Clock Scan Protocol für Bildanalyse: ImageJ Plugins

Summary

In diesem Beitrag werden zwei neue ImageJ-Plugins für die "Clock Scan" -Bildanalyse beschrieben. Diese Plugins erweitern die Funktionalität des ursprünglichen Visual Basic 6 Programms und stellen vor allem das Programm einer großen Forschungsgemeinschaft zur Verfügung, indem sie es mit dem ImageJ Free Image Analysis Softwarepaket bündeln.

Abstract

Das Taktabtastprotokoll für die Bildanalyse ist ein effizientes Werkzeug, um die durchschnittliche Pixelintensität innerhalb, an der Grenze und außerhalb (Hintergrund) eines geschlossenen oder segmentierten konvexen Bereichs von Interesse zu quantifizieren, was zur Erzeugung eines gemittelten integralen radialen Pixel- Intensitätsprofil. Dieses Protokoll wurde ursprünglich im Jahr 2006 als visuelles Basic 6-Skript entwickelt, aber als solches hatte es eine begrenzte Verteilung. Um dieses Problem zu lösen und ähnliche jüngsten Bemühungen von anderen zu verknüpfen, haben wir den ursprünglichen Taktsuchprotokollcode in zwei Java-basierte Plugins umgewandelt, die mit NIH-gesponserten und frei verfügbaren Bildanalyseprogrammen wie ImageJ oder Fiji ImageJ kompatibel sind. Darüber hinaus haben diese Plugins mehrere neue Funktionen, die den Umfang der Fähigkeiten des ursprünglichen Protokolls weiter ausbauen, wie etwa die Analyse mehrerer interessanter Bereiche und Bildstapel. Das letztere Merkmal des Programms ist besonders nützlich bei Anwendungen, bei denen es wichtig ist, Änderungen zu ermittelnZu Zeit und Ort. So kann die Taktsuchanalyse von Stapeln biologischer Bilder potentiell auf die Ausbreitung von Na ⁺ oder Ca ⁺⁺ innerhalb einer einzelnen Zelle sowie auf die Analyse der Ausbreitungsaktivität ( z. B. Ca ^{++ -} Wellen) in Populationen synaptisch angewendet werden Zusammengesetzte oder spaltübergreifende Zellen. Hier beschreiben wir diese neuen Uhren-Scan-Plugins und zeigen einige Beispiele für ihre Anwendungen in der Bildanalyse.

Introduction

Das Ziel dieser Arbeit ist es, ein Clock Scan-Protokoll zu präsentieren, das plattformfrei und frei verfügbar für jeden Forscher ist, der an dieser Art von Bildanalyse interessiert ist. Das Clock Scan-Protokoll wurde ursprünglich im Jahr 2006 entwickelt, mit dem Ziel, bestehende Methoden der Pixelintensitätsquantifizierung in konvex-förmigen Regionen von Interesse (ROI) zu verbessern, ein Verfahren, das eine bessere Integrationsfähigkeit und eine verbesserte räumliche Auflösung aufweist. Während der Erfassung sammelt das Protokoll sequentiell mehrere radiale Pixelintensitätsprofile, die vom ROI-Zentrum bis zu seinem Rand abgetastet werden, oder auf eine vorbestimmte Distanz außerhalb des ROI zum Zwecke der Messung der "Hintergrund" -Pixelintensität. Das Protokoll skaliert diese Profile nach dem Zellenradius, gemessen in Richtung des Scans. Somit ist der Abstand von der Mitte zur ROI-Grenze jedes einzelnen radialen Scans immer 100% der X-Skala. Schließlich übertrifft das Programm diese IndividuenAl-Profilen zu einem integralen radialen Pixel-Intensitäts-Profil. Wegen der Skalierung hängt das mittlere Pixel-Intensitätsprofil, das durch das "Clock Scan" -Protokoll erzeugt wird, weder von der ROI-Größe noch von vernünftigen Grenzen auf die ROI-Form ab. Diese Methode ermöglicht einen direkten Vergleich oder, falls erforderlich, Mittelwertbildung oder Subtraktion von Profilen unterschiedlicher ROIs. Das Protokoll erlaubt auch eine Korrektur der integralen Pixelintensitätsprofile, eines beliebigen Objekts für Hintergrundrauschen, durch eine einfache Subtraktion der durchschnittlichen Intensität von Pixeln, die sich außerhalb des Objekts befinden. Obwohl es nur in biologischen Proben getestet wurde, bietet unser Protokoll eine wertvolle Ergänzung zu anderen vorhandenen Bildanalyse-Werkzeugen, die in Studien von Bildern von physikalischen oder chemischen Prozessen verwendet werden, die um einen Ursprungsort herum angeordnet sind (wie die Diffusion von Substanzen aus einer Punktquelle ) ¹ .

