画像解析のためのクロックスキャンプロトコル：ImageJ Plugins

Summary

本稿では、「クロックスキャン」画像解析用の2つの新しいImageJプラグインについて説明します。これらのプラグインは、オリジナルのビジュアルベーシック6プログラムの機能を拡張し、ImageJフリー画像解析ソフトウェアパッケージにバンドルすることで、大規模な研究コミュニティでプログラムを利用できるようにします。

Abstract

画像解析のためのクロックスキャンプロトコルは、関心のある閉じられたまたはセグメント化された凸状の関心領域内で、境界内および外側（背景）内の平均ピクセル強度を定量化するための効率的なツールであり、強度プロファイル。このプロトコルはもともとは視覚的な基本6スクリプトとして2006年に開発されましたが、そのようなものとしては配布が限られていました。この問題に対処し、他の人たちによる同様の最近の取り組みに参加するために、オリジナルのクロックスキャンプロトコルコードを、ImageJやFiji ImageJのようなNIHが提供する自由に利用可能な画像分析プログラムと互換性のある2つのJavaベースのプラグインに変換しました。さらに、これらのプラグインには、複数の関心領域や画像スタックの分析など、元のプロトコルの機能の範囲をさらに広げるいくつかの新しい機能があります。プログラムの後者の機能は、アプリケーションに関連する変更を決定することが重要であるアプリケーション時間と場所へ。したがって、生物学的画像のスタックのクロックスキャン分析は、単一細胞内のNa ⁺またはCa ⁺⁺の広がり、ならびにシナプス的集団における拡散活性（ 例えば 、Ca ⁺⁺波）の分析に潜在的に適用され得る結合またはギャップジャンクション結合細胞である。ここでは、これらの新しいクロックスキャンプラグインについて説明し、画像解析におけるアプリケーションのいくつかの例を示します。

Introduction

この作業の目的は、このタイプの画像解析に関心を持つ研究者にとって、プラットフォームフリーで、自由に利用できるクロックスキャンプロトコルを提示することです。クロックスキャンプロトコルは、2006年¹月に開発されたもので、凸面形状領域（ROI）内のピクセル強度定量化の既存の方法を改善する目的で開発されました。取得中、プロトコルは、「バックグラウンド」ピクセル強度を測定する目的で、ROI中心からその境界にスキャンされた複数の放射状のピクセル強度プロファイル、またはROI外の所定の距離を順次収集する。プロトコルは、スキャンの方向に測定されたセル半径に従って、これらのプロファイルをスケーリングする。したがって、個々のラジアルスキャンの中心からROI境界までの距離は、常にXスケールの100％です。最後に、プログラムはこれらの個体を平均化する1つの積分放射状ピクセル強度プロファイルに変換する。スケーリングのために、「クロックスキャン」プロトコルによって生成される平均ピクセル強度プロファイルは、ROIサイズにも、妥当な限度内でもROI形状には依存しません。この方法では、異なるROIのプロファイルを直接比較したり、必要に応じて平均化または減算を行うことができます。また、このプロトコルは、物体の外側に位置する画素の平均強度の簡単な減算によって、背景雑音に対する任意の物体の積分画素強度プロファイルの補正を可能にする。生物学的試料中でのみ試験されているが、本発明者らのプロトコールは、原点（例えば、点源からの物質の拡散など）の周囲に配置された物理的または化学的プロセスの画像の研究に用いられる他の既存の画像分析ツール） ¹ 。

しかし、元の画像解析方法の主な制限は、プロトコルがdevこの問題に対処し、他の調査者²による同様の最近の取り組みに参加するために、VB6のクロックスキャン（VB6）を変換しました（Visual Basic 6（VB6）プログラムコードを2つのJavaベースのプラグインに統合し、NIHが提供し、自由に利用できるオープンソースとプラットフォームに依存しない画像解析プログラムImageJ ³とFiji ImageJ ^4と互換性があります。複数のROIと画像スタックを処理するための元のプロトコルを使用しています。多くの画像解析アプリケーションは、複数のオブジェクトの統計解析を行う上でユーザーフレンドリーではないため、同時に複数の物体の分析を容易にすることが可能である顕微鏡画像データの堅牢な統計的評価、単一のセル/オブジェクトにおける信号強度分布に関しては、このプラグイン拡張で可能になりました。ここでは、Clock Scanプラグインについて説明し、画像解析におけるアプリケーションの例を示します。

