Summary
מאמר זה מתאר שני תוספים ImageJ חדשניים לניתוח 'שעון סריקה' תמונה. תוספים אלה להרחיב את הפונקציונליות של התוכנית הבסיסית Visual 6 הבסיסית, והכי חשוב, להפוך את התוכנית זמינה לקהילת מחקר גדול על ידי bundling אותו עם ImageJ חינם תמונה ניתוח תוכנה החבילה.
Abstract
פרוטוקול סריקה השעון לניתוח התמונה הוא כלי יעיל לכמת את עוצמת פיקסל הממוצע בתוך, בגבול, ומחוץ (רקע) סגור או מקוטע באזור בצורת קמור של עניין, מה שמוביל את הדור של אינטגרלי אינטגרלי פיקסל אינטגרלי, פרופיל אינטנסיביות. פרוטוקול זה פותח במקור בשנת 2006, כמו תסריט ויזואלי בסיסי 6, אבל ככזה, זה היה הפצה מוגבלת. כדי לטפל בבעיה זו ולהצטרף לאחרונה המאמצים האחרונים על ידי אחרים, אנו המרה את השעון המקורי לסרוק קוד פרוטוקול לתוך שני מבוססי Java plugins תואם NIH בחסות ו בחופשיות זמין ניתוח תמונות תוכניות כמו ImageJ או פיג 'י ImageJ. יתר על כן, תוספים אלה יש כמה פונקציות חדשות, להרחיב עוד יותר את טווח היכולות של הפרוטוקול המקורי, כגון ניתוח של אזורים מרובים של עניין ערימות התמונה. תכונה זו של התוכנית הוא שימושי במיוחד ביישומים בהם חשוב לקבוע שינויים הקשוריםלזמן ולמיקום. לכן, ניתוח סריקה של השעון של ערימות של תמונות ביולוגיות עשוי להיות מיושם על הפצת Na + או Ca ++ בתוך תא בודד, כמו גם ניתוח של פעילות הפצה ( למשל , גלי ++ Ca) באוכלוסיות של סינפטי מחובר או פער צומת-מצמידים תאים. כאן, אנו מתארים את השעון החדש plugins לסרוק ולהראות כמה דוגמאות של היישומים שלהם בניתוח התמונה.
Introduction
מטרת עבודה זו היא להציג פרוטוקול סרוק השעון כי הוא ללא פלטפורמה חופשית זמין לכל חוקר מעוניין בסוג זה של ניתוח התמונה. פרוטוקול סריקה השעון פותחה במקור בשנת 2006 1 , במטרה לשפר את השיטות הקיימות של כימות פיקסל עוצמת בתוך קמור בצורת אזורים של ריבית (ROI), שיטה שבה יש יכולת אינטגרטיבית טובה יותר ברזולוציה מרחבית משופרת. במהלך הרכישה, פרוטוקול ברצף אוספת מספר רב של פרופילים אינטנסיביות פיקסל רדיאלי, סרוקים ממרכז ROI לגבול שלה, או למרחק קבוע מראש מחוץ ההחזר על ההשקעה לצורך מדידה של עוצמת "פיקסל" הרקע. הפרוטוקול מסמן את הפרופילים לפי רדיוס התא, הנמדד בכיוון הסריקה. לכן, המרחק מהמרכז לגבול ROI של כל סריקה רדיאלית בודדת הוא תמיד 100% של סולם X. לבסוף, התוכנית ממוצעת אלה אינדיבידואליםאל פרופילים לתוך אינטגרל אחד אינטגרלי פרופיל פיקסל אינטנסיביות. בגלל קנה המידה, פרופיל פיקסל בעוצמה מתכוון, המיוצר על ידי פרוטוקול "שעון סריקה", תלוי לא בגודל ROI ולא, בתוך גבולות סבירים, על הצורה ROI. שיטה זו מאפשרת השוואה ישירה, או במידת הצורך, ממוצעים או חיסור של פרופילים של החזרים ROI שונים. הפרוטוקול מאפשר גם תיקון של אינטגרל פיקסל אינטנסיביות פרופילים, של כל אובייקט עבור רעש רקע, על ידי חיסור פשוט של עוצמת הממוצעת של פיקסלים הממוקמים מחוץ לאובייקט. למרות שזה נבדק רק דגימות ביולוגיות, פרוטוקול שלנו מספק תוספת ערך אחרים הקיימים כלי ניתוח התמונה המשמשים מחקרים של תמונות של תהליכים פיסיקליים או כימיים מסודרים סביב נקודת המוצא (כגון דיפוזיה של חומרים ממקור נקודה ) 1 .
