Protocolo de varredura do relógio para análise de imagem: plugins ImageJ

Summary

Este artigo descreve dois novos plugins ImageJ para análise de imagem 'Clock Scan'. Esses plugins expandem a funcionalidade do programa original visual 6 básico e, o mais importante, disponibilizam o programa para uma grande comunidade de pesquisa, agrupando-o com o pacote de software de análise de imagem gratuito ImageJ.

Abstract

O protocolo de varredura do relógio para análise de imagem é uma ferramenta eficiente para quantificar a intensidade média de pixels dentro, na borda e fora (fundo) de uma região de interesse convexa fechada ou segmentada, levando à geração de um pixel radial integral integral, Perfil de intensidade. Este protocolo foi originalmente desenvolvido em 2006, como um script básico visual 6, mas, como tal, teve distribuição limitada. Para resolver esse problema e se juntar a esforços recentes semelhantes por parte de outros, convertimos o código original do protocolo de varredura do relógio em dois plugins baseados em Java compatíveis com programas de análise de imagens patrocinados pelo NIH e livremente disponíveis, como ImageJ ou Fiji ImageJ. Além disso, esses plugins possuem várias funções novas, expandindo ainda mais a gama de recursos do protocolo original, como análise de múltiplas regiões de interesse e pilhas de imagens. O último recurso do programa é especialmente útil em aplicativos em que é importante determinar as mudanças relacionadasAo tempo e à localização. Assim, a análise da varredura do relógio de pilhas de imagens biológicas pode potencialmente ser aplicada à disseminação de Na ⁺ ou Ca ⁺⁺ em uma única célula, bem como à análise da atividade de espalhamento ( por exemplo , ondas de Ca ⁺⁺ ) em populações de forma sináptica - células acopladas ou juntas separadas. Aqui, descrevemos esses novos plugins de verificação de relógio e mostramos alguns exemplos de suas aplicações na análise de imagens.

Introduction

O objetivo deste trabalho é apresentar um protocolo de varredura de relógio que seja livre de plataforma e livremente disponível para qualquer pesquisador interessado neste tipo de análise de imagem. O protocolo Clock Scan foi desenvolvido originalmente em 2006 ¹ , com o objetivo de melhorar os métodos existentes de quantificação de intensidade de pixels dentro de regiões de interesse convexas (ROI), um método que possui melhor capacidade de integração e resolução espacial melhorada. Durante a aquisição, o protocolo coleciona seqüencialmente vários perfis de intensidade de pixel radial, digitalizados do centro ROI para a sua borda ou a uma distância predeterminada fora do ROI com o objetivo de medir a intensidade do pixel "background". O protocolo dimensiona esses perfis de acordo com o raio da célula, medido na direção da varredura. Assim, a distância do centro para a margem ROI de cada varredura radial individual é sempre 100% da escala X. Finalmente, o programa mede esse indivíduoPerfis em um perfil de intensidade de pixel radial integral. Devido à escala, o perfil médio de intensidade de pixel, produzido pelo protocolo "Clock Scan", não depende nem do tamanho do ROI nem, dentro de limites razoáveis, na forma ROI. Este método permite comparação direta ou, se necessário, média ou subtração de perfis de ROIs diferentes. O protocolo também permite a correção dos perfis integrados de intensidade de pixels, de qualquer objeto para o ruído de fundo, por uma simples subtração da intensidade média dos pixels localizados fora do objeto. Embora apenas tenha sido testado em amostras biológicas, nosso protocolo fornece uma adição valiosa a outras ferramentas de análise de imagem existentes usadas em estudos de imagens de processos físicos ou químicos dispostos em torno de um ponto de origem (como a difusão de substâncias de uma fonte pontual ) ¹ .

