveau als het atlasbeeld. De transgene muis die in dit voorbeeld werd gebruikt, was het expressie van ZsGreen-fluorescerende eiwit onder de promotor van α3NKA, om α3NKA-expressie-neuronen ^{2 te} identificeren. Het bepalen vanCorticale gebieden die specifiek verrijkt zijn met deze neuronen (heldere punten op het beeld in paneel B), werd het hele corticale gebied geschetst (gele streeplijnen) die beginnen in beide afbeeldingen met hetzelfde referentiepunt (midden tussen de cortex en de olfactory Gloeilamp, pijlen). ( C ) Panelen vertegenwoordigen (van links naar rechts): Clock Scan polar transformeert de ROI, geselecteerd in het atlasbeeld (paneel A), binnen het beeld van de muisbreinectie (paneel B) en de overlay van deze twee transformatieafbeeldingen | Overlay | Image toevoegen "commando met 50% opaciteit instelling). ( D ) Dezelfde afbeeldingen als in paneel C, maar met de grenzen van de grote corticale gebieden (zoals getoond in de atlas), beschreven in twee andere transformatiebeelden met behulp van de ImageJ-polygoon, gesegmenteerde lijnselectietools en de 'Analyseer | Tools | Synchronize Windows' opdracht. Afkortingen zijn hetzelfde als in de originele hersenatlas afbeelding: Motor primaire en secundaire (MOp, MOs), agranulaire insulaire, dorSaldeel (AId), orbitale laterale, ventro-laterale en mediale (ORBI, ORBvl, ORBm), prelimbische (PL), anterior cingulaat, dorsale deel (ACAd) cortex. Getallen in het MOS-gebied verwijzen naar de belangrijkste corticale lagen, die in de muismotorcortex kunnen worden onderscheiden op het juiste coronaire herseneniveau. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Clock Scan Protocol: Het Clock Scan Protocol is een snel en simpel tool voor beeldanalyse. De voordelen van dit protocol, in vergelijking met bestaande gemeenschappelijke benaderingen van beeldanalyse (zoals lineaire pixelintensiteitscanningen of berekening van gemiddelde pixelintensiteit van de ROI) zijn beschreven in de voorgaande publicaties ^{1 , 9} . Kortom, dit protocol maakt het mogelijk om integrale radiale pixelintensiteitsprofielen te genereren door de intensiteit van pixels op verschillende afstanden van het ROI-centrum, zoals de grens van het object, of een vooraf bepaalde locatie buiten het object (achtergrond) te kwantificeren. Vanwege deze laatste kunnen de klok-scanprofielen van elke ROI altijd gecorrigeerd worden voor zijn onmiddellijke achtergrond, die (in biologische toepassingen) dit profiel minder afhankelijk maakt van lokale, binnen-de-steekproef of steekproeven, niet-uniformiteiten Bij etikettering / vlekken, evenals onstabiliteit inDe intensiteit van de belichtingstijden van de microscoop lichtbron of fluorescerende licht. De objectgrootte en vorm onafhankelijkheid van de klokscanprofielen breiden het toepassingsgebied van dit protocol verder uit door de vergelijkingen van verschillende objecten mogelijk te maken, evenals correctie door punt-voor-punt aftrekking van profielen van positieve en negatieve controle voorwerpen.

Clock Scan Plugins: De belangrijkste beperking voor het distribueren en delen van het oorspronkelijke protocol was de platformafhankelijkheid van de code die is ontwikkeld met Visual Basic 6.0 (VB) ^{1 , 9} . Dit probleem is onlangs aangepakt door een van de onderzoeksgroepen van het Leibniz Institute of Molecular Pharmacology, Duitsland, door een soortgelijke Fuji ImageJ Clock Scan plugin ^{2 te} ontwikkelen. De plugin van het Leibniz-instituut reproduceert de oorspronkelijke basisschakeling van de basisschakeling in zijn vermogen om niet te genererenGral radiale scanprofielen voor de bijgevoegde konvekse vorm ROI, en kan daarnaast segmenten van contouren (bogen) verwerken. De scanlimiet van het profiel dat door hun plugin wordt gegenereerd, kan echter alleen worden ingesteld op 100% (de grens van het object), wat betekent dat de achtergrondpixelintensiteit niet kan worden gekwantificeerd. Bovendien heeft het geen capaciteit om polaire transformaties te genereren, om te werken met verschillende kleurenkanalen in RGB-afbeeldingen, of om te werken met stapels beelden en om meerdere ROI's te verwerken. Ter vergelijking, de hier beschreven twee nieuwe plugins, reproduceren volledig de mogelijkheid van de originele VB code ( dwz generatie integrale klokscan pixel intensiteit profielen met optionele weergave van SD's en / of achtergrond aftrekking, evenals het verwerken van verschillende kleurenkanalen van RGB beelden). Daarnaast kunnen ze een segment / boogvormige ROI analyseren (functionaliteit geïntroduceerd in de Fuji ImageJ plugin ontwikkeld bij Leibniz Institute of Molecular Pharmacology ² ). Bovendien, thEse plugins uitbreiden het nut van eerdere programma's door het genereren van ROI-grootte- en vormafhankelijke polaire ROI-beeldtransformaties, die kunnen worden gebruikt in toepassingen waarvoor beeldregistratie vereist is. Tenslotte vergemakkelijkt de scan met meerdere klokken de klok-scan van meerdere ROI's die binnen hetzelfde beeld of in een beeldstapel staan. Het laatste nieuwe kenmerk van het programma is vooral handig bij toepassingen waarin het belangrijk is om veranderingen in verband met tijd en locatie te bepalen.