Allerdings war die Hauptbeschränkung der ursprünglichen Bildanalyse Methode, dass das Protokoll dev warAls ein Visual Basic 6 (VB6) (Code, und daher war es plattformabhängig und schwer zu verteilen (erfordern VB6). Um dieses Problem zu lösen und um ähnliche jüngsten Bemühungen von anderen Forschern ² beitreten, konvertierten wir die VB6 Clock Scan Programmcode in zwei Java-basierte Plugins, kompatibel mit den NIH-geförderten und frei verfügbaren Open-Source- und plattformunabhängigen Bildanalyseprogrammen, ImageJ ³ und Fiji ImageJ ^4. Darüber hinaus haben diese Plugins nun mehrere neue Funktionen, die die Leistungsfähigkeit erweitern Des ursprünglichen Protokolls, um mehrere ROIs und Bildstapel zu verarbeiten Viele Bildanalyseanwendungen sind nicht benutzerfreundlich, was die statistische Auswertung mehrerer Objekte anbelangt und so werden oft nur repräsentative Daten angezeigt. Mit dem Multi Clock Scan ImageJ Plugin, Es ist möglich, die Analyse mehrerer Objekte gleichzeitig zu erleichtern. Eine robuste statistische Auswertung von Mikroskopiedaten,In Bezug auf die Signalintensitätsverteilung in einzelnen Zellen / Objekten ist nun mit dieser Plugin-Erweiterung möglich. Hier beschreiben wir die Clock Scan Plugins und zeigen Beispiele für ihre Anwendungen in der Bildanalyse.

Protocol

1. Software-Installation

1. Installieren Sie die neuesten Versionen von gebündeltem Java und entweder ImageJ oder Fiji ImageJ wie auf den jeweiligen Webseiten empfohlen (siehe Materialtabelle für Links zu den entsprechenden Websites). Im folgenden Text werden beide Programme als "ImageJ" bezeichnet.
2. Kopiere die Plugin-Dateien "Clock_Scan-1.0.1. Jar" und "Multi_Clock_Scan-1.0.1.jar" mit dem in der Materialtabelle enthaltenen Link und füge sie in das ImageJ-Plugin-Verzeichnis ein. Alternativ verwenden Sie bitte die Option "Plugins | Install Plugin", um diese Dateien zu installieren, nachdem sie auf der Festplatte des Computers gespeichert wurden.