עם זאת, המגבלה העיקרית של השיטה המקורית ניתוח התמונה היה כי הפרוטוקול היה dev(VB6) (קוד, ולכן, זה היה תלוי בפלטפורמה וקשה להפיץ (המחייב VB6). כדי להתמודד עם בעיה זו להצטרף למאמצים דומים לאחרונה על ידי חוקרים אחרים 2 , אנו המרה VB6 שעון סריקה תוכנית קוד לתוך שני התוספים מבוססי ג 'אווה, תואם NIH בחסות ו בחופשיות זמין קוד פתוח ו פלטפורמה עצמאית ניתוח תמונות תוכניות, ImageJ 3 ו פיג' י ImageJ 4. יתר על כן, תוספים אלה יש עכשיו כמה פונקציות חדשות להרחיב את היכולת של פרוטוקול המקורי כדי לעבד ROIs מרובים ערימות תמונה.יישומים רבים ניתוח התמונה אינם ידידותיים למשתמש, לגבי ביצוע ניתוח סטטיסטי של אובייקטים מרובים, ולכן, לעתים קרובות רק נתונים נציג מוצגים.עם תוסף רב סריקה Clock ImageJ, ניתן להקל על ניתוח של אובייקטים מרובים בו זמנית.הערכה סטטיסטית חזקה של נתוני מיקרוסקופ,לגבי הפצה עוצמת האות בתאים בודדים / אובייקטים, כעת אפשרי עם תוסף זה plugin. כאן, אנו מתארים את התוספים סריקה השעון ולהראות דוגמאות של היישומים שלהם בניתוח התמונה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. התקנת תוכנה
- התקן את הגרסאות העדכניות ביותר של Java ארוזות או ImageJ או פיג'י ImageJ כפי שמומלץ באתרים המתאימים (ראה טבלת חומרים עבור קישורים לאתרים המתאימים). בטקסט שלהלן, שתי התוכניות נקראות "ImageJ".
- העתק "Clock_Scan-1.0.1 צנצנת" ו "Multi_Clock_Scan-1.0.1.jar" קבצי תוסף באמצעות הקישור בתנאי חומרים השולחן ולהדביק אותם בספרייה תוסף ImageJ. לחלופין, השתמש באפשרות "Plugins | Install plugin" כדי להתקין קבצים אלה לאחר שמירתם בכונן הקשיח של המחשב.
2. ניתוח סריקה השעון
- תוסף שעון רגיל ( איור 1 ):
- השתמש ImageJ "קובץ | פתח" הפקודה בתפריט לפתוח תמונה של עניין.
- לחץ על 'מצולע' כלי, או 'בחירת שורה מקוטע'ולאחר מכן לצייר על התמונה כדי לתאר את ההחזר על ההשקעה כולה או קטע של אזור זה. ראה איור 1 A עבור דוגמה לבחירת מצולע (מתאר מקווקו פנימי).
הערה: ניתן להשתמש גם בכלי בחירה אחרים, הזמינים בתוכנה (בחירה מלבנית, סגלגלה וקו חופשי). - בחר "Plugins | שעון סריקה" מהתפריט כדי לפתוח את חלון שעון רגיל סריקה חלון קופץ חלון אפשרות. שים לב כי פקודה זו תפתח גם את החלון ROI מנהל עם המתאר הוסיף באופן אוטומטי אליו.
- השתמש בחלון אפשרות התוסף כדי לבצע את הפעולות הבאות.
- סקור ושנה את קואורדינטות X ו- Y של מרכז ההחזר על ההשקעה (מחושב אוטומטית כקואורדינטות של מרכז המסה הפיזית) באמצעות פסי גלילה או שינוי הערכים בתיבות הקלט המתאימות. ראה איור 1 ב .
- תלוי כמה אזור הרקע מחוץ אובייקט שוUld להיות מכוסה על ידי סריקה, להתאים את גבולות הסריקה באמצעות סרגל הגלילה "מגבלת סריקה". ראה איור 1 א .
הערה: מגבלת הסריקה היא המספר החלקי המייצג עד כמה הסריקה צריכה להתקדם מעבר לגבולות האובייקטים בכל כיוון נתון; ערך ברירת המחדל הוא 1.20, המציין כי אורך הסריקה יהיה 20% יותר מאשר רדיוס האובייקט בכיוון של סריקה; ראה איור 1 A , קו מקווקו החיצוני). - לשנות את הפלט של תוסף באמצעות "רדיוס אמיתי", "לחסר רקע", "הקוטב המרה" ו / או "העלילה עם סטיית תקן" תיבות.
- לחץ על "אישור" כדי להפעיל את הפלאגין. ראה איור 1 C-H .
הערה: דוגמאות לפלט של הפרוטוקול עם "חלקת עם סטיית תקן" ו "פולאר המרה" או "רדיוס אמיתי" ו "פולאר transfאו "אופציות שנבחרו בתרשים 1 C ו - 1D ותרשים 1 E - ו 1F , בהתאמה, שים לב כי סטיית תקן החישוב (SD) מייצגת את השונות בין סריקות אינטנסיביות של פיקסלים רדיאליים בודדים של האובייקט. אורך "בחלון התוסף, המציג את המידע על אורך החזר ROI שנמדד בפיקסלים.
- ב שנוצר "שעון סריקה פרופיל מגרש", השתמש בפקודה "רשימה" כדי לשרטט ערכים המוצגים בשני, X ו- Y עמודות של נתונים עבור תמונות בקנה מידה אפור ב X ו 4 עמודות Y של נתונים עבור תמונות RGB, אשר Y0, עמודות Y1, Y2 ו- Y3 יהיו מלאות בעוצמת פיקסל הערוץ בעוצמת צבע אינטגרלית ואישית (אדום, ירוק וכחול).
- מספר ROI השעון סריקה תוסף - עבודה עם ROI מרובים (
): - פתח תמונה המכילה החזר ROI מרובה.
- פתח את מנהל החזר ROI על ידי לחיצה על "Analyse | Tools - ROI Manager".
