Summary
نقدم البروتوكولات لتطبيق لدينا الهدف الكنسي المشفرة وراثيا مؤشر (جيسي) الماسك + لرصد العابرين الكالسيوم السريع في الشبكة الداخلية / ساركوبلاسميك (إير / سر) من HEK293 والهيكل العظمي خلايا C2C12 العضلات باستخدام في الوقت الحقيقي المجهر مضان. ويناقش أيضا بروتوكول للقياس في الموقع K د ومعايرة.
Abstract
الكالسيوم داخل الخلايا (كا 2 + ) العابرين التي أثارها المحفزات خارج الخلية الشروع في العديد من العمليات البيولوجية في الكائنات الحية. في مركز الإفراج عن الكالسيوم داخل الخلايا هي العضيات الرئيسية تخزين الكالسيوم داخل الخلايا، الشبكة إندوبلازميك (إير) والسبيكوبلازمية أكثر تخصصا (سر) في خلايا العضلات. يتم بوساطة إطلاق ديناميكية من الكالسيوم من هذه العضيات من قبل مستقبلات ريانودين (رير) ومستقبلات إينوسيتول 1،4،5 ثلاثي الفوسفات (إب 3 R) مع إعادة التعبئة التي تحدث من خلال ساركو / إندوبلازميك ريسيكلوم مضخة الكالسيوم أتباس (سيركا). تم إنشاء جهاز استشعار الكالسيوم المشفر وراثيا (جيسي) يسمى كاتشر لمراقبة الإفراج عن الكالسيوم السريع من إير / سر. هنا، والبروتوكولات التفصيلية لترنسفكأيشن والتعبير عن تحسين، إير / سر المستهدفة جيسي الماسك + في HEK293 و C2C12 الخلايا وتطبيقه في رصد إب 3 R، ري، و سيركا بوساطة مضخة الكالسيوم عابرةs في HEK293 الخلايا باستخدام المجهر مضان موجزة. يتم تشتت ناهض مستقبلات أو مثبط الاختيار في حل الغرفة وتسجيل التغيرات كثافة في الوقت الحقيقي. مع هذه الطريقة، وينظر إلى انخفاض في الكالسيوم إير مع تفعيل ري مع 4-كلورو م- كريسول (4-سمك)، والتفعيل غير المباشر من إب 3 R مع أدينوسين ثلاثي الفوسفات (أتب)، وتثبيط مضخة سيركا مع سيكلوبازونيك حمض (كبا). نناقش أيضا بروتوكولات لتحديد في الموقع K د وتقدير القاعدي [كا 2 + ] في الخلايا C2C12. وباختصار، فإن هذه البروتوكولات، وتستخدم جنبا إلى جنب مع الماسك + ، يمكن أن تثير مستقبلات بوساطة الإفراج عن الكالسيوم من إير مع التطبيق في المستقبل لدراسة إير / سر أمراض الكالسيوم ذات الصلة.
Introduction
السمات المكانية والزمانية من الكالسيوم داخل الخلايا (كا 2 + ) العابرين تفعيل مختلف الوظائف البيولوجية 1 . يتم تشغيل هذه الأحداث كا 2 + إشارة خارج الخلية من خلال المحفزات المختلفة والسيطرة عليها داخل الخلايا من قبل كبير كا 2 + أورغانيل التخزين والعديد من كا 2 + مضخات وقنوات وكا 2+ البروتينات ملزمة. كا 2+ العابرين يمكن أن تتغير بشكل كبير نتيجة للعيوب مع إشارة التشكيل، مما يؤدي إلى أمراض مختلفة 2 . وبسبب سرعة وتعقيد نظام التشوير كا 2+ مع الشبكة النهائية والسلكوبلازمي (سر) في المركز، هناك حاجة إلى تحقيقات كا 2 + المشفرة وراثيا التي تم تحسينها لتعبير الثدييات مع حركية سريعة لمراقبة كا 2 + العالمية والمحلية التغييرات في خلايا مختلفة 3 .
و إير و سر، نظيره في خلايا العضلات، هي الخلايا الرئيسية كا 2 + العضيات التخزين وتعمل بمثابة كا 2 + المصارف التي تساعد على تضخيم كا 2 + إشارة 4 . و إير / سر هو جزء لا يتجزأ من كا 2 + يشير مع الأدوار المزدوجة كمرسل ومستقبل للإشارات 5 . مستقبلات ريانودين (رير) و إينوسيتول 1،4،5 ثلاثي الفوسفات مستقبلات (إب 3 R) هي كا 2+ مستقبلات الافراج الموجودة على أغشية إير / سر التي ينظمها كا 2 + 6 . عوامل أخرى تحفز بشكل مباشر أو غير مباشر وظيفة هذه المستقبلات. 4-كلورو- م- كريسول (4-سمك) هو ناهض قوية من رير، وجود حساسية أعلى 10 أضعاف من الكافيين لإحداث ريال كا 2 + الإفراج حيث يتم استخدام كلاهما بانتظام لدراسة ري بوساطة كا 2 + الإفراج في خلايا صحية ومريضة 7 . أتب يزيد إب 3- كايد 2 + إعادةالإيجار من خلال إب 3 R 8 . أتب يربط إلى مستقبلات بورينرجيك P2YR، مستقبلات G- البروتين المقترنة (غر)، مما اثار انتاج إب 3 الذي يربط إلى إب 3 R لاطلاق سراح كا 2 + من إير 9 ، 10 . و ساركو-إندوبلاسميك ريتيكولوم الكالسيوم أتباس مضخة (سيركا) هي مضخة P- نوع أتباس، وتقع أيضا على إير / سر الغشاء الذي يقلل من سعال عصبي كا 2 + ويغسل إير / سر عن طريق ضخ بنشاط أيون في تجويف إير / سر 11 - وتشمل مثبطات محددة من مضخة سيركا ثابسيجارجين، من ثابسيا غارغانيكا ، وحمض السيكلوبازونيك (كبا)، من الرشاشيات والبنسليوم . كبا لديه تقارب منخفض للمضخة وكتل عكسية كا 2 + نقطة الوصول 12 . ثابسيجارجين، من ناحية أخرى، يربط لا رجعة فيه إلى كا 2 + مضخة الحرة في بقايا F256 في الحلزون M3 مع نانومولأر التقارب 11 . تحليل وقياس التغيرات التي تنطوي عليها كا 2+ الأحداث حفز كان ولا يزال يشكل تحديا. منذ إير / سر هو تحت الخلية الرئيسية 2 + كا تحتوي على مقصورة مع وظيفة مركزية في نشر إشارة كا 2 + ، وقد ركز الكثير من العمل على فهم إير / سر كا 2 + يشير 5 .