2. Clock Scan Analyse

1. Standard Clock Scan Plugin ( Abbildung 1 ):
   1. Verwenden Sie den Menübefehl ImageJ "File | Open", um ein interessantes Bild zu öffnen.
   2. Klicken Sie auf das Werkzeug 'Polygon' oder 'segmentierte Zeilenauswahl'Werkzeug, und zeichne dann auf das Bild, um den gesamten ROI oder ein Segment dieser Region zu skizzieren. Siehe Abbildung 1 A für ein Beispiel der Polygonauswahl (innere gestrichelte Kontur).
      HINWEIS: Andere Auswahlwerkzeuge, die in der Software (rechteckige, ovale und freihändige Zeilenauswahl) zur Verfügung stehen, können ebenfalls verwendet werden.
   3. Wählen Sie "Plugins | Clock Scan" aus dem Menü, um das Standard-Takt-Scan-Protokoll-Popup-Fenster zu öffnen. Beachten Sie, dass dieser Befehl auch das ROI Manager-Fenster öffnet, wobei die Gliederung automatisch hinzugefügt wird.
   4. Verwenden Sie das Plugin-Optionsfenster, um Folgendes auszuführen.
      1. Überprüfen und ändern Sie die X- und Y-Koordinaten des ROI-Zentrums (automatisch als Koordinaten des physikalischen Massenzentrums berechnet), indem Sie Bildlaufleisten verwenden oder die Werte in den entsprechenden Eingabefeldern ändern. Siehe Abbildung 1 B.
      2. Je nachdem, wie viel von der Hintergrundregion außerhalb des Objekts shoSollte durch das Scannen abgedeckt werden, die Scan-Limits anpassen, indem Sie die Scroll-Leiste "Scan-Limit" verwenden. Siehe Abbildung 1 A.
         HINWEIS: Scan-Limit ist die Bruchzahl, die angibt, wie weit der Scan über die Grenze der Objekte hinausgehen sollte. Der Standardwert ist 1,20, was anzeigt, dass die Scanlänge 20% länger als der Objektradius in Richtung des Scans ist; Siehe Abbildung 1 A , äußere gestrichelte Linie).
      3. Ändern Sie die Ausgabe des Plugins mit "Real Radius", "Subtrahieren Hintergrund", "Polare Transformation" und / oder die "Plot mit Standardabweichung" Kontrollkästchen.
      4. Klicken Sie auf "OK", um das Plugin auszuführen. Siehe Abbildung 1 C-H .
         HINWEIS: Beispiele für die Ausgabe des Protokolls mit "Plot mit Standardabweichung" und "Polare Transformation" oder "Realradius" und "Polar TransfOrm "-Optionen sind in Abbildung 1 C und 1D und Abbildung 1 E bzw. 1F dargestellt. Beachten Sie, dass die berechneten Standardabweichung (SD) die Veränderung zwischen einzelnen radialen Pixelintensitätsscans des Objekts darstellen. Beachten Sie auch die" ROI-Auswahl " Länge "im Plugin-Fenster, die die Informationen über die ROI-Gliederungslänge anzeigt, die in Pixeln gemessen wird.
   5. In dem erzeugten "Clock Scan Profile Plot" verwenden Sie den Befehl "List", um Werte anzuzeigen, die in zwei, X- und Y-Spalten von Daten für Graustufenbilder und in X- und vier Y-Spalten von Daten für RGB-Bilder dargestellt werden, von denen Y0, Y1, Y2 und Y3 werden mit integralen und individuellen (roten, grünen und blauen) Farbkanalpixelintensitätswerten gefüllt.
2. Mehrere ROI Clock Scan Plugin - Arbeiten mit mehreren ROI ( ):
   1. Öffnen Sie ein Bild mit mehreren ROI.
   2. Öffnen Sie den ROI Manager, indem Sie auf "Analysieren | Werkzeuge | ROI Manager" klicken.
   3. Sequenziell skizzieren (siehe Schritt 2.1.2) und füge jeden ROI dem ROI Manager hinzu, indem du im ROI Manager-Fenster auf "Hinzufügen" klickst. Tu das für alle ROIs im Bild. Verwenden Sie den Befehl "Analysieren | Messen", wenn ROI-Metriken von Interesse sind.
      1. Siehe Abbildung 2 A für ein Beispiel für mehrere segmentierte Zeilenauswahl und Abbildung 2 E für ein Beispiel für mehrere Polygonauswahl.
   4. Wählen Sie im Menü "Plugins" die Option "Multi Clock Scan", um das Popup-Fenster für die Protokolloptionen zu öffnen.
   5. Verwenden Sie das Protokolloptionsfenster, um Folgendes auszuführen.
      1. Falls erforderlich, setzen Sie den Scan-Grenzwert nach Schritt 2.1.4.2 zurück; Der Standardwert ist 1,20.
      2. Wenn nötig, wählen Sie das optIonen, um das mittlere Takt-Scan-Profil mit SD-Balken zu markieren, indem man die "Plot mit Standardabweichung" -Kasten überprüft. Siehe Abbildung 2 C und D.
         HINWEIS: Die berechneten SD-Werte stellen eine Variation zwischen integrierten Taktsuchprofilen verschiedener Objekte dar. Beachten Sie auch die Zeile im Plugin-Fenster mit Informationen über die "Anzahl ausgewählter ROIs".
      3. Klicken Sie auf "OK", um das Protokoll auszuführen.
   6. In der generierten "Clock Scan Profile Plot" verwenden Sie den Befehl "List", um die im Fenster "Plot Values" angezeigten Werte darzustellen. Siehe "Multi Clock Scan Profile Plot" Fenster Legende für Spaltenbezeichnung nach Farbkanal.
   7. Beachten Sie, dass die ROIs nummeriert sind und ihre Taktsuchprofile für einen beliebigen Farbkanal in der gleichen Reihenfolge aufgetragen sind, in der die ROIs skizziert und dem "ROI Manager" hinzugefügt wurden.
3. MulTip ROI Clock Scan Plugin - Arbeiten mit einem Bildstack ( Abbildung 3 ):
   1. Öffne einen Bildstapel von Interesse.
   2. Öffnen Sie den ROI Manager, indem Sie auf "Analysieren | Werkzeuge | ROI Manager" klicken.
   3. Planen Sie den ROI der Bilder im Stapel und fügen Sie ihn dem ROI-Manager hinzu, wie in den Schritten 2.1.2 und 2.2.3 beschrieben. Verwenden Sie den Befehl "Analysieren | Messen", wenn die ROI-Metriken von Interesse sind.
   4. Wählen Sie im Menü "Plugins" die Option "Multi Clock Scan", um das Popup-Fenster für die Protokolloptionen zu öffnen.
   5. Verwenden Sie das Protokolloptionsfenster, um Folgendes auszuführen.
      1. Setzen Sie die Scan-Grenze wie in Schritt 2.1.4.2 beschrieben zurück; Der Standardwert ist 1,20.
      2. Wählen Sie die Option, um das mittlere Takt-Scan-Profil mit SD-Balken zu markieren, indem Sie das Feld 'Plot mit Standardabweichung' markieren.
         HINWEIS: Die berechneten SD-Werte stellen eine Variation zwischen verschiedenen Instanzen des im Bild sta markierten Objekts darCk Beachten Sie auch die Zeile im Plugin-Fenster mit Informationen über die "Anzahl der Bilder im Stack".
      3. Klicken Sie auf "OK", um das Protokoll auszuführen.
   6. Im Fenster "Clock Scan Profile Plot" klicken Sie auf "List", um die im Fenster "Plot Values" angezeigten Werte darzustellen, wobei die Y-Spaltennummer die Bildposition innerhalb des Stacks darstellt - 1.

Representative Results

Die Bilder, die hier zur Veranschaulichung verwendet werden, stammen aus Datenbanken, die während unserer früheren Zelle und Gewebe biologischen Studien ^{5 , 6 , 7} und aus dem Allen Maus Gehirn Atlas ^{8 erstellt wurden} . Beide Plugins wurden erfolgreich mit ImageJ 1.50i / Java 1.8.0_77, ImageJ 2.0.0-rc-44 / 1.50e / Java 1.8.9_66 und Fiji ImageJ 2.0.0-rc54 / 1.51g / Java 1.8.0_66 Programmumgebung getestet.