Beperkingen en probleemoplossing: De belangrijkste beperking van de Clock Scan-methode is de eis om een ​​convexvormige ROI te selecteren. Het klokscanprofiel zou zinloos zijn in situaties wanneer een van de radiale scans meer dan een keer de ROI-omtrek overschrijdt. Dit zou de normalisatie van de lengte van dergelijke radiale scan met betrekking tot de afstand van het centrum tot de ROI-grens mogelijk maken. Een andere beperking is dat de klok scan profiel informatie is voorbijDaadwerkelijk verminderd in ROI zonder radiale symmetrie. Tenminste gedeeltelijk kunnen deze twee beperkingen echter worden overwonnen door de analyse van geselecteerde segmenten (bogen) van complexe en asymmetrische ROI's. Met behulp van de segmentscaning wordt ook aanbevolen in gevallen waarin secties van het achtergrondgebied zijn voorzien van gemarkeerde functies, die de achtergrond-aftrekprocedure kunnen beïnvloeden (zie Figuur 2A voor een voorbeeld van selectie voor analyse van die celsegmenten die niet met andere gemarkeerde cellen worden geconfronteerd). Ten slotte, als analyse van composietbeelden met meer dan 3 kleurkanalen nodig is, moeten de kleurkanalen van deze afbeeldingen worden gesplitst voordat de plugin wordt uitgevoerd.

Toekomstige richtingen: Toekomstige verbetering in de functionaliteit van deze plugins omvat, maar zijn niet beperkt tot, de code bijwerken om de functionaliteit van klok-scan en multi-klok-scan plugins in één plugin te combineren. Kleur co-lokalisatie algoritmes (zoals algoritmen basUitgegeven aan de berekeningen van Pearson's correlatie- of Manders-splitcoëfficiënten) en de ontwikkeling van de plugin om in staat te zijn om te werken met meerdere ROI's die in verschillende afbeeldingen of in verschillende segmenten in een beeldstapel geselecteerd zijn (huidige versie van de plugins maakt het mogelijk om meerdere analyses te analyseren ROI's geselecteerd binnen één afbeelding of een ROI die is geselecteerd voor alle afbeeldingen in de stapel) wordt geïmplementeerd. De auteurs zullen ook alle suggesties van de plugin-gebruikers waarderen en rapporteren van problemen die zich voordoen tijdens het gebruik van bestaande plugins.

Conclusie: De klokscananalyse is een veelbelovend instrument voor beeldvormende studies op vele gebieden van de biologie, van de analyse van statische cellabeling met verschillende markers naar studies van verspreiding van Na ⁺ of Ca ⁺⁺ , in een enkele cel, evenals voor de Analyse van spreidingsactiviteit ( bijv . Ca ⁺⁺ golven) in populaties van synaptisch verbonden cellen ¹⁰ , ¹¹ of gap-junction-gekoppelde cellen ¹² . Andere mogelijke toepassingsgebieden van de klokscananalyse zijn medische beeldanalyse (ultrasoundbeelden van bloedvaten, CT-scanbeelden en botdoorsneden), astronomie (spiraal- en radiale galaxybeelden), chemie (diffusie van een puntbron), Natuurkunde (analyse van diffractiepatronen), bosbouw (boomstammenanalyse om de leeftijd van de boom te bepalen, periodes van droog weer en slechte bevruchting), engineering (metalen pijpkorrosie) en klimatologie (weerradar beeldanalyse).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Computer	Any		compatible with software listed below
ImageJ or Fiji ImageJ	NIH	https://imagej.nih.gov/ij/ or https://fiji.sc/	bundled with Java 1.8 or higher
Clock-scan plugins	freeware	https://sourceforge.net/projects/clockscan/	Clock_Scan-1.0.1 jar and Multi_Clock_Scan-1.0.1/ jar
Origin 9.0	OriginLab	Northampton, MA, USA	This program was used to generate some graphs of the original Clock Scan data. Any other graphic software can be used to perform this function