No entanto, a principal limitação do método de análise de imagem original foi que o protocolo foi dev.Eliminou-se como um Visual Basic 6 (VB6) (código e, portanto, era dependente da plataforma e difícil de distribuir (exigindo VB6). Para resolver este problema e juntar-se a esforços recentes semelhantes de outros investigadores ² , convertimos o VB6 Clock Scan Codifique o programa em dois plugins baseados em Java, compatíveis com os programas de análise de imagem independentes da plataforma open-source patrocinados pelo NIH e livremente disponíveis, ImageJ ³ e Fiji ImageJ ^4. Além disso, esses plugins possuem várias funções novas que expandem a capacidade Do protocolo original para processar vários ROIs e pilhas de imagens. Muitas aplicações de análise de imagem não são fáceis de usar, no que diz respeito à análise estatística de múltiplos objetos e, portanto, muitas vezes apenas dados representativos são mostrados. Com o plugin Multi Clock Scan ImageJ, É possível facilitar a análise de objetos múltiplos simultaneamente. Uma avaliação estatística robusta dos dados de microscopia,No que diz respeito à distribuição da intensidade do sinal em células / objetos únicos, agora é possível com esta extensão de plugin. Aqui, descrevemos os plugins do Clock Scan e mostramos exemplos de suas aplicações na análise de imagens.

Protocol

1. Instalação de software

1. Instale as versões mais recentes do Java agrupado e ImageJ ou Fiji ImageJ conforme recomendado nos respectivos sites (consulte a tabela de materiais para obter links para os sites correspondentes). No texto abaixo, ambos os programas são referidos como "ImageJ".
2. Copie os arquivos de plugin "Clock_Scan-1.0.1. Jar" e "Multi_Clock_Scan-1.0.1.jar" usando o link fornecido na tabela de materiais e cole-os no diretório do plugin ImageJ. Como alternativa, use a opção de menu "Plugins | Instalar o plugin" para instalar esses arquivos depois de terem sido salvos no disco rígido do computador.