Abbildung 1 zeigt repräsentative Ergebnisse der Bildanalyse mit einem Standard-Clock Scan Plugin. Für beide Plugins sind der Basiscode und die Hauptschritte des Taktsuchvorgangs im Wesentlichen der gleiche wie im ursprünglichen Protokoll ¹ beschrieben. Kurz nachdem der ROI oder ein Segment des ROI auf dem Bild skizziert ist ( Abbildung 1 A , innerer gelber Umriß) und ein Mittelpunkt der Kontur bestimmt (automatisch oder manuell unter Verwendung des Plugin-Optionsfensters, Fig. 1 B ), beginnt die radiale Abtastung der Pixelintensität in einer Richtung von der Mitte zum ersten Pixel des Zelle umreißen und im Uhrzeigersinn pixelweise entlang der Kontur ( Fig. 1 A , gerader Vektor bzw. gekrümmter Pfeil) fortgesetzt, bis alle ROI-Radien gescannt sind. Um die ROI-Hintergrundintensität zu quantifizieren, kann die Länge jeder radialen Abtastung so eingestellt werden, dass sie den Radius des ROI in Richtung des Scans um eine vorgegebene Bruchzahl überschreitet (0,2 oder 20% des Radius in der Voreinstellung für den Wert des Clock Scan-Plugins , Äußere gelbe Linie in Abbildung 1 A ). Gesammelte Radialprofile werden dann durch Skalierung auf die entsprechenden Radien ausgerichtet und gemittelt, um das Integral-Takt-Scan-Intensitätsprofil in 2 zu erzeugen56 Intensitätsstufen von Graustufeneinheiten (Abbildung 1 C ). Für RGB-Bilder erzeugen beide Plugins zusätzlich zu einem kombinierten Farbprofil automatisch unabhängige, integrale radiale Pixelintensitätsprofile für jeden Farbkanal (256 Intensitätsstufen von rot, grün und blau).

Standardmäßig repräsentiert die x-Skala des Taktscan-Pixel-Intensitätsprofils einen normalisierten ROI-Radius, wobei 100% der Skala Pixel repräsentiert, die sich am Rand des ROI befinden (Abbildung 1 C ). Das in Fig. 1 C gezeigte Profil wurde mit der Option "Plot mit Standardabweichung" ausgewählt, und daher zeigt das Diagramm auch die für jeden Datenpunkt berechnete SD entlang der X-Skala des Profils an. Wenn die Option "Subtrahieren Hintergrund" ausgewählt ist, wird das gesamte Intensitätsprofil für Hintergrund Nr. KorrigiertIse durch Punkt-für-Punkt-Subtraktion der mittleren Intensität der Pixel, die zwischen dem ROI-Rand und dem Scan-Grenze-Rand (äußere gelbe Linie in der Abbildung 1 A , Daten nicht gezeigt) liegen. Wenn die Option "Polar-Transformation" gewählt ist, erzeugt das Taktsuch-Plugin ein zusätzliches Ausgabefenster. Es enthält eine polare Transformation des Bildes des ausgewählten Bereichs einschließlich des Scan-Grenzgebietes, in dem das Bild in jeder radialen Scan-Richtung so modifiziert wird, dass der Abstand vom Zentrum zum Rand der Objekte immer auf 100 normiert ist % Und dargestellt durch 100 Pixel. Unabhängig von der tatsächlichen Größe des Objekts sind die vertikalen und horizontalen Abmessungen seines polaren Transformationsbildes das Zweifache der Scangrenze in Pixeln (240 Pixel x 240 Pixel in dem in Fig. 1D gezeigten Beispiel). Schließlich führt die Auswahl der Option "Realradius" zur Erzeugung der Taktsuche prUnd ein Polar-Transformationsbild, skaliert pro tatsächlichen mittleren Radius des Objekts und in den Einheiten der räumlichen Kalibrierung des Originalbildes ( Fig. 1E bzw. F ).

Die Abbildungen 1G und H veranschaulichen zusätzliche Bildanalyseoptionen mit der objektgrößen- und formunabhängigen Polarwandlung und den integrierten ImageJ-Befehlen und Werkzeugen. Beispiele für Befehle, die für bestimmte Arten der Bildanalyse als nützlich erachtet werden können, sind das segmentierte Zeilenwerkzeug und der Befehl "Analysieren | Plotprofil" (Abbildung 1 G ) und der Befehl "Analysieren | Surface Plot" ( Abbildung 1 H ).