- ברצף מתאר (ראה שלב 2.1.2) ולהוסיף כל החזר ה- ROI למנהל ROI על ידי לחיצה על "הוסף" בחלון מנהל החזר ROI; לעשות זאת עבור כל ההחזר על ההשקעה בתוך התמונה. השתמש בפקודה "ניתוח | מדידה" אם ערכי החזר ה- ROI הם בעלי עניין.
- ראה איור 2 A עבור דוגמה לבחירות מרובות של קוים מפוצלים ואיור 2 E עבור דוגמה לבחירות מצולמות מרובות.
- בחר "Multi Clock Scan" בתפריט "תוספים" כדי לפתוח את חלון האפשרויות המוקפצות.
- השתמש בחלון אפשרות הפרוטוקול כדי לבצע את הפעולות הבאות.
- במידת הצורך, אפס את מגבלת הסריקה בהתאם לשלב 2.1.4.2; ערך ברירת המחדל הוא 1.20.
- אם יש צורך, בחר את optיון לשרטט את ממוצע השעון לסרוק פרופיל עם סורגים SD על ידי סימון "מגרש עם סטיית תקן" התיבה. ראה איור 2 C ו- D.
הערה: ערכי ה- SD המחושבים מייצגים וריאציה בין פרופילי סריקה לשעון אינטגרלי של אובייקטים שונים. כמו כן, שים לב לקו בחלון התוסף המציג מידע על "מספר החזרים ROI שנבחרו". - לחץ על "אישור" כדי להפעיל את הפרוטוקול.
- ב שנוצר "שעון סריקה פרופיל מגרש", השתמש בפקודה "רשימה" כדי לשרטט את הערכים המוצגים בחלון "ערכי מגרש". עיין בחלון חלון "Multi Clock Scan Scan" (חלונית מרובת סריקה של שעון) עבור הגדרת עמודה לפי ערוץ צבעוני.
- שים לב כי החזרים ROIs הם ממוספרים ואת השעון שלהם סריקה פרופילים עבור כל ערוץ צבע נתון הם זממו באותו רצף שבו ROIs תוארו והוסיף "מנהל ROI".
- מולTiple ROI שעון סריקה תוסף - עבודה עם מחסנית תמונה ( איור 3 ):
- פתח תמונה מחסנית של עניין.
- פתח את מנהל החזר ROI על ידי לחיצה על "Analyse | Tools - ROI Manager".
- מתאר את החזר ה- ROI של התמונות בתוך הערימה והוסף אותו למנהל החזר ROI כמתואר בשלבים 2.1.2 ו -2.2.3. השתמש בפקודה "ניתוח | מדידה" אם ערכי החזר ה- ROI הם בעלי עניין.
- בחר "Multi Clock Scan" בתפריט "תוספים" כדי לפתוח את חלון האפשרויות המוקפצות.
- השתמש בחלון אפשרות הפרוטוקול כדי לבצע את הפעולות הבאות.
- אפס את מגבלת הסריקה כמתואר בשלב 2.1.4.2; ערך ברירת המחדל הוא 1.20.
- בחר את האפשרות לשרטט את פרופיל הסריקה הממוצעת של השעון באמצעות סרגלי SD על ידי סימון התיבה 'חריץ סטנדרטי'.
הערה: ערכי ה- SD המחושבים יציגו וריאציה בין מופעים שונים של האובייקט שנבחר בתמונה של התמונהCk. כמו כן, שים לב לקו בחלון התוסף המציג מידע על "מספר התמונות בערימה". - לחץ על "אישור" כדי להפעיל את הפרוטוקול.
- בחלון "שעון סריקה של פרופיל שעון", לחץ על "רשימה" כדי לשרטט את הערכים המוצגים בחלון "ערכי שטח", כאשר מספר העמודה Y מייצג את מיקום התמונה בתוך הערימה - 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התמונות המשמשות כאן לצורך האיור, נלקחות מתוך מסדי נתונים שנוצרו במהלך התא הקודם שלנו ביולוגיה רקמות ביולוגיות 5 , 6 , 7 ו מן המוח אלן המוח אטלס 8 . שני plugins נבדקו בהצלחה באמצעות ImageJ 1.50i / Java 1.8.0_77, ImageJ 2.0.0-rc-44 / 1.50e / Java 1.8.9_66 ו פיג 'י ImageJ 2.0.0-rc54 / 1.51g / Java 1.8.0_66 סביבת התוכנית.
איור 1 מציג תוצאות נציג של ניתוח תמונה עם תוסף סטנדרטי Clock Clock. עבור שני plugins, את הקוד הבסיסי ואת השלבים העיקריים של הליך הסריקה השעון הם בעצם זהה המתואר בפרוטוקול המקורי 1 . בקצרה, לאחר ההחזר על ההשקעה או קטע של ההחזר על ההשקעה מתואר על התמונה ( איור 1) A , מתאר פנימי פנימי) ומרכז של קווי מתאר נקבע (באופן אוטומטי או באופן ידני, באמצעות חלון אפשרות תוסף, איור 1 ב ' ), סריקה רדיאלי של עוצמת פיקסל מתחיל בכיוון מהמרכז אל הפיקסל הראשון של התא מתאר ומתמשך בכיוון השעון פיקסל על ידי פיקסל לאורך המתאר ( איור 1 א , ישר וקטור חץ מעוקל, בהתאמה) עד שכל רדיית ROI נסרקים. כדי לכמת את עוצמת הרקע ROI, אורך כל סריקה רדיאלית עשוי להיות מוגדר לחרוג רדיוס החזר ההשקעה לכיוון הסריקה על ידי מספר חלקי מראש (0.2 או 20% של הרדיוס בברירת המחדל עבור ערך השעון תוסף סריקה , קו צהוב חיצוני באיור 1 א ). פרופילים רדיאליים שנאסף מיושרים אז על ידי קנה המידה לרדי המקביל וממוצע כדי לייצר את אינטגרל שעון סריקה פרופיל אינטנסיביות 256 רמות אינטנסיביות של יחידות מידה אפורה ( איור 1 ג ). עבור תמונות RGB, שני התוספים מייצרים באופן אוטומטי פרופילי אינטגרל אינטגרלי אינטגרלי אינטגרלי לכל ערוץ צבע (256 רמות עוצמת צבעי אדום, ירוק וכחול) בנוסף לפרופיל צבע משולב.