2. Análise de varredura do relógio

1. Plugin de verificação de relógio padrão ( Figura 1 ):
   1. Use o comando de menu ImageJ "Arquivo | Abrir" para abrir uma imagem de interesse.
   2. Clique na ferramenta 'polígono' ou 'seleção de linha segmentada'Ferramenta, e depois desenhe a imagem para descrever todo o ROI ou um segmento dessa região. Veja a Figura 1 A para um exemplo de seleção de polígono (contorno de traço interno).
      NOTA: Outras ferramentas de seleção, disponíveis no software (seleção de linha retangular, oval e a mão livre) também podem ser usadas.
   3. Selecione "Plugins | Clock Scan" no menu para abrir a janela de opção pop-up do protocolo de varredura do relógio padrão. Observe que esse comando também abrirá a janela ROI Manager com o contorno adicionado automaticamente a ele.
   4. Use a janela de opções do plugin para fazer o seguinte.
      1. Revise e altere as coordenadas X e Y do centro ROI (calculado automaticamente como coordenadas do centro de massa física) usando barras de rolagem ou alterando os valores nas caixas de entrada correspondentes. Veja a Figura 1 B.
      2. Dependendo de quanto da região de fundo fora do objeto shoVocê deve estar coberto pela digitalização, ajuste os limites de digitalização usando a barra de rolagem "limite de digitalização". Veja a Figura 1 A.
         NOTA: O limite de digitalização é o número fracionado que representa a distância que a verificação deve prosseguir além da borda dos objetos em qualquer direção; O valor padrão é 1.20, indicando que o comprimento da varredura será 20% maior do que o raio do objeto na direção da varredura; Veja a Figura 1 A , linha tracejada externa).
      3. Modifique a saída do plugin usando as caixas de seleção "raio real", "subtrair fundo", "transformação polar" e / ou "traçar com desvio padrão".
      4. Clique em "OK" para executar o plugin. Veja a Figura 1 C-H .
         NOTA: Exemplos da saída do protocolo com "trama com desvio padrão" e "transformada polar" ou "raio real" e "polar transfOrm "selecionadas são mostradas na Figura 1 C e 1D e Figura 1 E e 1F , respectivamente. Observe que os valores de desvio padrão calculado (SD) representam a variação entre varreduras de intensidade de pixel radial individuais do objeto. Observe também a" seleção ROI Comprimento "na janela do plugin, que exibe as informações no comprimento do contorno ROI medido em pixels.
   5. No "Lote de perfil de digitalização de relógio" gerado, use o comando "Listar" para traçar valores exibidos em duas colunas de dados X e Y para imagens em escala de cinza e em X e quatro colunas Y de imagens RGB, das quais Y0, As colunas Y1, Y2 e Y3 serão preenchidas com valores de intensidade de pixel do canal de cor integral e individual (vermelho, verde e azul).
2. Múltiplo ROI Clock Scan plugin - trabalhando com ROI múltiplo ( ):
   1. Abra uma imagem contendo vários ROI.
   2. Abra o ROI Manager clicando em "Analisar | Ferramentas | Gerenciador de ROI".
   3. Sequencialmente descreva (veja o passo 2.1.2) e adicione cada ROI ao ROI Manager, clicando em "Adicionar" na janela ROI Manager; Faça isso para todos os ROIs dentro da imagem. Use o comando "Analisar | Medir" se as métricas ROI forem de interesse.
      1. Veja a Figura 2 A para um exemplo de múltiplas seleções de linha segmentada e Figura 2 E para um exemplo de múltiplas seleções de polígono.
   4. Selecione "Multi Clock Scan" no menu "Plugins" para abrir a janela pop-up das opções de protocolo.
   5. Use a janela de opção de protocolo para fazer o seguinte.
      1. Se necessário, reponha o limite de digitalização conforme o passo 2.1.4.2; O valor padrão é 1.20.
      2. Se necessário, selecione a opçãoPara traçar o perfil médio de varredura do relógio com barras SD, verificando a caixa "Traçar com desvio padrão". Veja a Figura 2 C e D.
         NOTA: Os valores de SD calculados representarão variação entre perfis de varredura de relógio integral de objetos diferentes. Além disso, observe a linha na janela do plugin que exibe informações no "número de ROIs selecionados".
      3. Clique em "OK" para executar o protocolo.
   6. No "Roteiro de perfil de verificação de relógio" gerado, use o comando "Listar" para traçar os valores exibidos na janela "Lote de valores". Consulte a legenda da janela "Multi Clock Scan Profile Plot" para a designação da coluna por canal de cores.
   7. Observe que os ROIs são numerados e seus perfis de varredura de relógio para qualquer canal de cor são traçados na mesma seqüência em que os ROIs foram delineados e adicionados ao "Gerenciador de ROI".
3. MulPlugin de verificação do relógio ROI da Tiple - trabalhando com uma pilha de imagens ( Figura 3 ):
   1. Abra uma imagem-pilha de interesse.
   2. Abra o ROI Manager clicando em "Analisar | Ferramentas | Gerenciador de ROI".
   3. Descreva o ROI das imagens dentro da pilha e adicione-o ao gerenciador de ROI como descrito nas etapas 2.1.2 e 2.2.3. Use o comando "Analisar | Medir" se as métricas ROI forem de interesse.
   4. Selecione "Multi Clock Scan" no menu "Plugins" para abrir a janela pop-up das opções de protocolo.
   5. Use a janela de opção de protocolo para fazer o seguinte.
      1. Repor o limite de digitalização conforme descrito na etapa 2.1.4.2; O valor padrão é 1.20.
      2. Selecione a opção para traçar o perfil médio de varredura do relógio com barras SD, verificando a caixa 'Traçar com desvio padrão'.
         NOTA: Os valores de SD calculados representarão a variação entre diferentes instâncias do objeto selecionado na imagem staCk. Além disso, observe a linha na janela do plugin que exibe informações sobre o "número de imagens na pilha".
      3. Clique em "OK" para executar o protocolo.
   6. Na janela "Relógio Scan Profile Plot", clique em "List" para traçar os valores exibidos na janela "Plot Values", onde o número da coluna Y representa a posição da imagem dentro da pilha - 1.

Representative Results

As imagens que são usadas aqui para fins ilustrativos são tiradas de bancos de dados criados durante nossos estudos biológicos biológicos de células e tecidos anteriores ^{5 , 6 , 7} e do Allen Mouse Brain Atlas ⁸ . Ambos os plugins foram testados com sucesso usando ImageJ 1.50i / Java 1.8.0_77, ImageJ 2.0.0-rc-44 / 1.50e / Java 1.8.9_66 e Fiji ImageJ 2.0.0-rc54 / 1.51g / Java 1.8.0_66 ambiente do programa.