Die Abbildungen 2 und 3 zeigen repräsentative Ergebnisse der Bildanalyse mit dem Multi Clock Scan Plugin. Die Ausgabe derMulti-Takt-Scan-Plugin besteht aus zwei Graphen: Der erste Graph zeigt einzelne Taktsuchprofile der ausgewählten Objekte (Abbildung 2 C ) und der zweite Graph zeigt den Mittelwert dieser einzelnen Taktsuchprofile an (± SD, optional, Abbildung 2 D ) . Bei RGB-Bildern ( Bild 2 E ) wird für jedes ausgewählte ROI auch das für jeden einzelnen Farbkanal berechnete Taktsuchprotokoll angezeigt (Abbildung 2 F ), und der Mittelwert wird innerhalb eines gegebenen Kanals für alle ausgewählten Objekte berechnet (Abbildung 2 G ) . Ebenso werden die einzelnen und mittleren Taktsuchprofile für Objekte im Bildstapel nach Durchführung der Taktabtastanalyse des Stapels angezeigt ( Fig. 3A-3D , das mittlere Taktsuchprofil ist nicht gezeigt). Wie bereits erwähnt, die numerischeAl-Daten werden verwendet, um diese Plots zu erzeugen, indem sie den Befehl "Liste" ausführen.

Abbildung 4 zeigt eine zusätzliche Anwendung der Polar-Transformationsoption im Clock Scan-Plugin: seine Eignung für Bildregistrierung und Overlay-Operationen. In dieser Figur wurden ROI-größen- und formunabhängige Polartransformationen verwendet, um die Verteilung der Fluoreszenzmarkierung von Neuronen, die α3-Natrium / Kalium-ATPase-Pumpe exprimieren, zwischen verschiedenen mauskortikalen Regionen zu vergleichen, wobei das Atlasbild die Grenzen und die anatomische Organisation von Diese Bereiche ( Fig. 4A-4B ). Bei einem Taktsuchprotokoll ist die Registrierung von Referenz (Atlas) und die für einen solchen Vergleich benötigten tatsächlichen Bilder auf ein einfaches Verfahren zur Ausrichtung der Bilder beschränkt, um die Struktur von Interesse in beiden Bildern zu skizzieren und dann ROI-Größen- und Form- Unabhängige Polar-Transformationen.In dem in Fig. 4 gezeigten Beispiel zeigt ein Vergleich von polaren Transformationen eindeutig eine ungleichmäßige Verteilung von markierten Zellen in der Maus-Hirnrinde, wobei ihre Dichte in oberflächlichen Bereichen der Schicht 2 / 3rds des motorischen Kortex, dorsalen Teils spezifisch hoch ist Der agranularen Insularkortex, der lateralen Orbitalkortex und in tiefen Schichten des motorischen Kortex ( Fig. 4C-4D ).