כברירת מחדל, x- בקנה מידה של סריקה השעון עוצמת פיקסל פרופיל מייצג מנורמל ROI רדיוס, עם 100% בקנה מידה המייצג פיקסלים הממוקם על הגבול של ההחזר על ההשקעה ( איור 1 ג ). הפרופיל המוצג באיור 1 C נוצר עם אפשרות "העלילה עם סטיית תקן" שנבחרה, ולכן הגרף מציג גם את ה- SD המחושב עבור כל נקודת נתונים לאורך X של הפרופיל. כאשר נבחרת האפשרות "מחסור ברקע", פרופיל האינטנסיביות כולו מתוקן עבור הרקע לאIse על ידי נקודה על ידי חיסור נקודה של עוצמת מתכוון של פיקסלים הממוקמים בין הגבול ההחזר על ההשקעה ואת הגבול גבול סריקה (הקו הצהוב החיצוני בתרשים 1 א , הנתונים לא מוצג). אם האפשרות "קוטב המרה" נבחרה, תוסף סריקה לשעון יוצר חלון פלט נוסף. היא מכילה המרה קוטבית של התמונה של האזור הנבחר כולל טריטוריה הגבול להגביל, שבו התמונה שונה בכל כיוון סריקה רדיאלי בצורה כזו שהמרחק מהמרכז לגבול של האובייקטים הוא מנורמל תמיד 100 % ומיוצג על ידי 100 פיקסלים. ללא קשר לגודל בפועל של האובייקט, הממדים האנכיים והאופקיים של תמונת הקוטב שלה הם פי שניים ממגבלת הסריקה בפיקסלים (240 פיקסלים x 240 פיקסלים בדוגמה שמופיעה באיור 1 D ). לבסוף, בחירת האפשרות "רדיוס אמיתי" תגרום לדור של שעון הסריקה PROf aile ו קטאר להפוך תמונה, scaled לכל הרדיוס הממוצע של האובייקט ואת יחידות של כיול מרחבי של התמונה המקורית ( איורים 1E ו- F , בהתאמה).
איורים 1G ו- H מדגימים אפשרויות נוספות לניתוח תמונות באמצעות שינוי גודל קוטבי של אובייקט בגודל ובצורה ובפקודות וכלים משולבים של ImageJ. דוגמאות של פקודות, אשר עשוי להיחשב שימושי עבור סוגים מסוימים של ניתוח התמונה, הם כלי קו מפולח ו "Analyse | Plot פרופיל" הפקודה ( איור 1 G ) ואת "מנתח | משטח מגרש" הפקודה ( איור 1 ח ).
דמויות 2 ו 3 להראות נציג תוצאות של ניתוח תמונה עם תוסף סריקה רב השעון. התפוקה שלתוסף סריקה מרובה השעון מורכב משני גרפים: הגרף הראשון מציג הפרט סריקה השעון פרופילים של האובייקטים שנבחרו ( איור 2 ג ), ואת הגרף השני מציג את הממוצע של אלה בודדים השעון הפרט פרופילים (± SD, אופציונלי, איור 2 ד ) . עבור תמונות RGB ( איור 2 E ), פרופיל סריקה השעון מחושב עבור כל ערוץ צבע בודד מוצג גם עבור כל ROI נבחר ( איור 2 F ), ואת הממוצע מחושב בתוך ערוץ נתון עבור כל האובייקטים שנבחרו ( איור 2 G ) . באופן דומה, הפרט וסמן ממוצע השעון פרופילים עבור אובייקטים בערימת התמונה מוצגים לאחר ביצוע ניתוח סריקה השעון של המחסנית ( איורים 3A-3D , פרופיל שעון ממוצע לא מוצג). כאמור, מספרייםאל נתונים משמשים ליצירת אלה מגרשים על ידי ביצוע העלילה "רשימה" הפקודה.