Protocol

1.ソフトウェアのインストール

1. バンドルされたJavaの最新バージョンと、ImageJまたはFiji ImageJのいずれかをそれぞれのWebサイトにインストールしてください（対応するWebサイトへのリンクはマテリアル表を参照してください）。以下のテキストでは、両方のプログラムを「ImageJ」と呼びます。
2. マテリアル表で提供されるリンクを使用して、 "Clock_Scan-1.0.1。jar"と "Multi_Clock_Scan-1.0.1.jar"プラグインファイルをコピーし、ImageJプラグインディレクトリに貼り付けます。または、「プラグイン|プラグインのインストール」メニューオプションを使用して、これらのファイルをコンピュータのハードドライブに保存した後にインストールします。

2.クロックスキャン解析

1. 標準クロックスキャンプラグイン（ 図1 ）：
   1. 関心のある画像を開くには、ImageJ "File | Open"メニューコマンドを使用します。
   2. 'ポリゴン'ツール、または '線分の分割'をクリックします。ツールを使用して、イメージを描画して、ROI全体またはこの領域の一部を概説します。ポリゴン選択の例については、 図1Aを参照してください（内側の破線の輪郭）。
      注記：ソフトウェアで利用できる他の選択ツール（長方形、楕円形、フリーハンドライン選択）も使用できます。
   3. メニューから「プラグイン|クロックスキャン」を選択すると、標準のクロックスキャンプロトコルポップアップオプションウィンドウが開きます。このコマンドは、アウトラインが自動的に追加されたROIマネージャウィンドウも開きます。
   4. プラグインオプションウィンドウを使用して次の操作を行います。
      1. スクロールバーを使用するか、対応する入力ボックスの値を変更して、ROIセンターのX座標とY座標を確認して変更します（物理的な中心の座標として自動的に計算されます）。 図 1Bを参照のこと。
      2. オブジェクトの外側の背景領域の大きさに応じてスキャンによってカバーされる場合は、「スキャンリミット」スクロールバーを使用してスキャンリミットを調整します。 図1Aを参照してください。
         注：スキャンリミットは、任意の方向のオブジェクトの境界を越えてスキャンをどのくらい進めるべきかを表す小数です。デフォルト値は1.20で、スキャンの長さはスキャン方向の​​オブジェクトの半径よりも20％長くなります。 図1A 、外側の破線参照）。
      3. 「実半径」、「背景を減算する」、「極座標変換」、および/または「標準偏差のプロット」チェックボックスを使用して、プラグインの出力を変更します。
      4. [OK]をクリックしてプラグインを実行します。 図 1C-Hを参照のこと 。
         注記：「標準偏差を有するプロット」および「極座標変換」または「実半径」および「極座標変換」を有するプロトコルの出力の例は、図 1Cおよび図 1Dおよび図 1Eおよび1Fにそれぞれ選択された「orm」オプションが示されている。計算された標準偏差（SD）値は、対象物の個々の放射状ピクセル強度走査間の変化を表す。プラグインウィンドウに「長さ」の行が表示され、ピクセル単位で測定されたROIのアウトライン長に関する情報が表示されます。
   5. 生成された "Clock Scan Profile Plot"では、 "List"コマンドを使用して、グレースケール画像用の2つのX列とY列のデータと、RGB画像のX列と4列のY列に表示される値をプロットします。 Y1、Y2およびY3列は、整数および個別の（赤、緑および青）カラーチャネル画素強度値で満たされる。
2. 複数のROIクロックスキャンプラグイン - 複数のROI（ ）：
   1. 複数のROIを含む画像を開きます。
   2. [分析|ツール| ROIマネージャ]をクリックしてROIマネージャを開きます。
   3. ROIマネージャウィンドウで「追加」をクリックして、ROIマネージャに各ROIを追加します（手順2.1.2を参照）。イメージ内のすべてのROIに対してこれを行います。 ROIメトリックが関心のある場合は、「Analyze | Measure」コマンドを使用します。
      1. 複数の線分選択の例については図2Aを参照し、複数のポリゴン選択の例については図 2Eを参照のこと。
   4. [プラグイン]メニューの[マルチクロックスキャン]を選択すると、プロトコルオプションのポップアップウィンドウが開きます。
   5. プロトコルオプションウィンドウを使用して以下を実行します。
      1. 必要に応じて、ステップ2.1.4.2に従ってスキャン制限をリセットします。デフォルト値は1.20です。
      2. 必要に応じて、opt標準偏差でプロットする]チェックボックスをオンにしてSDバーで平均クロックスキャンプロファイルをプロットします。 図 2CおよびDを参照のこと 。
         注：計算されたSD値は、異なるオブジェクトの積分クロックスキャンプロファイル間の変化を表します。また、「選択したROIの数」に関する情報を表示するプラグインウィンドウの行に注意してください。
      3. [OK]をクリックしてプロトコルを実行します。
   6. 生成された "Clock Scan Profile Plot"では、 "List"コマンドを使用して、 "Plot Values"ウィンドウに表示される値をプロットします。カラーチャネルによる列指定については、「マルチクロックスキャンプロファイルプロット」の凡例を参照してください。
   7. ROIには番号が付けられており、任意のカラーチャネルのクロックスキャンプロファイルは、ROIがアウトライン化されて「ROIマネージャ」に追加されたのと同じ順序でプロットされます。
3. マルROIクロックスキャンプラグイン - イメージスタックを使用して作業する（ 図3 ）：
   1. 関心のある画像スタックを開きます。
   2. [分析|ツール| ROIマネージャ]をクリックしてROIマネージャを開きます。
   3. スタック内の画像のROIを概説し、ステップ2.1.2および2.2.3で説明したようにROIマネージャに追加します。 ROIメトリックが関心のある場合は、 "Analyze | Measure"コマンドを使用します。
   4. [プラグイン]メニューの[マルチクロックスキャン]を選択すると、プロトコルオプションのポップアップウィンドウが開きます。
   5. プロトコルオプションウィンドウを使用して以下を実行します。
      1. 手順2.1.4.2の説明に従ってスキャン制限をリセットします。デフォルト値は1.20です。
      2. '標準偏差でプロットする'チェックボックスをオンにすると、SDバーで平均クロックスキャンプロファイルをプロットするオプションを選択します。
         注：計算されたSD値は、画像ステーションで選択されたオブジェクトの異なるインスタンス間の変化を表しますck。また、「スタック内の画像数」に関する情報を表示するプラグインウィンドウの行に注意してください。
      3. [OK]をクリックしてプロトコルを実行します。
   6. "Clock Scan Profile Plot"ウィンドウで、 "List"をクリックして "Plot Values"ウィンドウに表示される値をプロットします。ここで、Y列番号はスタック内の画像位置を表します。