Abbildung 1 : Repräsentatives Beispiel für die Anwendung des Clock Scan Plugins für Bildanalyse. ( A ) Fluoreszenzlichtbild eines Abschnittes eines Ratten-Dorsalwurzelganglions, immunostainiert für die α3-Isoform der Na + / K + - ATPase (α3 NKA, siehe Schneider et al. ³ für die Details der Gewebeverarbeitung und -färbung).Eines der neuronalen Profile, dessen Grenze stark für α3 NKA (weiß) markiert ist, wird mit einem Polygonlinienwerkzeug (innere gelbe Linie) umrissen. Radiale Abtastung (weiße Pfeil) -Grenze (äußere gelbe Linie) wurden auf 120% des Objektradius von der Objektmitte (weißer Punkt) bis zum ersten Pixel des Umrisses eingestellt, wie in Panel B (Scan-Scroll-Scroll-Leiste) gezeigt. ( B ) Screenshot des Hauptoptionsfensters des Clock Scan Plugins. ( C ) Plot des integralen Pixel-Intensitäts-Profils der Zelle, die in Panel A gezeigt ist (Mittelwert von 706 Radial-Scan-Profilen, siehe Umrißlänge in B, vertikale Balken sind SD-Balken). ( D ) - Polar-Transformationsbild des untersuchten Zellprofils. ( E ) Clock-Scan-Profil der gleichen Zelle, die mit der Option "Realradius" ausgewählt wurde. Beachten Sie, dass im Gegensatz zum in C gezeigten Profil die x-Skala dieses Profils echte räumliche Kalibriereinheiten (μm) anzeigt. ( F ) Polare Transformation der gleichen Zelle, die mit der Option "real wheelius" ausgewählt. Beachten Sie, dass die Skala dieser Transformation nun in realen Raumkalibriereinheiten (μm) liegt. ( G ) Der in D gezeigte Rand der polaren Transformation wurde mit dem segmentierten Linienwerkzeug umrissen (die Zeilendicke wurde auf 10 Pixel oder 10% der radialen Scanlänge eingestellt) und analysiert. Der Befehl "Analysieren | Plot-Profil" wurde ausgeführt, um die Änderungen der mittleren Markierungsintensität entlang des Randes des Objekts zu messen (jeder Datenpunkt des Graphen repräsentiert die mittlere Intensität aller Pixel über die Auswahllinienbreite). ( H ) Der Befehl "Analysieren | Surface Plot" wurde auf das in Panel D gezeigte Polar-Transformationsbild angewendet, um eine 3-D-Darstellung der Markierungsintensität des Objekts zu erzeugen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 2 : Repräsentatives Beispiel Anwendung der Verwendung von Multi Clock Scan Plugin für Bildanalyse. ( A ) Vier Sehfelder wurden im Abschnitt des Ratten-Dorsalwurzelganglions, das für α3 NKA immunostainiert wurde, erfasst (siehe Abbildung 1 eine Legende). Zur Vereinfachung der Verwendung des Multi-Takt-Scan-Plugins wurden diese Bilder in einen Stapel gelegt und dann mit dem Befehl "Image | Stacks | Make Montage" in ein einzelnes Bild konvertiert. Rote Zeilen und Zahlen geben eine segmentierte Zeilenauswahl von fünf interessierenden Regionen in diesem Bild an. ( B ) Ein Screenshot des Multi Clock Scan-Fensters wird angezeigt, wenn das Plugin verwendet wird, um ein Graustufenbild zu analysieren. ( C ) Individuelle Takt-Scan-Profile von fünf ROIs, die in Panel A gezeigt sind. ( D ) Durchschnittliches Takt-Scan-Profil für ausgewählte ROIs (PanelA) mit SD-Balken (Option "Plot mit Standardabweichung" ausgewählt). ( E ) RGB-Bild von kultivierten Maus-preBI-Lymphozyten, markiert mit 4,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI, Kernfleck, blau) und mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern für β1-Integrin (grün) und F-Aktin (rot , Siehe Dobretsov et al. ⁷ für die Zellkulturtechnik und Yuryev et al. ¹¹ zum Färben von Details). Elf Zellen (siehe Nummernschilder) wurden mit dem ImageJ-Polygon-Auswahlwerkzeug umrissen. Die Panels auf der rechten Seite zeigen die grüne und rote Kanalansicht der Zelle # 7 (rechteckige Auswahl auf der linken Seite), nachdem die Menüfunktion "Bild | Farbe | Split Channels" ausgeführt wurde. ( F ) Einzelne Takt-Scan-Profile (zusammengesetzte und rote, grüne und blaue Farbkanalprofile werden jeweils durch schwarze, rote, grüne und blaue Linien dargestellt). ( G ) Mittlere Taktgeberprofile für alle elf ROIs, die im Panel ausgewählt wurdenE. Farbbezeichnungen wie im Panel G (kein Plot mit Standardabweichungsoption wurde während der Multi Clock Scan Prozedur verwendet). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3 : Multi Clock Scan Plugin und Analyse von Image Stacks. ( A ) Montage von ausgewählten und "gespeichert als Stapel" Bilderrahmen. Ein Bild eines dorsalen Wurzelganglion-Neurons, das mit Differential-Interferenzkontrast (DIC) -Mikroskopie aufgenommen wurde, wird im ersten Rahmen gezeigt. Nachfolgende Rahmen wurden mittels Epi-Illumination-Fluoreszenzmikroskopie zur Überwachung der intrazellulären Calciumkonzentration in verschiedenen Zeitintervallen vor und nach der elektrischen Stimulation der Zelle gewonnen. Zahlen neben dem respektivE Bild gibt die Zeit in ms ^{6 an} . Der Rand der Zelle wurde mit dem DIC-Bild des Stapels umrissen (linksseitiger Rahmen, asterisk zeigt die Patch-Clamp-Pipette zur Aufzeichnung und Füllung der Zelle mit dem kalziumempfindlichen Farbstoff Oregon Green BAPTA-1 (OGB-1) ), Und dann verwendet, um die Multi Clock Scan-Prozedur auf die verbleibenden Bilder laufen. ( B ) Screenshot von Multi Clock Scan-Fenster, wenn das Programm auf einem Stapel von Bildern ausgeführt wird. ( C ) Clock-Scan-Profile des OGB-1-Fluoreszenzsignals in unterschiedlichen Abständen vom Zellzentrum (% des Radius) und zu verschiedenen Zeiten vor und nach der elektrischen Stimulation (Legende in ms). Zur Vorbereitung dieser Grafiken wurde professionelle Grafik-Software verwendet. ( D ) Änderungen der Intensität des OGB-1-Signals mit der Zeit in der Submembran und tieferen zytoplasmatischen Zellregionen (rote und schwarze Kreise bzw. Linien). Um diese Daten zu erhalten, wurden der Mittelwert und der SD für jeden Datenpunkt locat berechnetEd zwischen 20-40% und 70-90% der x-Skala von jedem Takt-Scan-Profil in Panel C (schattierte Bereiche). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4 : Beispiel für die Verwendung des Clock Scan Plugins in Bildregistrierung und Overlay. ( A und B ) Screenshots von Platte 29 aus dem koronalen Abschnitt (Allen Mouse Brain Atlas) und einem 200 μm dicken Vibratom-Abschnitt aus dem Gelatine-eingebetteten Maus-Gehirn, das auf etwa dem gleichen Niveau wie das Atlasbild geschnitten wurde. Die in diesem Beispiel verwendete transgene Maus exprimierte ZsGreen-fluoreszierendes Protein unter dem Promotor von & agr; 3NKA, um & agr; 3NKA-exprimierende Neuronen ^{2 zu} identifizieren. Um das festzustellenKortikale Bereiche, die mit diesen Neuronen spezifisch angereichert sind (helle Punkte auf dem Bild in Tafel B), wurde der gesamte kortikale Bereich skizziert (gelbe gestrichelte Linien), beginnend bei beiden Bildern mit demselben Bezugspunkt (Mittelgrenze zwischen Kortex und Geruch Birne, Pfeile). ( C ) Panels repräsentieren (von links nach rechts): Clock Scan polar transformiert den ROI, der im Atlasbild (Panel A) ausgewählt wurde, innerhalb des Bildes des Maus-Gehirns (Panel B) und Overlay dieser beiden Transformationsbilder ("Image | Overlay | Add Image "-Befehl mit 50% Deckkrafteinstellung). ( D ) Gleiche Bilder wie im Panel C, aber mit den Rändern der großen kortikalen Regionen (wie im Atlas gezeigt), die in zwei anderen Transformationsbildern unter Verwendung des ImageJ-Polygons, segmentierten Linienauswahlwerkzeugen und dem "Analysieren | Werkzeuge | Synchronisieren von Windows" Befehl. Abkürzungen sind die gleichen wie im ursprünglichen Hirnatlas Bild: Motor primäre und sekundäre (MOp, MOs), agranular insular, dorSal-Teil (AId), orbital lateral, ventro-lateral und medial (ORBI, ORBvl, ORBm), vorläufige (PL), anterior cingulate, dorsal part (ACAd) Kortex. Zahlen im MOs-Bereich beziehen sich auf die wichtigsten kortikalen Schichten, die in der Maus-Motorkortex bei der entsprechenden koronalen Hirnniveau unterschieden werden können. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