איור 4 ממחיש יישום נוסף של אפשרות המרה של קוטב בתוסף Clock Scan: התאמתו לרישום תמונות ולפעילות שכבת על. בתרשים זה, החזר ROI ו צורה עצמאית הקוטב טרנספורמציות שימשו להשוות את ההתפלגות של תיוג פלואורסצנטי של נוירונים להביע α3 נתרן / אשלגן משאבת ATPase בין אזורים שונים קליפת המוח, עם תמונת אטלס מראה את גבולות הארגון האנטומי של אזורים אלה ( איורים 4 א -4 ב ). עם פרוטוקול סריקת השעון, רישום ההתייחסות (אטלס) והתמונות בפועל הנדרשות להשוואה כזו מוגבלות להליך פשוט של יישור התמונות, המתאר את מבנה העניין בשתי התמונות, ולאחר מכן יוצר גודל ROI וצורה - - טרנספורמציה קוטבית עצמאית.בדוגמה המוצגת בתרשים 4 , השוואה של שינויים קוטביים מראה בבירור הפצה לא אחידה של תאים שכותרתו בקליפת המוח של העכבר, עם הצפיפות שלהם להיות גבוה במיוחד באזורים שטחי של השכבה 2 / 3rds של הקורטקס המוטורי, החלק הגבי של קליפת המוח הקיצונית, הקורטקס האורביטלי לרוחב, ובשכבות עמוקות של הקורטקס המוטורי ( איורים 4C-4D ).
איור 1 : דוגמה מייצגת ליישום של תוסף סריקה לשעון לניתוח תמונות. ( א ) תמונה אור פלואורסצנטי של קטע של גנגליון שורש הגבי השורש immunostained עבור isoform α3 של Na + / K + - ATPase (α3 NKA, ראה Schneider et al 3 לפרטים על עיבוד רקמות מכתים).אחד הפרופילים העצבית, עם הגבולות שלה מסומן בכבדות עבור α3 NKA (לבן), מתואר באמצעות כלי קו מצולע (קו צהוב פנימי). סריקה רדיאלי (חץ לבן) גבולות (הקו הצהוב החיצוני) הוגדרו ל 120% של רדיוס האובייקט, ממרכז האובייקטים (נקודה לבנה) לפיקסל הראשון של המתאר, כפי שמוצג בלוח B (סריקה מגבלת גלילה). ( ב ) צילום מסך של החלון הראשי אפשרות של תוסף סריקה השעון. ( ג ) פרופיל של פרופיל אינטגרל אינטנסיביות בעוצמה של התא המוצג בלוח A (ממוצע של 706 פרופילי סריקה רדיאליים, ראה אורך מתאר ב B, פסי אנכי הם סורגים SD). ( D ) - פולאר להפוך את התמונה של פרופיל התא למד. ( E ) שעון סריקה פרופיל של תא זהה שהושג עם "רדיוס אמיתי" אפשרות שנבחרה. שים לב שבניגוד לפרופיל שמוצג ב- C, x-scile של פרופיל זה מציג יחידות כיול מרחביות אמיתיות (μm). ( F ) טרנספורמציה קוטבית של אותו תא שהושג עם נבחרה האפשרות "רדיוס אמיתי". שים לב כי קנה המידה של טרנספורמציה זו עכשיו ביחידות כיול מרחבי אמיתי (μm). ( G ) הגבול של טרנספורמציה קוטבית, שמוצג ב D, תוארה באמצעות כלי קו מקוטע (עובי הקו נקבע 10 פיקסלים או 10% אורך סריקה רדיאלי) ונותחו. "Analyse | Plot פרופיל" הפקודה בוצעה על מנת למדוד את השינויים בעוצמת תיוג מתכוון לאורך הגבול של האובייקט (כל נקודת נתונים של הגרף מייצג את עוצמת הממוצע של כל פיקסלים על פני רוחב קו הבחירה). ( H ) הפקודה "Analyse | Surface Plot" הוחלה על תמונת המרת הקוטב המוצגת בחלונית D כדי ליצור ייצוג תלת-ממדי של עוצמת התווית של האובייקט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
E 2 "class =" xfigimg "src =" / files / ftp_upload / 55819 / 55819fig2.jpg "/>
איור 2 : דוגמה נציג יישום של שימוש Multi Clock סריקה תוסף עבור ניתוח תמונה. ( א ) ארבעה שדות תצוגה נתפסו בתוך החלק של הגנגליון שורש הגבייה immunostained עבור α3 NKA (ראה איור 1 אגדה). כדי לפשט את השימוש של תוסף סריקה מרובת השעון, תמונות אלה הונחו בערימה ולאחר מכן להמיר לתמונה אחת באמצעות הפקודה "Image | Stacks | Make Montage". קווים ומספרים אדומים מציינים בחירות בקטעים מקטעים של חמישה אזורים בעלי עניין בתמונה זו. ( ב ) צילום מסך של שעון רב סריקה החלון מוצג כאשר התוסף משמש לנתח תמונה בקנה מידה אפור. ( ג ) פרופילים אישיים של סריקת השעון של חמישה החזרים ROI "שמוצג בלוח א. ( D ) פרופיל שעון ממוצע לסריקה עבור החזרים ROI נבחרים (פאנלא) עם סורגים SD (אופציה "העלילה עם סטיית תקן" שנבחרו). ( E ) RGB התמונה של עכבר prebi- לימפוציטים, שכותרתו עם 4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI, כתם גרעיני, כחול) ועם נוגדנים fluorescently שכותרתו עבור β1-integrin (ירוק) ו- F- אקטין (אדום ; ראה Dobretsov et al. 7 עבור טכניקת התרבות התא יוריב ואח '11 עבור פרטים מכתים). 11 תאים (ראה מספר תוויות) תוארו באמצעות הכלי בחירת מצולע ImageJ. לוחות על הצג הימני להציג ערוץ ירוק ואדום של התא # 7 (בחירה מלבנית על הפאנל השמאלי) לאחר "תמונה | צבע | ערוצי הפיצול" פונקציה התפריט בוצע. ( F ) פרופילים אישיים של סריקה לשעון נייד (פרופילים מורכבים ואדומים, ירוקים וכחולים של צבע צבע מוצגים על-ידי קווים שחורים, אדומים, ירוקים וכחולים, בהתאמה). ( G ) ממוצע פרופילי שעון השעון עבור כל אחת עשרה החזרים ROI שנבחרו בלוחה. כינויי צבע כמו בלוח G (לא נעשה שימוש במזימה צבעונית עם אופציית סטיית תקן במהלך הנוהל 'סריקה מרובת שעות'). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3 : שעון רב סריקה Plugin וניתוח של ערימות תמונה. ( א ) מונטאז 'נבחרים ו "נשמר כמו ערימת" מסגרות תמונה. תמונה של נוירון הגנגליון השורש השבי שנתפסו עם הפרעה הפרעה בניגוד (DIC) מיקרוסקופ מוצג במסגרת הראשונה. מסגרות הבאות נרכשו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הקרינה epi כדי לפקח על ריכוז סידן תאיים במרווחי זמן שונים, לפני ואחרי גירוי חשמלי של התא. מספרים ליד הכבודE image מציין זמן ב- ms 6 . הגבול של התא היה מתואר באמצעות תמונה DIC של מחסנית (מסגרת השמאלית העליונה, כוכבית מציין את פיפטה מהדק תיקון המשמש הקלטה ומילוי התא עם צבע סידן רגיש אורגון גרין BAPTA-1 (OGB-1) ), ולאחר מכן להשתמש בו כדי להפעיל את ההליך סריקה מרובת השעון על שאר התמונות. ( ב ) צילום מסך של שעון רב סריקה חלון, כאשר התוכנית מופעלת על ערימת תמונות. ( ג ) פרופילי סריקה של השעון של האות OGB-1 ניאון במרחקים שונים ממרכז התא (% ברדיוס) ו בזמנים שונים לפני ואחרי גירוי חשמלי (אגדה, ב MS). כדי להכין גרפים אלה גרפים תוכנה מקצועית שימש. ( D ) שינויים בעוצמת האות OGB-1 עם הזמן בתת-תת-קרום ואזורי תא ציטופלסמיים עמוקים יותר (עיגולים אדומים ושחורים וקווים, בהתאמה). כדי לקבל נתונים אלה, הממוצע ו- SD חושבו עבור כל locat נקודת נתוניםבין 20-40% לבין 70-90% של x- בקנה מידה של כל פרופיל השעון סריקה שמוצג בלוח ג (אזורים מוצלים). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4 : דוגמה לשימוש בפלאגין 'שעון שעון' ברישום תמונה ובשכבת על. ( A ו- B ) צילומי מסך של צלחת 29 מן הקטע העטרה (אלן עכבר המוח אטלס) ו 200 מיקרומטר בסעיף vibratome עבה מן המוח מוטבע ג 'לטין מוטבע לחתוך בערך באותה רמה כמו התמונה אטלס. עכבר מהונדס המשמש בדוגמה זו היה ביטוי ZsGreen- חלבון פלואורסצנטי תחת promotor של α3NKA, כדי לזהות α3NKA- להביע נוירונים 2 . כדי לקבוע אתאזורים קורטיקליים אשר מועשר במיוחד עם נוירונים אלה (נקודות בהירות על התמונה בלוח ב '), אזור קליפת המוח כולו היה מסומן (קווים מקווקווים צהובים) החל בשתי תמונות עם נקודת התייחסות זהה (באמצע הגבול בין קליפת המוח לבין חוש הריח נורה, חצים). ( C ) לוחות מייצגים (משמאל לימין): השעון סורק קוטב הופך את ההחזר על ההשקעה, נבחר בתוך התמונה אטלס (לוח א '), בתוך התמונה של סעיף המוח העכבר (פאנל B) ואת שכבת של שתי תמונות המרה ("תמונה הוסף תמונה "עם הגדרת אטימות 50%). ( D ) אותן תמונות כמו בלוח C אבל עם הגבולות של אזורי קליפת המוח העיקריים (כפי שמוצג באטלס) המתוארים בשתי תמונות המרה אחרות באמצעות מצולע ImageJ, כלי מבחר מקוטע קו וניתוח "כלים | Synchronize Windows" פקודה. קיצורים זהים לתמונת אטלס המוח המקורית: מוטוריים ראשוניים ומשניים (MOP, MOs), אגרולרי מבודד, dor(חלקות, ORBVL, ORBM), prelimbic (PL), cingulate הקדמי, חלק הגבי (ACAD) קליפת המוח. מספרים באזור MOs מתייחסים השכבות קליפת המוח העיקרי, אשר ניתן להבחין בקליפת המוח העכבר העכבר ברמה המוחית העטרה המתאימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שעון סריקה פרוטוקול: פרוטוקול סריקה השעון הוא כלי מהיר ופשוט של ניתוח התמונה. היתרונות של פרוטוקול זה, לעומת הקיים גישות משותפות של ניתוח תמונה (כגון ליניארי עוצמת פיקסלים סריקה או חישוב של עוצמת פיקסל הממוצע של ההחזר על ההשקעה), תוארו פרטים בפרסומים קודמים 1 , 9 . בקצרה, פרוטוקול זה מאפשר את הדור של אינטגרל אינטגרלי אינטנסיבית אינטנסיבית פרופילים על ידי כימות עוצמת הפיקסלים הממוקם במרחקים שונים ממרכז ROI כגון הגבול של האובייקט, או מיקום שנקבע מראש מחוץ לאובייקט (רקע). בגלל האחרון, פרופילי סריקה של השעון של כל החזר ROI תמיד יכול להיות מתוקן על הרקע המיידי שלו, אשר (ביישומים ביולוגיים) עושה פרופיל זה פחות תלוי המקומי, בתוך המדגם או מדגם לדוגמה, אי אחידות ב תיוג / מכתים, כמו גם חוסר יציבות באת עוצמת האור של המיקרוסקופ מקור או אור פלורסנט חשיפה פעמים. גודל העצם ואת עצמאות הצורה של פרופילי סריקה השעון להרחיב עוד יותר את שטח היישום של פרוטוקול זה על ידי הפעלת השוואות של אובייקטים שונים, כמו גם תיקון על ידי חיסור נקודה נקודה של פרופילים של שליטה "חיובית" ו "שלילית" חפצים.