Representative Results

説明目的でここで使用されている画像は、以前の細胞および組織の生物学的研究^5,6,7およびAllen Mouse Brain Atlas ⁸から作成されたデータベースから取得されています。どちらのプラグインも、ImageJ 1.50i / Java 1.8.0_77、ImageJ 2.0.0-rc-44 / 1.50e / Java 1.8.9_66、およびFiji ImageJ 2.0.0-rc54 / 1.51g / Java 1.8.0_66プログラム環境を使用して正常にテストされました。

図1は、標準のClock Scanプラグインによる画像解析の代表的な結果を示しています。両方のプラグインで、クロックスキャン手順の基本コードと主要なステップは、元のプロトコル^1で説明したものと本質的に同じです。簡単に説明すると、ROIまたはROIのセグメントが画像上に輪郭が描かれた後（ 図1 図 1B ）を使用して、ピクセル強度の放射状走査は、中心から第1ピクセルまでの方向に開始する（ 図 1B ）。すべてのROI半径がスキャンされるまで、アウトラインに沿ってピクセルごとに時計回りに時計回りに継続します（ 図1A 、直線ベクトルと曲線矢印）。 ROIバックグラウンド強度を定量化するために、各ラジアルスキャンの長さは、スキャン方向の​​ROIの半径を予め設定された分数（Clock Scanプラグインの値のデフォルトでは0.2または20％ 、 図1Aの外側の黄色の線）。収集された半径方向プロファイルは、その後、対応する半径にスケーリングすることによって整列され、平均化されて、2で積分クロック走査強度プロファイルを生成するグレースケール単位の56輝度レベル（ 図 1C ）。 RGB画像の場合、両方のプラグインは、結合されたカラープロファイルに加えて、各カラーチャンネル（赤、緑、青の256色の強度レベル）ごとに独立した積分放射状ピクセル強度プロファイルを自動的に生成します。