Clock Scan Protocol: Das Clock Scan Protokoll ist ein schnelles und einfaches Werkzeug der Bildanalyse. Die Vorteile dieses Protokolls im Vergleich zu bestehenden gemeinsamen Ansätzen der Bildanalyse (wie z. B. lineare Pixelintensitätsscans oder Berechnung der mittleren Pixelintensität des ROI) wurden in den vorangegangenen Publikationen ^{1 , 9} ausführlich beschrieben. Kurz gesagt ermöglicht dieses Protokoll die Erzeugung von integralen radialen Pixelintensitätsprofilen durch Quantifizierung der Intensität von Pixeln, die sich in unterschiedlichen Abständen von dem ROI-Zentrum wie dem Rand des Objekts oder einer vorbestimmten Stelle außerhalb des Objekts (Hintergrund) befinden. Wegen der letzteren können die Taktsuchprofile jedes ROI immer für seinen unmittelbaren Hintergrund korrigiert werden, was (in biologischen Anwendungen) dieses Profil weniger abhängig von lokaler, in-the-Probe oder Probe-zu-Probe, Nicht-Uniformitäten macht In Etikettierung / Färbung, sowie Instabilität inDie Intensität der Mikroskop-Lichtquelle oder Fluoreszenzlicht-Belichtungszeiten. Die Objektgröße und die Formunabhängigkeit der Taktsuchprofile erweitern den Anwendungsbereich dieses Protokolls weiter, indem sie die Vergleiche von verschiedenen Objekten sowie die Korrektur durch Punkt-für-Punkt-Subtraktion von Profilen von "positiver" und "negativer" Steuerung ermöglichen Gegenstände.

Clock Scan Plugins: Die Hauptbeschränkung für das Verteilen und Freigeben des ursprünglichen Protokolls war die Plattformabhängigkeit seines Codes, der mit Visual Basic 6.0 (VB) ^{1 , 9} entwickelt wurde. Dieses Problem wurde vor kurzem von einer der Forschungsgruppen am Leibniz-Institut für Molekulare Pharmakologie, Deutschland, durch die Entwicklung eines ähnlichen Fuji ImageJ Clock Scan Plugin ² angesprochen. Das Plug-In des Leibniz-Instituts reproduziert die ursprüngliche Uhr-Scan-Funktionalität in ihrer Fähigkeit, Inte zu erzeugenGral Radial-Scan-Profile für den beiliegenden konvexen ROI, und darüber hinaus können sie Segmente von Umrisse (Bögen) verarbeiten. Allerdings kann die Scan-Grenze des durch ihr Plugin erzeugten Profils nur auf 100% (die Grenze des Objekts) gesetzt werden, was bedeutet, dass die Hintergrundpixelintensität nicht quantifiziert werden kann. Darüber hinaus hat es keine Fähigkeit, polar Transformationen zu erzeugen, mit verschiedenen Farbkanälen in RGB-Bildern zu arbeiten oder mit Stapeln von Bildern zu arbeiten und mehrere ROIs zu verarbeiten. Im Vergleich dazu vervielfachen die beiden hier beschriebenen neuen Plugins die Fähigkeit des ursprünglichen VB-Codes ( dh die Erzeugung von integrierten Taktscan-Pixel-Intensitätsprofilen mit optionaler Anzeige von SDs und / oder Hintergrund-Subtraktionen sowie die Verarbeitung unterschiedlicher Farbkanäle RGB-Bilder). Darüber hinaus können sie einen segment- / bogenförmigen ROI analysieren (Funktionalität, die im Fuji ImageJ Plugin des Leibniz Institute of Molecular Pharmacology ² eingeführt wurde). Weiterhin, thEse-Plugins erweitern den Nutzen früherer Programme, indem sie ROI-größen- und formunabhängige polare ROI-Bildtransformationen erzeugen, die in Anwendungen verwendet werden können, die eine Bildregistrierung erfordern. Schließlich erleichtert das Mehrfachtakt-Scan-Plugin effektiv das Taktsignal von mehreren ROIs, die sich innerhalb des gleichen Bildes oder in einem Bildstapel befinden. Das letztere neue Merkmal des Programms ist besonders nützlich bei Anwendungen, bei denen es wichtig ist, zeitliche und zeitliche Änderungen zu ermitteln.