خلق الاصطناعية كا 2 + الأصباغ ساعدت على التقدم في مجال وممارسة كا 2 + التصوير. على الرغم من أن الأصباغ، مثل ماج-فورا-2، قد استخدمت على نطاق واسع لقياس الكالسيوم المجزأة 2+ في خلايا مختلفة، 13 ، 14 ، 15 لديهم قيود مثل تحميل الصبغ غير المتكافئ، فوتوبلاشينغ، وعدم القدرة على أن تستهدف عضيات محددة . اكتشاف البروتين الفلورسنت الأخضر (غفب) والنهوض بروتين الفلورسنت،على أساس كا 2 + تحقيقات دفعت مجال كا 2 + التصوير إلى الأمام 16 . بعض من جيسي الحالية هي فورستر نقل الطاقة الرنين (فريت) أزواج تنطوي على بروتين الفلورسنت الأصفر (يف)، سماوي الفلورسنت البروتين (سفب)، كالمودولين و M13 الببتيد ملزمة 17 ، 18 . تروبونين C- جيسيس كما تتوفر كما أزواج فريت من سفب والسترين وكما واحد فلورفور تحقيقات 19 ، 20 ، 21 . البعض الآخر، مثل GCAMP2 و R-غيكو هي أجهزة استشعار فلورفور واحدة تشمل كالمودولين 22 ، 23 . للتغلب على قيود الضيقة ضبط K د والتعاونية ملزمة المرتبطة الكالسيوم + 2 مواقع ملزمة وجدت في الكالسيوم 2+ مجالات ملزمة 24 ، فئة جديدة من الكالسيوم سينتم إنشاء سورس من خلال تصميم كا 2+ موقع ملزم على سطح برميل بيتا في موقع حساس كروموفور من تعزيز بروتين الفلورسنت الأخضر (إغف) 25 ، 26 . هذا الاستشعار توصف للغاية، ودعا الماسك، لديه K د من ~ 0.18 ملم، أك على مقربة من حد الانتشار، و أك من 700 ثانية -1 . وقد استخدمت الماسك لرصد مستقبلات بوساطة إير / سر الإفراج عن الكالسيوم في خطوط خلايا الثدييات المختلفة مثل هيلا، HEK293، و C2C12 25 . بسبب حركتها سريعة، كان يستخدم الماسك في الألياف العضلية المثنية ديجيتوروم (فدب) من الصغار والكبار صديق فيروس B نيه جاكسون (ففب) الفئران للكشف عن أن المزيد من كا 2 + لا يزال في ريال سعودي بعد 2 ثانية من الاستقطاب في فدب ألياف الفئران القديمة مقارنة مع الفئران الشابة 27 . للتغلب على مضان منخفضة في 37 درجة مئوية، مما يعيق تطبيقاته في التصوير الكالسيوم من الثديياتالخلايا، قمنا بتطوير نسخة محسنة من الماسك دعا الماسك + . الماسك + المعارض تعزيز مضان في 37 درجة مئوية لتطبيق أفضل في خلايا الثدييات. وأدرجت طفرات إضافية في الماسك لتحسين الحرارة ومضان في 37 درجة مئوية 28 ، 29 ، لخلق الماسك + . يظهر الماسك + زيادة ستة أضعاف في نسبة الإشارة إلى الضوضاء (شنر) على الماسك 30 .
هنا، يتم عرض البروتوكولات للثقافة وترنسفكأيشن من HEK293 و C2C12 الخلايا مع الماسك + وتطبيقها لرصد إير / سر العابرة بوساطة مستقبلات الكالسيوم. وتظهر النتائج التمثيلية لل كاتشر + أعرب في خلايا HEK293 تعامل مع 4-سمك، كبا و أتب. ونحن نقدم أيضا بروتوكول لتحديد في الموقع K د من الماسك + في الخلايا ميوبلاست C2C12 وكوانتيفيكاتيون من القاعدية [كا 2 + ].
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد الشرائح
- وضع 22 مم × 40 ملم شرائح المجهر الزجاج في 6 سم أطباق ثقافة الخلية، 1 شريحة في الطبق.
- فضح كل جانب من كل شريحة وكذلك طبق 6 سم إلى الأشعة فوق البنفسجية (أوف) ضوء لمدة 15-20 دقيقة لتعقيم في غطاء محرك السيارة العقيمة.
- تغطية الأطباق مع الشرائح داخل مع بارافيلم وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى جاهزة للاستخدام.
2. إعداد وسائل الإعلام، مخازن، حلول، والكواشف
- إعداد 1 لتر من حل الملح المتوازن هانك (هبس) في الماء منزوع الأيونات وإضافة 10 ملي هيبيس، 5 ملي ناهكو 3 ، و 1 ملي إغتا. ضبط لدرجة الحموضة 7.2-7.3 مع هيدروكسيد الصوديوم. تصفية العازلة مع مرشح 0.22 ميكرون في زجاجة تعقيمها.
- إعداد 900 مل من الجلوكوز ارتفاع دولبيكو في تعديل النسر المتوسطة (دمم) ح في الماء منزوع الأيونات. إضافة 44 ملي ناهكو 3 وضبط درجة الحموضة إلى 7.2-7.3 مع حمض الهيدروكلوريك. تصفية وسائل الاعلام مع مرشح 0.22 ميكرون في زجاجة تعقيمها. إضافة 100 مل من بوفي الجنينالمصل ن (فبس) إلى وسائل الإعلام لجعل تركيز فبس 10٪. تخزين في 4 درجات مئوية.
- إعداد 1 لتر من العازلة بين الخلايا (125 ملي بوكل، 25 ملي كلوريد الصوديوم، 10 ملي هيبيس، 0.2 ملي كاكل 2 ، 0.5 ملي إغتا، 0.2 ملي مغكل 2 ) في الماء منزوع الأيونات، وضبط درجة الحموضة إلى 7.25. سيكون [كا 2 + ] النهائي ~ 100 نانومتر. قبل الاستخدام، إضافة 0.5 ملم أتب. احفظه في درجة حرارة الغرفة.
- إعداد 1 لتر من العازلة قارع الأجراس (121 ملي كلوريد الصوديوم، 2.4 ملم K 2 هبو 4 ، 0.4 ملم خ 2 بو 4 ، 10 ملي هيبيس، و 1.2 ملي مغكل 2 ) في الماء منزوع الأيونات، وضبط درجة الحموضة إلى 7.2. احفظه في درجة حرارة الغرفة. لاستخدام، قسامة 50 مل في أنبوب 50 مل وإضافة 1.8 ملي كا 2 + و 10 ملي الجلوكوز.