デフォルトでは、クロックスキャンピクセル強度プロファイルのxスケールは、ROIの境界に位置するピクセルを表す100％のスケールで、正規化されたROI半径を表します（ 図 1C ）。 図 1Cに示されるプロファイルは、「標準偏差を有するプロット」オプションが選択されて生成されたものであり、したがって、グラフは、プロファイルのXスケールに沿って各データポイントについて計算されたSDも表示する。 「背景を減算する」オプションが選択されると、輝度プロファイル全体がバックグラウンドで補正されます。ROI境界とスキャン限界境界（ 図1Aの外側の黄色の線;データは示されていない）との間に位置するピクセルの平均強度の点毎の減算によるise。 「極座標変換」オプションが選択されている場合、クロックスキャンプラグインは追加の出力ウィンドウを生成します。スキャン限界領域を含む選択された領域の画像の極座標変換を含み、オブジェクトの中心から境界までの距離が常に100に正規化されるように画像が各放射スキャン方向で修正される％で表され、100ピクセルで表されます。物体の実際のサイズにかかわらず、その極座標変換画像の垂直および水平の寸法は、走査限界のピクセル（ 図 1Dに示す例では240画素×240画素）の2倍である。最後に、 "real radius"オプションを選択すると、クロックスキャンの生成が行われます。原画像の空間的較正の単位（ 図1EおよびF ）において、物体の実際の平均半径ごとにスケーリングされた極座標変換および極座標変換画像を生成する。

図1Gおよび図 1Hは、オブジェクトのサイズおよび形状に依存しない極座標変換および統合されたImageJコマンドおよびツールを使用する追加の画像解析オプションを示す。特定のタイプの画像解析に有用と思われるコマンドの例は、セグメント化された線ツールと "Analyze | Plot Profile"コマンド（ 図 1G ）と "Analyze | Surface Plot"コマンド（ 図 1H ）です。

図2と3は、Multi Clock Scanプラグインによる画像解析の代表的な結果を示しています。の出力マルチクロックスキャンプラグインは、選択されたオブジェクト（ 図 2C ）の個々のクロックスキャンプロファイルを表示し、2番目のグラフは、これらの個々のクロックスキャンプロファイル（±SD、オプション、 図 2D ） 。 RGBイメージ（ 図 2E ）では、選択された各ROI（ 図 2F ）ごとに計算されたクロック・スキャン・プロファイルも表示され、選択されたすべてのオブジェクト（ 図 2G ） 。同様に、スタックのクロックスキャン分析を行った後に、画像スタック内のオブジェクトの個々のおよび平均クロックスキャンプロファイルが表示される（ 図3A〜3D 、平均クロックスキャンプロファイルは示されていない）。前述したように、数値プロット「リスト」コマンドを実行することによって、これらのプロットを生成するために使用される。

図4は、Clock Scanプラグインにおける極座標変換オプションの1つの追加の応用例を示しています。画像登録とオーバーレイ操作に対する適合性。この図では、異なるマウス皮質領域間のα3ナトリウム/カリウム-ATPアーゼポンプを発現するニューロンの蛍光標識の分布を比較するために、ROIのサイズおよび形状に依存しない極座標変換を用いた。アトラス画像は、境界および解剖学的組織を示す。これらの領域（ 図4A~図4B ）。クロックスキャンプロトコルでは、参照（アトラス）の登録とそのような比較に必要な実際のイメージは、イメージを整列させ、両方のイメージで関心のある構造を概説し、ROIサイズと形状を生成する単純な手順に限定されます。独立した極座標変換です。図4に示す例では、極性変換の比較は、マウス大脳皮質における標識細胞の不均一な分布を明確に示しており、その密度は、運動皮質の2/3層の表面領域、背側部分（図4C〜 図4D ）、運動皮質の深い層では、運動野皮質皮質、外側軌道皮質、および深層部において、