A Figura 1 mostra resultados representativos da análise de imagem com um plugin Padrão de verificação de relógio. Para ambos os plugins, o código básico e os principais passos do procedimento de verificação do relógio são essencialmente os mesmos descritos no protocolo original ¹ . Resumidamente, após o ROI ou um segmento do ROI é delineado na imagem ( Figura 1 A , contorno amarelo interno) e um centro de contorno é determinado (de forma automática ou manual, usando a janela de opção do plugin, Figura 1 B ), a varredura radial da intensidade de pixels começa em uma direção do centro para o primeiro pixel do Esboço da célula e continua no sentido horário pixel-por-pixel ao longo do contorno ( Figura 1 A , vetor reto e seta curva, respectivamente) até que todos os raios ROI sejam digitalizados. Para quantificar a intensidade de fundo do ROI, o comprimento de cada varredura radial pode ser ajustado para exceder o raio do ROI na direção da varredura por um número fracionável predefinido (0,2 ou 20% do raio em default para o valor do plugin Clock Scan , Linha amarela externa na Figura 1 A ). Os perfis radiais coletados são então alinhados por escala nos raios correspondentes e em média para produzir o perfil integral de intensidade da varredura do relógio em 256 níveis de intensidade de unidades de escala de cinza ( Figura 1 C ). Para imagens RGB, ambos os plugins produzem automaticamente perfis de intensidade de pixel radial integral independente para cada canal de cores (256 níveis de intensidade de cores vermelhas, verdes e azuis), além de um perfil de cor combinado.

Por padrão, a escala x do perfil de intensidade do pixel da varredura do relógio representa o raio ROI normalizado, com 100% da escala representando pixels localizados na borda do ROI ( Figura 1 C ). O perfil mostrado na Figura 1 C foi gerado com a opção "plotar com desvio padrão" selecionada e, portanto, o gráfico também exibe o SD calculado para cada ponto de dados ao longo da escala X do perfil. Quando a opção "subtrair fundo" é selecionada, todo o perfil de intensidade é corrigido para o fundo nãoPor subtração ponto-a-ponto da intensidade média dos pixels localizados entre a borda ROI e a borda limite de digitalização (linha amarela externa na Figura 1 A , dados não mostrados). Se a opção "Transformação polar" for selecionada, o plugin de verificação de relógio gera uma janela de saída adicional. Contém uma transformada polar da imagem da região selecionada, incluindo o território limite de varredura, na qual a imagem é modificada em cada direção de varredura radial de tal maneira que a distância do centro para a borda dos objetos é sempre normalizada para 100 % E representado por 100 pixels. Independentemente do tamanho real do objeto, as dimensões verticais e horizontais de sua imagem de transformação polar são duas vezes o limite de digitalização em pixels (240 pixels x 240 pixels no exemplo mostrado na Figura 1 D ). Finalmente, selecionar a opção de "raio real" resultará na geração do relógio de varreduraOfile e uma imagem de transformação polar, dimensionada pelo raio médio real do objeto e nas unidades de calibração espacial da imagem original ( Figuras 1E e F , respectivamente).

As Figuras 1G e H ilustram opções adicionais de análise de imagem usando a transformada polar independente de tamanho e tamanho do objeto e os comandos e ferramentas ImageJ integrados. Exemplos de comandos, que podem ser considerados úteis para certos tipos de análise de imagem, são a ferramenta de linha segmentada e o comando "Analisar Perfil do gráfico" ( Figura 1 G ) e o comando "Analisar | Plotamento de superfície" ( Figura 1 H ).

As Figuras 2 e 3 mostram resultados representativos da análise de imagem com o plugin Multi Clock Scan. A saída doO plug-in de varredura multi-relógio consiste em dois gráficos: o primeiro gráfico mostra perfis de varredura de relógio individuais dos objetos selecionados ( Figura 2 C ) e o segundo gráfico exibe a média desses perfis de varredura de relógio individuais (± SD, opcional; Figura 2 D ) . Para as imagens RGB ( Figura 2 E ), o perfil de varredura do relógio calculado para cada canal de cor individual também é exibido para cada ROI selecionado ( Figura 2 F ) e a média é calculada dentro de um determinado canal para todos os objetos selecionados ( Figura 2 G ) . Da mesma forma, os perfis de varredura de relógio individuais e médios para objetos na pilha de imagens são exibidos após realizar a análise de varredura de relógio da pilha ( Figuras 3A-3D , o perfil médio de varredura de relógio não está mostrado). Conforme mencionado anteriormente, o numéricoTodos os dados são usados ​​para gerar esses gráficos executando o comando "Listar" da trama.