- إعداد 1 لتر من محلول شلال بوكل (125 ملي بوكل، 25 ملي كلوريد الصوديوم، 10 ملي هيبيس، 0.2 ملي مغكل 2 ) في الماء منزوع الأيونات، وضبط درجة الحموضة إلى 7.25.
- حل 5 ملغ من ايونوميسين في 1 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (دمسو). قسامة 30 ميكرولتر في ميكروتوبس وتخزينها في -206؛ C.
- إعداد حمض السيكلوبازونيك (كبا) الأسهم عن طريق إذابة سلطة الائتلاف المؤقتة في دمسو. تأكد من أن النسبة المئوية النهائية من دمسو هو ≤ 1٪ للاكتساب تضاف إلى الخلايا لمنع موت الخلايا المبرمج. إعداد 20 ملي 4-كلورو م- كريسول (4-سمك) عن طريق إذابة في H 2 O تصفيتها والسماح لها تذوب بين عشية وضحاها عن طريق الهز عند 37 درجة مئوية. إعداد الأسهم أتب عن طريق إذابة في تصفية H 2 O إلى 100 ملم.
- لتحديد في الموقع K د ، وإعداد 15 مل كل من 1 ملي إغتا، 0.2 ملي، 0.6 ملم، 2 ملي، 5 ملي، 10 ملي، 20 ملي، 50 ملي، و 100 ملي كا 2 + في العازلة بوكل باستخدام 100 مم إغتا الأسهم و 1 M كاكل 2 الأسهم الذائبة في الماء منزوع الأيونات.
3. ثقافة الخلية
- ثقافة الخلايا C2C12 ميوبلاست و HEK293 وفقا لبروتوكولات أتسك لكل باستخدام 10 سم أطباق ثقافة الخلية في غطاء الأشعة فوق البنفسجية العقيمة.
ملاحظة: لا ينبغي أن يسمح الخلايا C2C12 أن تنمو أعلى من التقاء ~ 70٪ منذ ميوبلاستس ستبدأ في التفاضلتي في ميوتوبيس. كل من خلايا HEK293 و C2C12 تنمو بسهولة ويجب ألا يسمح لها أن تنمو 100٪ كونفلنسي للحفاظ على سلامة الخلية. بالإضافة إلى ذلك، يجب ألا يتم تمرير الخلايا أكثر من 10 مرات قبل استخدامها لتجربة للحفاظ على صحة الخلية.
4. ترنسفكأيشن من HEK293 الخلايا
- البذور HEK293 الخلايا على تعقيم 22 مم × 40 ملم شرائح المجهر الزجاج في أطباق 6 سم حتى تكون ~ 70٪ متموجة يوم ترنسفكأيشن.
- في اليوم التالي، اتبع بروتوكول الشركة المصنعة للكاشف ترنسفكأيشن إلى الخلايا ترانسفكتيون باستخدام 2 ميكروغرام من الماسك + كدنا و 1: 3 (الوزن / حجم) الحمض النووي: نسبة كاشف ترنسفكأيشن في وسائل الإعلام المصل انخفاض (على سبيل المثال أوبتي-ميم).
- إفراغ وسائل الإعلام دمم من الطبق، وإضافة 3 مل من وسائل الإعلام المصل انخفاض. إضافة الحمض النووي: ترنسفكأيشن خليط كاشف إلى الطبق واحتضان لمدة 4-6 ح في 37 درجة مئوية.
- بعد الحضانة، وغسل الخلايا مع 5-6 مل من هبس. تجاهل هبس fروم الطبق واستبدالها مع 3 مل من دمم جديدة واحتضان لهم في 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة للسماح للتعبير عن جيسي.
- ترنسفكأيشن من الخلايا ميوبلاست C2C12
- بالنسبة للخلايا ميوبلاست C2C12، تريبسينيز الخلايا عن طريق إضافة ما يكفي من التربسين لتغطية الجزء السفلي من الطبق (1-2 مل). وضع الطبق في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 2-6 دقائق للسماح لل التربسين لتخفيف الخلايا من الجزء السفلي من الطبق.
- مرة واحدة في حضانة كاملة، وإزالة التربسين ونضح الخلايا في 8 مل من دمم. ماصة الخلايا بدقة مع دمم لتفريق بالتساوي وإعادة تعليق خلايا تي وبذورها على كوفرسليبس العقيمة في 6 سم أطباق ثقافة الخلية التي تحتوي على 3 مل من دمم بحيث التقاء النهائي هو 60٪.
- ترانسفيكت الخلايا في نفس اليوم كما هو موضح في الخطوة 4.2-4.3. احتضان لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية.
- كرر الخطوة 4.4.
5. إعداد الشرائح والمضان المجهر
- شغل mالمجهر مصدر الضوء، ثم فتح برنامج يسي بسيط. السماح للمجهر إلى الاحماء لمدة 15-20 دقيقة أو حتى يبرد الكاميرا (كسد) جهاز تهمة إلى -65 درجة مئوية. إعداد الغرفة والانزلاق مع الخلايا أثناء الانتظار.
- تغطية الجزء السفلي من الانظار مفتوحة الماس غرفة حمام التصوير مع طبقة رقيقة من تسرب، وذلك باستخدام مسحة القطن.
- اتخاذ الشريحة التي تحتوي على خلايا ترانزفكتد من الحاضنة وشطف بلطف ثلاث مرات مع 1 مل من العازلة قارع الأجراس مع 10 ملي الجلوكوز و 1.8 ملي كا 2 + مسخن إلى 37 درجة مئوية.
- ترك 1 مل من العازلة قارع الأجراس في الطبق، لمنع الخلايا من التجفيف، واستخدام ملقط لاتخاذ الشريحة من الطبق. السماح الحل الزائد على استيعاب الأنسجة المختبرية عن طريق لمس حافة الشريحة إلى الأنسجة المختبرية. ثم ضع على جانب الغرفة التي تحتوي على الشحوم مع الخلايا التي تواجه نحو الشحوم وغرفة آمنة على جبل المرحلة باستخدام مفك البراغي.
- إضافة 1مل من العازلة قارع الأجراس إلى الغرفة لمنع الخلايا من التجفيف في حين تصاعد الغرفة على المسرح واستكمال بقية الإعداد المجهر. مرة واحدة يتم إرفاق خرطوم شفط فراغ إلى غرفة، وحجم النهائي يحمل الغرفة هو ~ 450 ميكرولتر.