図1 ：画像解析のためのクロックスキャンプラグインのアプリケーションの代表的な例 （ A ）Na + / K + -ATPアーゼのα3アイソフォーム（α3NKA;組織処理および染色の詳細についてはシュナイダー（Schneider ）他 ³参照）について免疫染色されたラット背側根神経節の切片の蛍光光画像。ニュートラルプロファイルの1つは、α3NKA（白）のために重くラベル付けされた境界線がポリゴン線ツール（内側の黄色の線）を使用して輪郭が描かれています。パネルB（スキャン限界スクロールバー）に示すように、放射状スキャン（白い矢印）の限界（外側の黄色の線）は、オブジェクトの中心（白い点）から輪郭の最初のピクセルまでのオブジェクト半径の120％に設定されました。 （ B ）Clock Scanプラグインのメインオプションウィンドウのスクリーンショット。 （ C ）パネルAに示されたセルの積分ピクセル強度プロファイルのプロット（706のラジアルスキャンプロファイルの平均、Bの輪郭長さを参照;垂直バーはSDバーである）。 （ D ） - 研究した細胞プロファイルの極座標変換画像。 （ E ） "実半径"オプションを選択して得られた同じセルのクロック走査プロファイル。 Cで示されるプロファイルとは異なり、このプロファイルのxスケールは実際の空間較正単位（μm）を表示することに注意してください。 （ F ）得られた同じ細胞の 「実半径」オプションが選択されています。この変換のスケールは、実際の空間較正単位（μm）になっていることに注意してください。 （ G ）Dで示される極座標変換の境界線を、セグメント化された線ツール（線の太さを10ピクセルまたは半径方向の走査長の10％に設定）を使用して輪郭を描き、分析した。 「Analyze | Plot Profile」コマンドを実行して、対象物の境界に沿った平均ラベリング強度の変化を測定した（グラフの各データ点は、選択線幅にわたる全ピクセルの平均強度を表す）。 （ H ）「解析|表面プロット」コマンドをパネルDに示す極座標変換画像に適用して、対象物のラベリング強度の3D表示を作成した。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

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図2 ：画像解析用のマルチクロックスキャンプラグインを使用した代表的なアプリケーション例。 （ A ）α3NKAについて免疫染色されたラット後根神経節の切片内に4つの視野が捕捉された（ 図1A の凡例参照）。マルチクロックスキャンプラグインの使用を簡略化するために、これらのイメージをスタックに入れ、 "Image | Stacks | Make Montage"コマンドを使用して単一のイメージに変換しました。赤い線と数字は、この画像内の5つの関心領域のセグメント化された線の選択を示す。 （ B ）プラグインを使用してグレースケール画像を解析すると、マルチクロックスキャンウィンドウのスクリーンショットが表示されます。 （ C ）パネルAに示されている5つのROIの個々のクロック走査プロファイル（ D ）選択されたROIの平均クロック走査プロファイル（パネルA）にSDバー（オプション "標準偏差プロット"が選択されている）を表示します。 （緑）およびF-アクチン（赤）の蛍光標識抗体で標識された培養マウスpreBIリンパ球の（ E ）RGB画像、4,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI、核染色、青） ;細胞培養技術についてはDobretsov ら ⁷ 、染色の詳細についてはYuryev ら ¹¹参照）。 ImageJポリゴン選択ツールを使用して、11個のセル（番号ラベルを参照）を説明しました。右側のパネルは、 "Image | Color | Split Channels"メニュー機能が実行された後に、セル＃7（左パネルの長方形選択）の緑と赤のチャンネルビューを示しています。 （ F ）個々のセルクロックスキャンプロファイル（コンポジットおよびレッド、グリーンおよびブルーのカラープロファイルは、それぞれ黒、赤、緑および青の線で示される）。 （ G ）パネルで選択されたすべての11個のROIの平均クロックスキャンプロファイルE.パネルGのような色の指定（マルチ・クロック・スキャン手順中に標準偏差オプション付きプロットは使用されなかった）。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図3 ：マルチクロックスキャンプラグインと画像スタックの解析 （ A ）選択され、「スタックとして保存された」画像フレームのモンタージュ。微分干渉コントラスト（DIC）顕微鏡で捕捉された後根神経節ニューロンの画像が、最初のフレームに示されている。その後のフレームは、落射蛍光顕微鏡を用いて、細胞の電気刺激の前後で、異なる時間間隔で細胞内カルシウム濃度をモニターするために取得された。尊敬の隣にある数字画像はms単位の時間を示します。細胞の境界は、スタックのDIC画像（左上のフレーム;星印は、カルシウム感受性色素Oregon Green BAPTA-1（OGB-1）で細胞を記録および充填するために使用したパッチクランプピペットを示し、 ）、残りの画像に対してマルチクロックスキャン手順を実行するために使用されます。 （ B ）プログラムが画像のスタック上で実行されるときのマルチクロックスキャンウィンドウのスクリーンショット。 （ C ）細胞の中心からの異なる距離（半径の％）および電気刺激の前後の異なる時間（凡例、ms）におけるOGB-1蛍光シグナルのクロック走査プロファイル。これらのグラフを準備するために、プロフェッショナルなグラフ作成ソフトウェアが使用された。 （ D ）膜下およびより深い細胞質細胞領域（それぞれ赤および黒の円および線）における時間に伴うOGB-1シグナルの強度の変化。これらのデータを得るために、平均およびSDを各データポイントlocatパネルC（斜線部）に示される各クロック走査プロファイルのxスケールの20〜40％と70〜90％との間にある。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図4 ：画像登録とオーバーレイでのクロックスキャンプラグインの使用例 （ AおよびB ）冠状切片（Allen Mouse Brain Atlas）からのプレート29およびアトラス画像とほぼ同じレベルで切断されたゼラチン包埋マウス脳からの厚さ200μmのビブラトーム切片のスクリーンショット。この実施例で使用したトランスジェニックマウスは、α3NKAを発現するニューロン²を同定するために、α3NKAのプロモーターの下でZsGreen蛍光タンパク質を発現していた。決定するこれらのニューロンに特異的に豊富な皮質領域（パネルBの画像上の明るい点）では、皮質領域全体が、同じ参照点（皮質と嗅覚の中間境界）を有する両方の画像から始まり、輪郭が描かれた（黄色の破線）電球;矢印）。 （ C ）パネルは（左から右へ）：クロック・スキャン・ポーラは、アトラス画像（パネルA）内で選択されたROIを、マウスの脳切片（パネルB）の画像およびこれら2つの変換画像のオーバーレイ| Overlay | Add Image "コマンドで50％不透明度設定）。 （ D ）ImageJポリゴン、分割線選択ツール、および "Analyze | Tools | Synchronize Windows"を使用して、他の2つの変換イメージで概要を示した、大部分の皮質領域の境界線（パネルにあるように）コマンド。略語はオリジナルの脳のアトラスのイメージと同じです：モーターの一次と二次（MOp、MOs）、顆粒状の島、dor（ORBI、ORBv1、ORBm）、前脳（PL）、前部帯状回、背部（ACAd）皮質からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。 MO領域の数字は、主要な皮質層を指し、適切な冠状脳レベルでマウス運動皮質で区別することができる。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