תוספות לסריקת השעון: המגבלה העיקרית על הפצה ושיתוף של הפרוטוקול המקורי היתה תלות בפלטפורמה של הקוד שלה שפותחה עם Visual Basic 6.0 (VB) 1 , 9 . בעיה זו טופלה לאחרונה על ידי אחת מקבוצות המחקר של מכון לייבניץ של פרמקולוגיה מולקולרית, גרמניה, על ידי פיתוח דומה פוג'י ImageJ שעון סריקה תוסף 2 . התוסף של מכון לייבניץ משחזר את השעון המקורי לסרוק פונקציונליות בסיסית ביכולתה ליצור אינטGral פרופילים סריקה רדיאלי עבור החגורה הקמור צורה הצורה, ובנוסף, זה יכול לעבד קטעים של קווי מתאר (קשתות). עם זאת, מגבלת סריקה של הפרופיל שנוצר על ידי התוסף שלהם יכול להיות מוגדר רק 100% (הגבול של האובייקט), כלומר, עוצמת פיקסל הרקע לא ניתן לכמת. יתר על כן, אין לה יכולת לייצר טרנספורמות קוטביות, לעבוד עם ערוצי צבע שונים בתמונות RGB, או לעבוד עם ערימות של תמונות ולעבד החזרים ROI מרובים. לשם השוואה, שני תוספים חדשים, המתוארים כאן, לשחזר באופן מלא את היכולת של קוד VB המקורי ( כלומר , הדור של אינטגרל שעון לסרוק פיקסל אינטנסיביות פרופילים עם תצוגה אופציונלית של SDs ו / או חיסור רקע, כמו גם עיבוד ערוצי צבע שונים של תמונות RGB). בנוסף, הם יכולים לנתח קטע / ARI בצורת ROI (פונקציונליות הציג את תוסף Fuji ImageJ שפותח במכון לייבניץ של פרמקולוגיה מולקולרית 2 ). יתר על כן, thתוספים ese להרחיב את השירות של תוכניות קודמות על ידי יצירת ROI גודל וצורה עצמאית הקוטב ROI תמורות תמונה, אשר ניתן להשתמש ביישומים הדורשים רישום תמונה. לבסוף, תוסף סריקה מרובת השעון ביעילות מאפשר סריקה השעון של ROIs מרובים הממוקם בתוך אותה תמונה או ערימת תמונה. תכונה חדשה זו של התוכנית שימושי במיוחד ביישומים בהם חשוב לקבוע שינויים הקשורים לזמן ולמיקום.
מגבלות ופתרון בעיות: המגבלה העיקרית של שיטת Clock Clock היא הדרישה לבחור ROI בצורת קמור. פרופיל סריקה השעון יהיה חסר משמעות במצבים כאשר כל סריקות רדיאלי לחצות את מתאר ROI יותר מפעם אחת. זה יגרום לנורמליזציה של אורך הסריקה הרדיאלית, ביחס למרחק מהמרכז לגבול החזר ההשקעה (ROI). מגבלה נוספת היא כי סריקה השעון מידע על הפרופיל הוא progresירידה חדה ב- ROI ללא סימטריה רדיאלית. עם זאת, לפחות בחלקו, אלה שני מגבלות ניתן להתגבר על ידי ניתוח של קטעים נבחרים (קשתות) של מורכבים בצורת ROIs ROIs. שימוש בסריקה קטע מומלץ גם במקרים שבהם חלקים של טריטוריית רקע מכילים תכונות שכותרתו, אשר עשוי להשפיע על הליך חיסור רקע (ראה איור 2 א עבור דוגמה של בחירה לניתוח של אותם קטעים תאים שאינם עומדים תאים אחרים שכותרתו). לבסוף, אם נדרש ניתוח של תמונות מרוכבות המכילות יותר מ -3 ערוצי צבע, יש לפצל את ערוצי הצבע של תמונות אלה לפני הפעלת הפלאגין.