- تحويل الهدف المجهر إلى 40X الهدف الغمر النفط.
- استخدام عدسة الورق والعدسة تنظيف الحل لتنظيف وتجفيف الهدف. لا تفرك الهدف. داب بلطف حتى سطح نظيف.
- إضافة قطرة واحدة من زيت الغمر إلى الهدف.
- وضع جبل على مرحلة المجهر وإضافة طرف فراغ إلى الغرفة. مرة واحدة يتم إرفاق خرطوم شفط فراغ إلى غرفة وتشغيلها، وحجم النهائي يحمل الغرفة هو ~ 450 ميكرولتر. هذا الحجم النهائي هو المستوى مع الجانبين من الغرفة. لا بد من حل غرفة ليكون مستوى، خلال التجربة، لمنع الحل من الانسكاب في الهدف بسبب الإفراط في الملء.
- باستخدام وضع الحقل مشرق، وضبط الكسب إلى 175 ووقت التعرض إلى 0.03 ثانية لتركيز الخلايا.
- مرة واحدة وتركز الخلايا، والتحول إلى وضع مضان باستخدام 488 نانومتر الإثارة. تغيير وقت التعرض إلى 0.07 ثانية. حدد مجال الرؤية التي لديها ما يكفي من الخلايا التي هي صحية مع مضان كافية إلى الصورة.
- مرة واحدة وقد تم اختيار مجال الرؤية، والتقاط الصور في مضان ووضع الحقل مشرق.
- دائرة منطقة من الفائدة (روي) في الخلايا أو دائرة الخلية بأكملها لتسجيل كثافة من المنطقة التي تم اختيارها.
6. التصوير المخدرات التي يسببها كا 2+ العابرين وفي الموقع K د المعايرة
- بدء قياس كثافة مع معدل الإطار تعيين في واحد كل 5 ثوان.
- السماح لشدة خط الأساس لتحقيق الاستقرار لمدة 20-30 لقطة (100-150 ق). إذا لزم الأمر، وانخفاض الابأميس / ثانية خلال هذه الخطوة لمنع فوتوبلاشينغ.
- حساب كمية 4 سمك اللازمة من الأسهم 20 ملم على أساس حجم الغرفة النهائي من ~ 450 ميكرولتر لجعل تركيز النهائي من 200 ميكرومتر. جعل التخفيفات من المخزون حسب الضرورة.
- تأخذ بعناية 60 ميكرولتر من العازلة قارع الأجراس من الغرفة ومكان في أنبوب ميكروسنتريفوج. تمييع كمية محسوبة من 4-سمك مع هذا الحل وإضافة مرة أخرى إلى غرفة لاستحضار الاستجابة المقصود من الخلايا التي يجري تصويرها.
- إضافة المبلغ المحسوب من 4-سمك إلى أنبوب ميكروسنتريفوج ومزيج بواسطة بيبتينغ.
- إضافة بلطف الحل على مجال الرؤية في حين اضاف في وقت واحد علامة الحدث في قياس كثافة.
- السماح الوقت للدواء لربط لمستقبلات وانخفاض إشارة لاحقة، ثم يغسل مع 3-6 مل من العازلة قارع الأجراس مع 1.8 ملي كا 2 + و 10 ملي الجلوكوز في حين اضاف في وقت واحد علامة الحدث. منذ حجم الغرفة هو 450 &# 181؛ L ويرتبط إلى فراغ، مضيفا 3-6 مل من العازلة يضمن أن الحل السابق الذي يحتوي على الدواء قد تم غسلها بعيدا واستبداله مع الحل المضافة حديثا.
- كرر 6.1-6.7 ل 100 ميكرومتر أتب و 15 ميكرومتر كبا، وذلك باستخدام شريحة جديدة من الخلايا ترانزفكتد لكل فحص.
- وبمجرد الانتهاء من القياس، إنهاء جمع البيانات في إطار قياس كثافة في برنامج يسي بسيط.
- خذ مضان وصور برايتفيلد من الخلايا.
- افتح ملف البيانات للتجربة. هنا، إعادة دائرة الخلايا أو المناطق التي تهم إعادة حساب قيم كثافة، إذا لزم الأمر.
- لتحديد في الموقع K د في الخلايا ميوبلاست C2C12، اتبع البروتوكول على النحو المبين في القسم 4.2 والجزء 5 ووضع 1 مل من 0 ملي كا 2 + العازلة قارع الأجراس في الغرفة.
- بيرمابيليز الخلايا مع سابونين 0.002-0.005٪ في المخزن داخل الخلايا لمدة 15-30 ثانية لتفريغ خلايا أيالماسك + التي قد تكون في السيتوسول. غسل الخلايا مع 3-6 مل من 1 مل إغتا في العازلة بوكل مع 10 ميكرومتر أيونوميسين. السماح لشدة لتقليل حتى يتم التوصل إلى الهضبة.
- شطف مع 3-6 مل من العازلة بوكل مع 10 ميكرومتر أيونوميسين والسماح لشدة لتحقيق الاستقرار، ثم إضافة كل كا 2 + حل مفصل في الخطوة 2.7. السماح لشدة للوصول إلى الهضبة بين كل إضافة.
- لمعايرة جهاز استشعار القياس الكمي [كا 2 + ]، اتبع الخطوة 6.12. استخدام إغتا و 100 ملي كا 2 + العازلة من الخطوة 2.7 للحصول على الحد الأدنى والحد الأقصى كثافة مضان.
7. معالجة البيانات
- تحميل ملف جدول البيانات من بيانات قياس كثافة.
- تطبيع البيانات لكل خلية إلى كثافة خط الأساس (F / F 0 ). رسم البيانات تطبيع مقابل الوقت في أي برنامج الرسوم البيانية.
- لحساب التغيير٪، طرح الذروة تطبيع فالإي من 1 وتضاعف بمقدار 100. احسب المتوسط والانحراف المعياري إذا تم تصوير خلايا متعددة.
- لحساب نسبة الإشارة إلى الضوضاء، شنر، وفتح ملف الصورة المحفوظة من التجربة في برنامج معالجة الصور، مثل إيماجيج، ومن ثم قياس إشارة والخلايا ترانزفكتد، والضوضاء، والخلفية. احسب النسبة شنر باستعمال المعادلة شنر = سيغنال / نويز.