A Figura 4 ilustra uma aplicação adicional da opção de transformação polar no plugin Clock Scan: sua adequação para o registro de imagens e as operações de sobreposição. Nesta figura, as transformações polares independentes de tamanho e forma-ROI foram usadas para comparar a distribuição da marcação de fluorescência de neurônios que expressam a bomba de sódio / potássio-ATPase α3 entre diferentes regiões corticais do mouse, com a imagem do atlas mostrando as fronteiras e a organização anatômica de Estas regiões ( Figuras 4A-4B ). Com um protocolo de varredura de relógio, o registro de referência (atlas) e as imagens reais necessárias para essa comparação estão limitadas a um procedimento simples de alinhamento das imagens, descrevendo a estrutura de interesse em ambas as imagens e, em seguida, gerando tamanho ROI e forma- Transformações polares independentes.No exemplo mostrado na Figura 4 , uma comparação das transformações polares demonstra claramente uma distribuição não uniforme de células marcadas no córtex do cérebro do mouse, sendo sua densidade especificamente elevada em áreas superficiais da camada 2 / 3rds do córtex motor, parte dorsal Do córtex insular agrário, do córtex orbitário lateral e das camadas profundas do córtex motor ( Figuras 4C-4D ).

Figura 1 : Exemplo representativo de Aplicação do Plugin de verificação de relógio para análise de imagem. ( A ) Imagem de luz fluorescente de uma seção de um ganglio de raiz dorsal de rato imunossinado para a isoforma α3 da Na + / K + - ATPase (α3 NKA, ver Schneider et al., ³ para os detalhes do processamento e coloração de tecidos).Um dos perfis neuronais, com a borda muito marcada para α3 NKA (branco), é delineado usando uma ferramenta de linha de polígono (linha amarela interna). Os limites de varredura radial (seta branca) (linha amarela externa) foram configurados para 120% do raio do objeto, desde o centro do objeto (ponto branco) até o primeiro pixel do contorno, como mostrado no painel B (barra de rolagem do limite de digitalização). ( B ) Captura de tela da janela da opção principal do plugin Clock Scan. ( C ) Lote do perfil de intensidade de pixel integral da célula mostrada no painel A (média de 706 perfis de varredura radial, ver o comprimento do contorno em B; barras verticais são barras SD). ( D ) - Imagem de transformação polar do perfil celular estudado. ( E ) Perfil de varredura do relógio da mesma célula obtida com a opção de "raio real" selecionada. Observe que, ao contrário do perfil mostrado em C, a escala x deste perfil exibe unidades de calibração espacial reais (μm). ( F ) Transformação polar da mesma célula obtida com a Opção de "raio real" selecionada. Note-se que a escala desta transformação está agora em unidades de calibração espacial real (μm). ( G ) A borda da transformação polar, mostrada em D, foi delineada usando a ferramenta de linha segmentada (a espessura da linha foi definida como 10 pixels ou 10% do comprimento da varredura radial) e analisada. O comando "Analisar o Perfil de Plotamento" foi executado para medir as mudanças na intensidade de rotulagem média ao longo da borda do objeto (cada ponto de dados do gráfico representa a intensidade média de todos os pixels na largura da linha de seleção). ( H ) O comando "Analisar | Placar de Superfície" foi aplicado à imagem de transformação polar mostrada no painel D para criar a representação 3-D da intensidade de rotulagem do objeto. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2 : Exemplo representativo Aplicação do uso do plugin Multi Scan Clock para análise de imagem. ( A ) Quatro campos de visão foram capturados dentro da seção do gânglio da raiz dorsal do rato imunossinado para α3 NKA (ver Figura 1, uma legenda). Para simplificar o uso do plugin de varredura de relógio múltiplo, essas imagens foram colocadas em uma pilha e depois convertidas em uma única imagem usando o comando "Image | Stacks | Make Montage". Linhas e números vermelhos indicam seleções de linha segmentada de cinco regiões de interesse nesta imagem. ( B ) Uma captura de tela da janela Multi Clock Scan é mostrada quando o plugin é usado para analisar uma imagem em escala de cinza. ( C ) Perfis de varredura de relógio individuais de cinco ROIs mostrados no painel A. ( D ) Perfil médio de varredura de relógio para ROIs selecionados (painelA) com barras SD (opção "gráfico com desvio padrão" selecionado). ( E ) Imagem RGB de linfócitos preBI de ratos cultivados, marcados com 4,6-Diamidino-2-fenilindole (DAPI, mancha nuclear, azul) e com anticorpos marcados de forma fluorescente para β1-integrina (verde) e F-actina (vermelho , Ver Dobretsov et al., ⁷ para a técnica de cultura de células e Yuryev et al., ¹¹ para detalhes de coloração). Onze células (ver rótulos de números) foram delineadas usando a ferramenta de seleção de polígono ImageJ. Os painéis à direita mostram a exibição do canal verde e vermelho da célula # 7 (seleção retangular no painel esquerdo) após a função de menu "Imagem | Cor | Canais divididos" foi executada. ( F ) Os perfis de varredura do relógio de célula individuais (perfis de canais de cores compostos e vermelhos, verdes e azuis são mostrados por linhas pretas, vermelhas, verdes e azuis, respectivamente). ( G ) Perfis médios de varredura do relógio para todos os onze ROI selecionados no painelE. Designações de cores como no painel G (sem traçado com opção de desvio padrão foi usado durante o procedimento de varredura multi-relógio). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3 : Plugin de verificação de varredura multi-relógio e análise de pilhas de imagens. ( A ) Montagem dos quadros de imagem selecionados e "guardados como pilha". Uma imagem de um neurônio do ganglio da raiz dorsal capturada com microscopia de contraste de interferência diferencial (DIC) é mostrada na primeira moldura. Os quadros subseqüentes foram adquiridos usando microscopia de fluorescência de epi-iluminação para monitorar a concentração de cálcio intracelular em diferentes intervalos de tempo, antes e depois da estimulação elétrica da célula. Números ao lado do respectivoE a imagem indica o tempo na ms ⁶ . A borda da célula foi delineada usando a imagem DIC da pilha (quadro superior esquerdo; asterisco indica a pipeta do grampo-grampo usada para registrar e preencher a célula com o corante sensível ao cálcio Oregon Green BAPTA-1 (OGB-1) ) E, em seguida, usado para executar o procedimento Multi Clock Scan nas imagens restantes. ( B ) Captura de tela da janela Multi Clock Scan, quando o programa é executado em uma pilha de imagens. ( C ) Perfis de varredura do relógio do sinal fluorescente OGB-1 a diferentes distâncias do centro da célula (% do raio) e em diferentes momentos antes e depois da estimulação elétrica (legenda, em ms). Para preparar esses gráficos, o software gráfico profissional foi utilizado. ( D ) Alterações na intensidade do sinal OGB-1 com tempo em sub-membrana e regiões de células citoplasmáticas mais profundas (círculos e linhas vermelhas e pretas, respectivamente). Para obter esses dados, a média e SD foram calculados para cada ponto de dados locatEntre 20-40% e 70-90% da escala x de cada perfil de varredura do relógio mostrado no painel C (áreas sombreadas). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4 : Exemplo de usar o Plugin de verificação de relógio no registro e sobreposição de imagens. ( A e B ) Capturas de tela da placa 29 da seção coronal (Allen Mouse Brain Atlas) e uma seção de vibratoma de 200 μm de espessura do cérebro do mouse incorporado em gelatina cortada aproximadamente no mesmo nível que a imagem do atlas. O rato transgênico usado neste exemplo estava expressando proteína fluorescente ZsGreen sob o promotor de α3NKA, para identificar neurônios que expressam α3NKA ² . Para determinar oRegiões corticais que são especificamente enriquecidas com esses neurônios (pontos brilhantes na imagem no painel B), toda a área cortical foi delineada (linhas tracejadas amarelas) começando em ambas as imagens com o mesmo ponto de referência (intermediário entre o córtex e o olfativo Lâmpada, setas). ( C ) Os painéis representam (da esquerda para a direita): Clock Scan polar transforma o ROI, selecionado dentro da imagem do atlas (painel A), dentro da imagem da seção do cérebro do mouse (painel B) e sobreposição dessas duas imagens de transformação ("Imagem Comando Overlay | Add Image "com configuração de opacidade de 50%). ( D ) As mesmas imagens que no painel C, mas com as bordas das principais regiões corticais (como mostrado no atlas) delineadas em duas outras imagens de transformação usando o polígono ImageJ, ferramentas de seleção de linha segmentada e "Analisar | Ferramentas | Sincronizar Windows" comando. As abreviações são iguais às da imagem original do atlas cerebral: Motor primário e secundário (MOp, MOs), insular agrário, dorParte de sal (AId), orbitário lateral, ventro-lateral e medial (ORBI, ORBvl, ORBm), pré-lípido (PL), cíngulo anterior, córtex da parte dorsal (ACAd). Os números na área MOs referem-se às camadas corticais principais, que podem ser distinguidas no córtex motor do mouse no nível cerebral apropriado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Protocolo de varredura de relógio: o protocolo de varredura de relógio é uma ferramenta rápida e simples de análise de imagem. As vantagens deste protocolo, em comparação com abordagens comuns existentes de análise de imagem (como varreduras de intensidade de pixel linear ou cálculo da intensidade média de pixels do ROI), foram descritas em detalhes nas publicações anteriores ^{1 , 9} . Resumidamente, este protocolo permite a geração de perfis de intensidade de pixel radial integral, quantificando a intensidade de pixels localizados a distâncias diferentes do centro ROI, como a borda do objeto, ou uma localização pré-determinada fora do objeto (fundo). Devido ao último, os perfis de varredura do relógio de cada ROI sempre podem ser corrigidos para o seu fundo imediato, o que (em aplicações biológicas) torna este perfil menos dependente de não-uniformidades locais, dentro ou fora da amostra ou de amostra para amostra. Na rotulagem / coloração, bem como na instabilidade emA intensidade da fonte de luz do microscópio ou os tempos de exposição à luz fluorescente. O tamanho do objeto e a independência da forma dos perfis de varredura do relógio expandem ainda mais a área de aplicação deste protocolo, permitindo as comparações de objetos diferentes, bem como a correção por subtração ponto-a-ponto de perfis de controle "positivo" e "negativo" Objetos.