כיוונים עתידיים: שיפור עתידי בפונקציונליות של יישומי פלאגין אלה יכלול, אך לא רק לעדכן את הקוד כדי לשלב את הפונקציונליות של סריקת השעון ורב-שעון תוספים לסריקה לתוסף אחד. צבע אלגוריתם שיתוף לוקליזציה (כגון bas אלגוריתמיםעל החישובים של המתאם של Pearson או מקדמי פיצול מאנדרס), ופיתוח של התוסף כדי להיות מסוגל לעבוד עם ROIs מרובים שנבחרו בתמונות שונות או פרוסות שונות בערימת תמונות (הגרסה הנוכחית של plugins מאפשר ניתוח של מספר החזרים ROI שנבחרו בתוך תמונה אחת או החזר ROI אחד שנבחר עבור כל התמונות בערימה), ייושמו. המחברים גם מעריכים את כל ההצעות של המשתמשים תוסף דוחות של כל הבעיות נתקל במהלך השימוש plugins הקיים.
מסקנה: ניתוח סריקה השעון הוא כלי מבטיח למחקרים הדמיה בתחומים רבים של ביולוגיה, מניתוח תיוג תאים סטטיים עם סמנים שונים למחקרים של התפשטות Na + או Ca + + , בתוך תא בודד, כמו גם עבור ניתוח של פעילות התפשטות ( למשל , גלי ++ Ca) באוכלוסיות של תאים מחוברים סינפטית 10 , 11 או הצומת הפער מצמידים תאים 12 . תחומים אחרים של היישום של ניתוח סריקה של השעון כוללים ניתוח תמונות רפואיות (תמונות אולטרה-סאונד של כלי דם, צילומי CT-CT וחיתוך חתך עצמות), אסטרונומיה (הדמיה של גלקסיות ספירליות וגלריות רדיאליות), כימיה (דיפוזיה ממקור נקודה) פיזיקה (ניתוח דפוס עקיפה), ייעור (עץ גזע טבעת ניתוח כדי לקבוע את הגיל של העץ, כמו גם תקופות של מזג אוויר יבש הפריה עניים), הנדסה (קורוזיה צינור מתכת) ו קלימטולוגיה (מזג אויר ראדאר ניתוח תמונה).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים או ניגודי עניינים אחרים.
Acknowledgments
אנו מודים לד"ר טניה מריץ וד"ר פביאן Feutlinske (מכון לייבניץ של פרמקולוגיה מולקולרית, ברלין, גרמניה) לחלוק איתנו את הגירסה של Fuji ImageJ שעון סריקה תוסף ומעורר השראה לנו לפתח את הגירסה של התוכנית. אנו מודים גם לד"ר פריץ מלצ'רס (המחלקה לפיתוח לימפוציטים, מכון מקס פלנק לזיהום ביולוגיה) על רשותו להשתמש בתמונות ממסד הנתונים של המחלקה שלו לצורך בדיקה ושיפור של התוסף. תמיכה: המרכז עבור מדעי המוח טרנסציונל; מענק NIH: P30-GM110702-03.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Computer | Any | compatible with software listed below | |
| ImageJ or Fiji ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ or https://fiji.sc/ | bundled with Java 1.8 or higher |
| Clock-scan plugins | freeware | https://sourceforge.net/projects/clockscan/ | Clock_Scan-1.0.1 jar and Multi_Clock_Scan-1.0.1/ jar |
| Origin 9.0 | OriginLab | Northampton, MA, USA | This program was used to generate some graphs of the original Clock Scan data. Any other graphic software can be used to perform this function |
References
- Dobretsov, M., Romanovsky, D. "Clock-scan" protocol for image analysis. Am J Physiol Cell Physiol. 291, 869-879 (2006).
- Feutlinske, F., Browarski, M., Ku, M. C., et al. Stonin1 mediates endocytosis of the proteoglycan NG2 and regulates focal adhesion dynamics and cell motility. Nat Commun. 6, 8535 (2015).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, 676-682 (2012).
- Dobretsov, M., Hastings, S. L., Stimers, J. R. Non-uniform expression of alpha subunit isoforms of the Na+/K+ pump in rat dorsal root ganglia neurons. Brain Res. 821, 212-217 (1999).
- Hayar, A., Gu, C., Al-Chaer, E. D. An improved method for patch clamp recording and calcium imaging of neurons in the intact dorsal root ganglion in rats. J Neurosci Methods. 173, 74-82 (2008).
- Dobretsov, M., Pierce, D., Light, K. E., Kockara, N. T., Kozhemyakin, M., Wight, P. A. Transgenic mouse model to selectively identify alpha3 Na,K-ATPase expressing cells in the nervous system. Society for Neuroscience. , Online Program No. 123.01/B54 1 (2015).
- Lein, E. S., Hawrylycz, M. J., Ao, N., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445, 168-176 (2007).
- Romanovsky, D., Mrak, R. E., Dobretsov, M. Age-dependent decline in density of human nerve and spinal ganglia neurons expressing the alpha3 isoform of Na/K-ATPase. Neuroscience. 310, 342-353 (2015).
- Campbell, J., Singh, D., Hollett, G., et al. Spatially selective photoconductive stimulation of live neurons. Front Cell Neurosci. 8, 142 (2014).
- Yuryev, M., Pellegrino, C., Jokinen, V., et al. In vivo Calcium Imaging of Evoked Calcium Waves in the Embryonic Cortex. Front Cell Neurosci. 9, 500 (2015).
- Qiao, M., Sanes, J. R. Genetic Method for Labeling Electrically Coupled Cells: Application to Retina. Front Mol Neurosci. 8, 81 (2015).