- لحساب K في الموقع من البيانات التي تم جمعها التصوير مضان، متوسط البيانات كثافة، التي تتألف من الهضاب، بعد إضافة كل تركيز كا 2 + و إغتا (0 ملي كا 2+ ). حساب التشبع كسور (كثافة النسبية) باستخدام θ = (F - F دقيقة ) / (F ماكس - F دقيقة )، حيث θ هو الكثافة النسبية، F هو مضان في أي لحظة، F دقيقة هو الحد الأدنى من كثافة مضان، و F ماكس هو أقصى كثافة مضان، لمعرفة التغيير في شدة روقال انه التحقيق مع إضافة كا 2 + مقارنة مع الحد الأدنى من كثافة. رسم البيانات كثافة النسبية ضد [كا 2 + ] في أي الرسم البياني والمنحنى المناسب البرنامج. استخدم معادلة الارتباط 1: 1 θ = [M T ] / (K d + [M T ]) المترجمة لأي برنامج رسم بياني ومنحنى مناسب لحساب K d . M T هو مجموع تركيز المعادن.
- لقياس الكالسيوم القاعدي من المعايرة المبينة في 6.13، متوسط البيانات كثافة، تتألف من الهضاب، بعد إضافة 1 ملي إغتا (F مين ) و 100 ملي كا 2 + (F ماكس ). استخدام معادلة المعايرة [كا 2 + ] = K د ([F - F دقيقة ) / (F ماكس - F)] لحساب الكالسيوم القاعدية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
سيوضح هذا القسم النتائج التي تم تحقيقها باستخدام الأساليب الموصوفة سابقا باستخدام محسن جيسي كاتشر + إير / المستهدفة من أجل رصد التغيرات في إير / سر كا 2 + من خلال مسارات مستقبلات بوساطة مختلفة.
يوضح الشكل 1 إير تفريغ من خلال رير حفز مع 200 ميكرومتر 4-سمك. 4-سمك هو ناهض من رير. إضافة الدواء يدفع إلى انخفاض في إير الكالسيوم كما يقاس بانخفاض في كاتشر + مضان كثافة. كما ملحوظ، بروتوكول المبينة هنا يسمح التصور وقياس مستقبلات بوساطة كا 2 + العابرين باستخدام الماسك + الذي يوفر معلومات حول التغييرات في إير كا 2+ .
كما هو مبين في الشكل 2 ، إضافة 15 ميكرومتر كبا، لمنع عكسيا مضخة سيركا، وتنتج انخفاضا كبيرا في كثافة مضان التي تشكل الهضبة. كما يتم تثبيط وظيفة مضخة سيركا، إير كا 2 + قنوات الافراج لا تزال تنشط بنشاط كا 2 + في السيتوسول مما تسبب في كثافة مضان في الانخفاض. الخلايا تعافى بعد غسل كبا بعيدا مع العازلة رينجر تحتوي على 1.8 ملي كا 2 + و 10 ملي الجلوكوز. هذه النتائج تؤكد قدرة الماسك + لمراقبة كا 2+ العابرين محددة لمضخة سيركا.
ويبين الشكل 3 بيانات تمثيلية للتفعيل غير المباشر من إب 3 R مع 200 ميكرومتر أتب في خلايا HEK293 ترانزفكتد مع الماسك + . أتب يربط لمستقبلات P2Y، مستقبلات G- البروتين المقترنة، الذي يولد إب 3 الذي ينشط كا 2 + الافراج عن طريق إب 3 R. R. على الرغم من أن التغييرهو صغير، إضافة 200 ميكرومتر أتب تنتج انخفاض واضح في كثافة الإشارة. غسل الخلايا مع العازلة رينغر تحتوي على 1.8 ملي كا 2 + و 10 ملي الجلوكوز يسمح إير لإعادة الملء وإشارة للعودة إلى خط الأساس. هذه النتائج تسلط الضوء على قدرة الماسك + لمراقبة إب 3 R بوساطة الكالسيوم الإفراج عن طريق التحفيز غير المباشر.
في الشكل 4 ، تم ترانزفكتد الماسك + إلى خلايا ميوبلاست C2C12 لتحديد في الموقع K د . تم جمع البيانات كما هو موضح في البروتوكول. C2C12 ميوبلاست الخلايا ميوبلاست مع 0.005٪ سابونين لمدة 15-30 ثانية ثم غسلها مع 1 ملي إغتا في العازلة بوكل تحتوي على 10 ميكرومتر أيونوميسين. تم إعداد مختلف تركيزات كا 2+ في العازلة بوكل تحتوي على 10 ميكرومتر أيونوميسين وأضيفت بطريقة تدريجية. تم تطبيع البيانات وتركيبها باستخدام ربط 1: 1معادلة. كان متوسط K D 3.1 ± 1.4 ملم لمدة 7 خلايا. ضعف تقارب الماسك + يسمح لها بمعنى كا 2 + في ارتفاع الكالسيوم 2 + عضلات مثل إير أو سر. لتحديد الكالسيوم [كا 2 + ] في سر، تم بيرمابيليزد الخلايا C2C12 مع سابونين 0.005٪ لمدة 15-30 ثانية، وغسلها مع العازلة بوكل، ومن ثم غسلها مع 1 ملي إغتا في العازلة بوكل تحتوي على 10 ميكرومتر أيونوميسين للحصول على F دقيقة . بعد غسل إغتا بعيدا مع العازلة بوكل بحد أقصى، تم إضافة F ماكس ، من 100 ملي كا 2 + مع 10 ميكرومتر أيونوميسين. تم حساب القاعدي كا 2 + لتكون 0.4 ± 0.2 ملم.