Plugins de verificação de relógio: a principal limitação para distribuir e compartilhar o protocolo original foi a dependência da plataforma do seu código, que foi desenvolvido com o Visual Basic 6.0 (VB) ^{1 , 9} . Este problema foi abordado recentemente por um dos grupos de pesquisa do Leibniz Institute of Molecular Pharmacology, na Alemanha, desenvolvendo um plugin similar Fuji ImageJ Clock Scan ² . O plugin do Instituto Leibniz reproduz a funcionalidade básica da varredura do relógio original na sua capacidade de gerar inteiraPerfis de varredura radial gral para o ROI de forma convexa fechada, e além disso, ele pode processar segmentos de contornos (arcos). No entanto, o limite de digitalização do perfil gerado pelo seu plugin só pode ser configurado para 100% (a borda do objeto), o que significa que a intensidade do pixel de fundo não pode ser quantificada. Além disso, não tem capacidade para gerar transformações polares, para trabalhar com diferentes canais de cores em imagens RGB, ou para trabalhar com pilhas de imagens e para processar ROIs múltiplos. Em comparação, os dois novos plugins, descritos aqui, reproduzem completamente a capacidade do código VB original ( ou seja , a geração de perfis integrados de intensidade de pixel de varredura de relógio com exibição opcional de SDs e / ou subtração de fundo, bem como o processamento de diferentes canais de cores de Imagens RGB). Além disso, eles podem analisar um ROI em forma de arco / segmento (funcionalidade introduzida no plugin Fuji ImageJ desenvolvido no Leibniz Institute of Molecular Pharmacology ² ). Além disso, thEsses complementos expandem a utilidade de programas anteriores, gerando transformações de imagem ROI de ROI, independentes de tamanho e forma, que podem ser usadas em aplicativos que exigem registro de imagens. Finalmente, o plugin de varredura de relógio múltiplo efetivamente facilita a varredura do relógio de ROIs múltiplos localizados dentro da mesma imagem ou em uma pilha de imagens. O último recurso novo do programa é especialmente útil em aplicativos em que é importante determinar mudanças relacionadas ao tempo e localização.