Einschränkungen und Fehlersuche: Die Hauptbeschränkung der Clock Scan-Methode ist die Voraussetzung für die Auswahl eines konvex-geformten ROI. Das Uhr-Scan-Profil wäre in Situationen sinnlos, wenn irgendwelche von radialen Scans die ROI-Umrisse mehr als einmal überqueren. Dies würde die Normalisierung der Länge eines solchen radialen Scans in Bezug auf die Entfernung von der Mitte zur ROI-Grenze unmöglich machen. Eine weitere Einschränkung ist, dass die Takt-Scan-Profil-Information Progres istIm ROI fehlende radiale Symmetrie. Diese beiden Einschränkungen können jedoch zumindest teilweise durch die Analyse ausgewählter Segmente (Bögen) komplexer und asymmetrischer ROIs überwunden werden. Die Verwendung des Segment-Scans wird auch in Fällen empfohlen, in denen Abschnitte des Hintergrundgebiets markierte Merkmale enthalten, die das Hintergrund-Subtraktionsverfahren beeinflussen können (siehe Abbildung 2A für ein Beispiel für die Auswahl für die Analyse der Zellsegmente, die nicht mit anderen markierten Zellen konfrontiert sind). Wenn schließlich die Analyse von zusammengesetzten Bildern mit mehr als 3 Farbkanälen erforderlich ist, sollten die Farbkanäle dieser Bilder vor dem Ausführen des Plugins aufgeteilt werden.

Zukünftige Richtungen: Zukünftige Verbesserung der Funktionalität dieser Plugins umfasst, aber nicht beschränkt auf die Aktualisierung des Codes, um die Funktionalität von Clock-Scan und Multi-Clock-Scan-Plugins zu einem Plugin zu kombinieren. Farb-Co-Lokalisierungsalgorithmen (wie zB Algorithmen basAuf die Berechnungen von Pearson's Korrelation oder Manders Split Koeffizienten), und die Entwicklung des Plugins in der Lage, mit mehreren ROIs, die in verschiedenen Bildern oder in verschiedenen Scheiben in einem Bildstapel ausgewählt werden (aktuelle Version der Plugins ermöglicht die Analyse von mehreren ROIs, die innerhalb eines Bildes ausgewählt wurden, oder ein ROI, der für alle Bilder im Stapel ausgewählt wurde), werden implementiert. Die Autoren schätzen auch alle Anregungen von den Plugin-Nutzern und Berichte über alle Probleme, die bei der Verwendung vorhandener Plugins auftreten.

Schlussfolgerung: Die Taktsuchanalyse ist ein vielversprechendes Instrument für die Bildgebung von Studien in vielen Bereichen der Biologie, von der Analyse der statischen Zellmarkierung mit verschiedenen Markern bis hin zu Studien der Ausbreitung von Na ⁺ oder Ca ⁺⁺ , in einer einzigen Zelle sowie für die Analyse der Ausbreitungsaktivität ( zB Ca ^{++ -} Wellen) in Populationen von synaptisch verbundenen Zellen ¹⁰ , ¹¹ oder spaltübergang gekoppelten Zellen ¹² . Weitere Anwendungsgebiete der Taktsuchanalyse sind die medizinische Bildanalyse (Ultraschallbilder von Blutgefäßen, CT-Scan-Bildern und Knochenquerschnitten), Astronomie (Spiral- und Radialgalaxie-Bildgebung), Chemie (Diffusion aus einer Punktquelle), Physik (Beugungsmusteranalyse), Forstwirtschaft (Baumstammringanalyse zur Bestimmung des Alters des Baumes sowie Trockenwetter und schlechte Befruchtung), Ingenieurwesen (Metallrohrkorrosion) und Klimatologie (Wetterradarbildanalyse).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Computer	Any		compatible with software listed below
ImageJ or Fiji ImageJ	NIH	https://imagej.nih.gov/ij/ or https://fiji.sc/	bundled with Java 1.8 or higher
Clock-scan plugins	freeware	https://sourceforge.net/projects/clockscan/	Clock_Scan-1.0.1 jar and Multi_Clock_Scan-1.0.1/ jar
Origin 9.0	OriginLab	Northampton, MA, USA	This program was used to generate some graphs of the original Clock Scan data. Any other graphic software can be used to perform this function