الشكل 1: تحفيز رير باستخدام 4-سمك في خلايا HEK293. ( A ) تصوير تفعيل رير مع 4-سمك. ( B ) تسجيل كثافة الخلايا HEK293ترانزفكتد مع الماسك + ، المترجمة في إير، تعامل مع 200 ميكرومتر 4-سمك. تحفيز رير مع 4-سمك يؤدي إلى انخفاض في كثافة مضان تطبيع التي ترتبط مباشرة إلى انخفاض في [كا 2 + ] إير. n يشير إلى عدد الخلايا تصويرها. وكان متوسط انخفاض الإشارة 12.0 ± 2.2٪. وجود 1.8 ملي كا 2+ في المخزن المؤقت رينغر يسهل إعادة تعبئة من إير ينعكس في شدة الانتعاش إلى خط الأساس. تظهر صور إدراج الخلايا قبل وبعد العلاج مع 4-سمك. تم حساب نسبة شنر إلى 4.3 ± 0.8. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: انخفاض في [كا 2 + ] إير باستخدام سيركا عكسها صكبم العقدة كبا في خلايا HEK293. ( A ) تثبيط مضخة سيركا بواسطة كبا. ( B ) التصوير المباشر للخلايا HEK293 ترانزفكتد مع الماسك + ، المترجمة في إير، تعامل مع 15 ميكرومتر كبا. لأن كا 2 + لا تزال تتدفق من خلال إب 3 R و ري، ومنع مضخة سيركا مع كبا يسبب انخفاض في كثافة مضان تطبيع التي ترتبط مباشرة إلى انخفاض في [كا 2 + ] إير. n يشير إلى عدد الخلايا تصويرها. إنسيت الصور هي HEK293 الخلايا ترانزفكتد مع الماسك + قبل وبعد العلاج. وكان متوسط انخفاض الإشارة 21.0 ± 0.3٪. وجود 1.8 ملي كا 2+ في المخزن المؤقت رينغر يسهل إعادة تعبئة من إير ينعكس في شدة الانتعاش إلى خط الأساس. تم حساب نسبة شنر إلى 5.5 ± 0.8. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر منهذا الرقم.
الشكل 3: أتب يقلل [كا 2 + ] إير في خلايا HEK293. ( A ) تخطيطي للتفعيل غير المباشر من إب 3 R مع أتب من خلال مستقبلات بورينرجيك P2YR. P2YR هو غكر الذي يولد إب 3 على أتب ملزمة. إب 3 ينشط إب 3 R، تحفيز الإفراج عن الكالسيوم من إير. ( B ) التصوير في الوقت الحقيقي من خلايا HEK293 ترانزفكتد مع الماسك + ، المترجمة في إير، تعامل مع 200 ميكرومتر أتب. التحفيز غير المباشر لل إب 3 R عن طريق مستقبلات P2Y مع أتب يسبب انخفاض في كثافة مضان تطبيع التي ترتبط مباشرة إلى انخفاض في [كا 2 + ] إير. n يشير إلى عدد الخلايا تصويرها. وكان متوسط انخفاض الإشارة 6.0 ± 3.0٪. شنر cألكولاتد لتكون 6.7 ± 2.7. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: في الموقع K د من الماسك + في الخلايا ميوبلاست C2C12. أثر ممثل لشدة تطبيع التي تم جمعها من بيرمابيليزد C2C12 الخلايا ميوبلاست ترانزفكتد مع الماسك + . تم بيرمابيليزد الخلايا مع سابونين 0.005٪ في المخزن داخل الخلايا لمدة 15-30 ثانية. تم إعداد إغتا و كا 2 + الحلول في العازلة بوكل، ن يشير إلى عدد من الخلايا تصويرها. ( A ) صور مضان إنزيت هي ممثلة للخلايا قبل وبعد العلاج. تم إضافة 0.3، 0.6، 2، 5، 10، 20، 50، و 100 ملي كا 2+ إلى بيرمابيليزد C2C12 الخلايا ميوبلاست في وجود 10 ميكرومترايونوميسين للحصول على K د 3.1 ± 1.4 ملم. ( B ) صور مضان إدراج هي ممثلة للخلايا في الحد الأدنى والقيم القصوى، بعد إضافة 1 ملي إغتا و 100 ملي كا 2 + مع 10 ميكرومتر أيونوميسين كل، على التوالي. تم حساب القاعدي كا 2 + لتكون 0.4 ± 0.2 ملم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يعيش التصوير خلية واحدة من تحقيقات الفلورسنت، مثل الماسك + ، هو تقنية فعالة لتحليل معقدة إير / سر كا 2 + عمليات الإشارات في كل خلية استجابة لناهضات مستقبلات أو الخصوم. هذه التقنية هي أيضا مفيدة للتصوير باستخدام موجات متعددة في وقت واحد، مثل الحاجة ل فورا-2 أو صورة الماسك + و رود-2 معا لمراقبة كل من إير والتغيرات الكالسيوم خلوي خلوي، على التوالي. هناك عدة خطوات حاسمة في هذا البروتوكول. ترنسفكأيشن الخلية يمكن أن يكون لها تأثير كبير على بقاء التصوير. انخفاض معدلات ترنسفكأيشن يمكن أن يؤدي إلى عدم كفاية التعبير عن جيسي لرصد استجابات الكالسيوم. من ناحية أخرى، أوفيركسريسيون من الماسك + لن يكون لها تأثير التخزين المؤقت على إير / إير كا 2 + ، وهي مشكلة المرتبطة الأصباغ الكالسيوم الاصطناعية. تتأثر آثار التخزين المؤقت من كا 2 + تحقيقات من [كا 2 + ] في العضلة، و K د من صرداء وتركيز التحقيق المطلوبة للقياس. [سيتوسوليك] [كا 2 + ] هو عادة في نطاق نانومولار منخفضة، ومع ذلك، فإن تركيز التحقيق المطلوب هو في نطاق قابل للمقارنة. في هذه الحالة، كان مقدار تركيز الصبغة وقدرتها في التخزين المؤقت الكالسيوم خلوي عصبي، وهو، مصدر قلق كبير للتصوير الخلوي. في المقابل، إير / سر [كا 2 + ] هو في 100s من ميكرومولار إلى ميليمولار المدى 31 كما قررنا لخطوط الخلايا الثدييات المختلفة 25 . منذ 0.1-1 ميكرومتر التعبير عن الماسك + كافية لتمكين الكشف عن الكالسيوم إير، وتأثير التخزين المؤقت من الماسك لا يكاد يذكر. وهكذا، يمكن الماسك + رصد كا 2 + تدفق في ارتفاع البيئات [كا 2 + ] دون أي تأثير التخزين المؤقت على اللمعية إير / سر كا 2 + 32 .
العديد من العوامل يمكن أن تؤثر على كفاءة ترنسفكأيشن من جيسي مثل وقت الحضانة، ثe كاشف ترنسفكأيشن، ودرجة حرارة الحضانة، و كونفلنسي الخلية. الخلية كونفلنسي، عندما البذر الخلايا على الشريحة، يمكن أن تؤثر بشكل كبير على جودة التصوير. انخفاض كونفلنسي يمكن أن يؤدي إلى عدد قليل من الخلايا (ن) ودقة إحصائية أقل، في حين أن مستويات عالية من كونفلنسي تؤدي إلى طبقات متداخلة من الخلايا التي تنتج متغيرات كبيرة في التصوير. وينبغي أن يكون الوقت ودرجة الحرارة لترنسفكأيشن الأمثل على أساس نوع الخلية. بالإضافة إلى ذلك، إضافة دمم مع انخفاض وسائل الاعلام المصل هو الأمثل لأوقات ترنسفكأيشن أطول لمنع موت الخلايا المبرمج. كان مضان جيسي كاتشر الأصلي في خلايا الثدييات، عندما مثقف و ترانسفكتد، 30 درجة مئوية فقط. تم تحسين مضان الماسك بنجاح وتحسين للتعبير عند 37 درجة مئوية مما أدى إلى الجديد، وتحسين البديل الماسك + . ويمكن إجراء لطخة غربية باستخدام الأجسام المضادة ضد إغف لتأكيد التعبير عن كا 2 + التحقيق.