Limitações e resolução de problemas: a principal limitação do método Clock Scan é a necessidade de selecionar um ROI de forma convexa. O perfil de varredura do relógio não teria sentido em situações em que qualquer uma das varreduras radiais cruzasse o esquema de ROI mais de uma vez. Isso tornaria impossível a normalização do comprimento dessa varredura radial em relação à distância do centro para o ROI. Outra limitação é que a informação do perfil de varredura do relógio é progressivaDiminuiu significativamente no ROI sem simetria radial. No entanto, pelo menos em parte, essas duas limitações podem ser superadas pela análise de segmentos selecionados (arcos) de ROI de forma complexa e assimétrica. O uso da varredura de segmento também é recomendado nos casos em que as seções do território de fundo contêm características marcadas, o que pode afetar o procedimento de subtração de fundo (veja a Figura 2A para um exemplo de seleção para análise desses segmentos de células que não enfrentam outras células rotuladas). Finalmente, se a análise de imagens compostas contendo mais de 3 canais de cores for necessária, os canais de cores dessas imagens devem ser divididos antes de executar o plugin.

Diretrizes futuras: a melhoria futura na funcionalidade desses plugins incluirá, mas não se limita a atualizar o código para combinar a funcionalidade dos plugins de varredura de relógio e varredura com vários clock em um plugin. Algoritmos de co-localização de cores (como algoritmosSobre os cálculos da correlação de Pearson ou os coeficientes de divisão de Manders) e o desenvolvimento do plugin para se tornar capaz de trabalhar com ROIs múltiplos que são selecionados em diferentes imagens ou em diferentes fatias em uma pilha de imagens (a versão atual dos plugins permite a análise de vários Os ROIs selecionados dentro de uma imagem ou um ROI selecionado para todas as imagens na pilha) serão implementados. Os autores também apreciarão quaisquer sugestões dos usuários do plugin e relatórios de quaisquer problemas encontrados durante o uso de plugins existentes.

Conclusão: a análise de varredura do relógio é uma ferramenta promissora para estudos de imagem em muitas áreas da biologia, desde a análise de rotulagem de células estáticas com vários marcadores até estudos de espalhamento de Na ⁺ ou Ca ⁺⁺ , dentro de uma única célula, bem como para a Análise da atividade de espalhamento ( por exemplo , ondas de Ca ⁺⁺ ) em populações de células conectadas sinapticamente ¹⁰ 11 ou células acopladas à junção do intervalo ¹² . Outras áreas potenciais de aplicação da análise de varredura do relógio incluem análise de imagem médica (imagens de ultra-som de vasos sanguíneos, imagens de tomografia computadorizada e secções transversais de osso), astronomia (imagem em espiral e galáxia radial), química (difusão a partir de uma fonte pontual), Física (análise do padrão de difração), silvicultura (análise do anel do caule da árvore para determinar a idade da árvore, bem como períodos de tempo seco e fertilização pobre), engenharia (corrosão de tubulação metálica) e climatologia (análise de imagem de radar meteorológico).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Computer	Any		compatible with software listed below
ImageJ or Fiji ImageJ	NIH	https://imagej.nih.gov/ij/ or https://fiji.sc/	bundled with Java 1.8 or higher
Clock-scan plugins	freeware	https://sourceforge.net/projects/clockscan/	Clock_Scan-1.0.1 jar and Multi_Clock_Scan-1.0.1/ jar
Origin 9.0	OriginLab	Northampton, MA, USA	This program was used to generate some graphs of the original Clock Scan data. Any other graphic software can be used to perform this function