Discussion

クロックスキャンプロトコル：クロックスキャンプロトコルは、画像解析の迅速かつ簡単なツールです。画像解析の既存の一般的なアプローチ（線形ピクセル強度スキャンまたはROIの平均ピクセル強度の計算など）と比較して、このプロトコルの利点は、先の刊行物1,9に詳細に記載されている。手短に言えば、このプロトコルは、対象物の境界線または対象外の所定の位置（背景）などのROI中心からの異なる距離に位置するピクセルの強度を定量化することによって積分放射状ピクセル強度プロファイルを生成することを可能にする。後者のために、各ROIのクロックスキャンプロファイルは、（生物学的用途で）このプロファイルをローカル、サンプル内、またはサンプル間の不均一性標識/染色において、ならびに顕微鏡の光源の強度または蛍光暴露時間。クロックスキャンプロファイルのオブジェクトサイズと形状の独立性により、さまざまなオブジェクトの比較を可能にし、「ポジティブ」および「ネガティブ」コントロールのプロファイルのポイントごとの減算による補正を有効にすることによって、このプロトコルの適用範囲がさらに拡大されますオブジェクト。

クロックスキャンプラグイン：元のプロトコルの配布と共有の主な制限は、Visual Basic 6.0（VB）1,9で開発されたコードのプラットフォーム依存でした。この問題は、最近、ドイツのLeibniz分子生物学研究所の研究グループの1人が同様のFuji ImageJ Clock Scanプラグイン^{2を開発して解決しました} 。 Leibniz Instituteのプラグインは、元のクロックスキャンの基本機能をinteを生成する能力で再現します囲まれた凸形状のROIについてのグラム放射状走査プロファイルを生成し、さらに輪郭（アーク）のセグメントを処理することができる。ただし、プラグインによって生成されるプロファイルのスキャン限界は100％（オブジェクトの境界線）にしか設定できません。つまり、背景ピクセルの強度を定量化できません。さらに、極座標変換を生成したり、RGB画像のさまざまなカラーチャネルで作業したり、画像のスタックを処理したり、複数のROIを処理する能力はありません。比較すると、ここに記載されている2つの新しいプラグインは、元のVBコードの能力を完全に再現します（SDの任意の表示、および/またはバックグラウンドの減算による積分クロックスキャンピクセル強度プロファイルの生成、 RGB画像）。さらに、セグメント/円弧状のROI（Leibniz Institute of Molecular Pharmacology ^2で開発されたFuji ImageJプラグインで導入された機能）を分析することができます。さらに、th画像の登録が必要なアプリケーションで使用できる、ROIサイズと形状に依存しない極座標ROI画像変換を生成することにより、以前のプログラムのユーティリティを拡張します。最後に、マルチクロックスキャンプラグインは、同一画像内または画像スタック内に位置する複数のROIのクロックスキャンを効果的に促進する。プログラムの後者の新機能は、時間と場所に関連する変更を判断することが重要なアプリケーションで特に役立ちます。

制限とトラブルシューティング：クロックスキャン方式の主な制限は、凸形状のROIを選択する必要があることです。ラジアルスキャンのいずれかがROI輪郭を複数回通過する状況では、クロックスキャンプロファイルは無意味になります。これは、中心からROI境界までの距離に関するこのような放射状スキャンの長さの正規化を不可能にする。別の制限は、クロックスキャンプロファイル情報がプログレッシブ半径方向の対称性がないROIが積極的に減少した。しかし、少なくとも部分的に、これらの2つの制限は、複雑形状のROIおよび非対称ROIの選択されたセグメント（アーク）の分析によって克服することができる。バックグラウンド領域のセクションにラベル付きフィーチャが含まれている場合にも、セグメントスキャンを使用することをお勧めします（バックグラウンド減算手順に影響する可能性があります（ 図2Aを参照して、他のラベルセルに面していないセルセグメントの分析の選択例を参照）。最後に、3つ以上のカラーチャンネルを含む合成画像の解析が必要な場合、プラグインを実行する前にこれらの画像のカラーチャンネルを分割する必要があります。

今後の方向性：これらのプラグインの機能の将来的な改善には、クロックスキャンとマルチクロックスキャンプラグインの機能を1つのプラグインに統合するコードの更新が含まれますが、これに限定されません。カラー共定位化アルゴリズム（例えば、アルゴリズムbasPearsonの相関係数やManders分割係数の計算）、画像スタック内の異なる画像や異なるスライスで選択された複数のROIで作業できるようになるプラグインの開発（現在のバージョンのプラグインでは、 1つのイメージ内で選択されたROIまたはスタック内のすべてのイメージに対して選択された1つのROI）が実装されます。また、プラグインのユーザーからの提案や、既存のプラグインの使用中に発生した問題の報告もあります。

結論：時計スキャン分析は、様々なマーカーによる静的細胞標識の分析から、単一細胞内およびNa ⁺またはCa ^++の広がりの研究まで、生物学の多くの分野における画像研究の有望なツールであるシナプス連結細胞の集団における拡散活性（ 例えば 、Ca ⁺⁺波）の分析¹⁰ 11またはギャップジャンクション結合セル^12を含む 。クロックスキャン分析の他の適用可能な領域としては、医用画像分析（血管の超音波画像、CTスキャン画像および骨断面）、天文学（螺旋および放射状銀河画像化）、化学（点源からの拡散）林業（木の年齢を決定するための樹幹リング解析、乾燥気象と肥料の不足期間）、工学（金属パイプ腐食）、気候学（気象レーダー画像解析）など、

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Computer	Any		compatible with software listed below
ImageJ or Fiji ImageJ	NIH	https://imagej.nih.gov/ij/ or https://fiji.sc/	bundled with Java 1.8 or higher
Clock-scan plugins	freeware	https://sourceforge.net/projects/clockscan/	Clock_Scan-1.0.1 jar and Multi_Clock_Scan-1.0.1/ jar
Origin 9.0	OriginLab	Northampton, MA, USA	This program was used to generate some graphs of the original Clock Scan data. Any other graphic software can be used to perform this function