وعلاوة على ذلك، ليثود والاتساق من تسليم كاشف أمر بالغ الأهمية. يمكن إضافة الكواشف إلى الغرفة عن طريق نضح، نشر حجم صغير، أو بواسطة مضخات ميكانيكية، وكلها يمكن أن تثير ردود مختلفة. ومن الضروري أن يتم إغلاق غرفة الحل بشكل صحيح من خلال تطبيق طبقة من الشحوم تسرب على الجزء السفلي من الغرفة التي سيتم وضعها على الشريحة. يجب اختيار الموجات الصحيحة للمجس. الطول الموجي للإثارة والانبعاثات للمصيد + هي 395/488 نانومتر و 510 نانومتر، على التوالي. للتصوير الخلية، يستخدم فقط 488 نانومتر للإثارة لتجنب التأثير الضار للضوء الأشعة فوق البنفسجية على الخلايا. لذلك، باستخدام أي مرشحات البصرية التي تثير في 488 نانومتر وجمع الانبعاثات في 510 نانومتر سيكون مقبولا للاستخدام مع صورة مع الماسك + . لمنع فوتوبلاشينغ، قد تركز الجهود لتحسين شدة الضوء والتعرض للضوء مثل إطارات / s 33 .
في حين أن هذا البروتوكول هو المثالي لتحليل إفإلخ من إير / سر التغييرات باستخدام الماسك + كا 2 + إير / سر التحقيق الفلورسنت، وهناك قيود كما هو متوقع في أي تجربة. وبما أن التصوير الحي وحيد الخلية يحلل فقط إطارا صغيرا من الخلايا، فإن عدد الخلايا (n) يمكن أن يتراوح بين 1-100 خلية، في المتوسط، ولكن يمكن أن يكون أقل لخطوط الخلايا الأكبر حجما. وهذا يؤدي إلى انخفاض أعداد الخلايا ونتائج متنوعة إحصائيا دون تجارب متعددة. مطلوب n> 6 للدقة الإحصائية. للحصول على أكبر ن، يجب تصوير العديد من الأطباق أو يجب استخدام تقنيات أخرى، في وقت واحد. بالإضافة إلى ذلك، الماسك + هو الطول الموجي واحد إير / سر كا 2 + التحقيق، وهذا يؤدي إلى قضايا أخرى مجسات الطول الموجي واحد والأصباغ مع عدم القدرة على قياس إشارة، وليس معرفة ما إذا كانت إشارة صحيحة بدلا من تعطيل الخلايا قطعة أثرية، وجود ضوضاء أكبر بالمقارنة مع أنظمة النسبية 34 .
هذا العمل يدل على أن هذه الأمثل كا 2 + تحقيقات يمكنيتم تطبيقها في أنواع مختلفة من الخلايا أو أنواع الأنسجة لمراقبة مستقبلات بوساطة إير / سر كا 2 + الافراج عنهم. الماسك + هو الطول الموجي واحد إير / سر كا 2 + التحقيق. لذلك، من المهم أن المعلمات التجريبية والإعدادات متسقة للقياس الكمي. المعايرة التفصيلية للتركيز الكالسيوم و K د من أجهزة الاستشعار الكالسيوم في خطوط الخلايا هي قياسات إضافية هامة للتحليل الكمي.
هذه أجهزة الاستشعار الكالسيوم المتقدمة يمكن أيضا أن تستهدف مواقع محددة داخل إير / ريال لرصد مختلف تماما كا 2+ العابرين التي توجد بالمقارنة مع كا 2 + التغيرات العالمية في مختلف الظروف البيولوجية والمرضية. وسوف تستمر هذه النتائج لدفع حقول كا 2 + التصوير وتصميم التحقيق إلى الأمام لتوفير الأدوات المستقبلية لتشخيص كا 2 + الأمراض ذات الصلة. ويمكن أيضا أن يتم تكييف البروتوكولات المبلغ عنها وأجهزة الاستشعار المتقدمة للدواء دإسكوفيريز ضد الأمراض المرتبطة إشارات الكالسيوم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة GM62999، المعاهد الوطنية للصحة EB007268، المعاهد الوطنية للصحة AG15820، B & B منحة البذور، والمنحة نيه التكميلية لفر، بب زمالة إلى سم، زمالة دت ل رغ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-Chloro-3-methylphenol (4-CmC) | Sigma-Aldrich | C55402 | |
| 515DCXR dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | NC338059 | |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| Calcium chloride dihydrate | EMD Millipore | 102382 | |
| Corning tissue-culture treated culture dishes (100 mm) | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
| Corning tissue-culture treated culture dishes (60 mm) | Sigma-Aldrich | CLS430166 | |
| Cyclopiazonic Acid (CPA) | EMD Millipore | 239805 | |
| D(+)-Glucose | ACROS Organics | 41095-0010 | |
| Dow Corning 111 Valve Lubricant & Sealant | Warner Instruments | 64-0275 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D7777 | |
| Ethylenebis(oxyethylenenitrilo) tetraacetic Acid (EGTA) |
ACROS Organics | 409911000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher | 26140087 | |
| Fisherbrand Cover Glasses 22x40 mm | Fisher Scientific | 12-544B | |
| Hanks’ Balanced Salts (HBSS) | Sigma-Aldrich | H4891 | |
| HEPES, Free Acid, Molecular Biology Grade | EMD Millipore | 391340 | |
| Immersion Oil without autofluorescence | Leica | 11513859 | |
| Ionomycin, Free Acid | Fisher Scientific | 50-230-5804 | |
| Leica DM6100B inverted microscope with a cooled EM-CCD camera | Hamamatsu | C9100-13 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher | 11668019 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | ThermoFisher | L3000015 | |
| Low Profile Open Diamond Bath Imaging Chamber | Warner Instruments | RC-26GLP | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Fisher Scientific | M33-500 | |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 51985034 | |
| Potassium Chloride | EMD Millipore | PX1405 | |
| Potassium Phosphate, Dibasic | EMD Millipore | PX1570 | |
| Potassium Phosphate, Monobasic | EMD Millipore | PX1565 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| SimplePCI Image Analysis Software | Hamamatsu | N/A | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-3 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sterivex-GV 0.22 µm filter | EMD Millipore | SVGVB1010 | |
| Till Polychrome V Xenon lamp | Till Photonics | N/A | |
| Trypsin (2.5%), no phenol red (10x) | ThermoFisher | 15090046 |
References
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).
- Berridge, M. J. Calcium signalling remodelling and disease. Biochem. Soc. Trans. 40, 297-309 (2012).
- Tang, S., Reddish, F., Zhuo, Y., Yang, J. J. Fast kinetics of calcium signaling and sensor. Curr. Opin. Chem. Biol. 27, 90-97 (2015).
- Rizzuto, R., Pozzan, T. Microdomains of intracellular Ca2+: Molecular determinants and functional consequences. Physiol. Rev. 86 (1), 369-408 (2006).
- Berridge, M. J. The endoplasmic reticulum: a multifunctional signaling organelle. Cell Calcium. 32 (5-6), 235-249 (2002).
- Clapham, D. E. Calcium Signaling. Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).
- HerrmannFrank, A., Richter, M., Sarkozi, S., Mohr, U., LehmannHorn, F. 4-chloro-m-cresol, a potent and specific activator of the skeletal muscle ryanodine receptor. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1289 (1), 31-40 (1996).
- Ferris, C. D., Huganir, R. L., Bredt, D. S., Cameron, A. M., Snyder, S. H. Inositol trisphosphate receptor: phosphorylation by protein kinase C and calcium calmodulin-dependent protein kinases in reconstituted lipid vesicles. Proc. Natl. Acad. Sci. 88 (6), 2232-2235 (1991).
- Dubyak, G. R., el-Moatassim, C. Signal transduction via P2-purinergic receptors for extracellular ATP and other nucleotides. Am. J. Physiol., Cell Physiol. 265 (3 Pt 1), C577-C606 (1993).
- Song, Z., Vijayaraghavan, S., Sladek, C. D. ATP increases intracellular calcium in supraoptic neurons by activation of both P2X and P2Y purinergic receptors. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 292 (1), R423-R431 (2007).
- Brini, M., Carafoli, E. Calcium Pumps in Health and Disease. Physiol. Rev. 89 (4), 1341-1378 (2009).
- Michelangeli, F., East, J. M. A diversity of SERCA Ca2+ pump inhibitors. Biochem. Soc. Trans. 39 (3), 789-797 (2011).
- Hofer, A. M., Landolfi, B., Debellis, L., Pozzan, T., Free Curci, S. Ca2+ dynamics measured in agonist-sensitive stores of single living intact cells: a new look at the refilling process. Embo J. 17 (7), 1986-1995 (1998).
- Hofer, A. M., Machen, T. E. Technique For InSitu Measurement of Calcium in Intracellular Inositol 1,4,5-Trisphosphate-Sensitive Stores Using The Fluorescent Indicator Mag-Fura-2. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90 (7), 2598-2602 (1993).
- Raju, B., Murphy, E., Levy, L. A., Hall, R. D., London, R. E. A fluorescent indicator for measuring cytosolic free magnesium. Am J Physiol. 256, (1989).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).
- Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. Y. Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (50), 17404-17409 (2004).
- Heim, N., Griesbeck, O. Genetically Encoded Indicators of Cellular Calcium Dynamics Based on Troponin C and Green Fluorescent Protein. J. Biol. Chem. 279 (14), 14280-14286 (2004).
- Mank, M., et al. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophys. J. 90 (5), 1790-1796 (2006).
- Garaschuk, O., Griesbeck, O., Konnerth, A. Troponin C-based biosensors: A new family of genetically encoded indicators for in vivo calcium imaging in the nervous system. Cell Calcium. 42 (4-5), 351-361 (2007).
- Carlson, H. J., Campbell, R. E. Mutational Analysis of a Red Fluorescent Protein-Based Calcium Ion Indicator. Sensors. 13 (9), 11507-11521 (2013).
- Wang, Q., Shui, B., Kotlikoff, M. I., Sondermann, H. Structural Basis for Calcium Sensing by GCaMP2. Structure. 16 (12), 1817-1827 (2008).
- Koldenkova, V. P., Nagai, T. Genetically encoded Ca2+ indicators: Properties and evaluation. Biochim. Biophys. Acta-Mol. Cell Res. 1833 (7), 1787-1797 (2013).
- Tang, S., et al. Design and application of a class of sensors to monitor Ca2+ dynamics in high Ca2+ concentration cellular compartments. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (39), 16265-16270 (2011).
- Zou, J., et al. Developing sensors for real-time measurement of high Ca2+ concentrations. Biochemistry. 46 (43), 12275-12288 (2007).
- Wang, Z. -M., Tang, S., Messi, M. L., Yang, J. J., Delbono, O. Residual sarcoplasmic reticulum Ca2+ concentration after Ca2+ release in skeletal myofibers from young adult and old mice. Pflugers Arch., EJP. 463 (4), 615-624 (2012).
- Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 24 (1), 79-88 (2006).
- Siemering, K. R., Golbik, R., Sever, R., Haseloff, J. Mutations that suppress the thermosensitivity of green fluorescent protein. Current Biology. 6 (12), 1653-1663 (1996).
- Reddish, F. N. Design Of Genetically-Encoded Ca2+ Probes With Rapid Kinetics for Sub-Cellular Application [dissertation]. , Georgia State University. (2016).
- Seo, M. D., Enomoto, M., Ishiyama, N., Stathopulos, P. B., Ikura, M. Structural insights into endoplasmic reticulum stored calcium regulation by inositol 1,4,5-trisphosphate and ryanodine receptors. Biochim. Biophys. Acta-Mol. Cell Res. 1853 (9), 1980-1991 (2015).
- Lambert, D. G. Calcium signaling protocols. , Humana Press. (1999).
- Stephens, D. J., Allan, V. J. Light microscopy techniques for live cell imaging. Science. 300 (5616), 82-86 (2003).
- Bootman, M. D., Rietdorf, K., Collins, T., Walker, S., Sanderson, M. Ca2+-sensitive fluorescent dyes and intracellular Ca2+ imaging. Cold Spring Harb. 2013 (2), Cold Spring. 83-99 (2013).
