Summary
Wij presenteren protocollen voor de toepassing van onze genetisch gecodeerde calciumindicator (GECI) CatchER + voor het monitoren van snelle calcium transiënten in het endoplasmatische / sarcoplasmatische reticulum (ER / SR) van HEK293 en skeletspier C2C12 cellen met behulp van real-time fluorescentiemicroscopie. Een protocol voor de in-situ K d meting en kalibratie wordt ook besproken.
Abstract
Intracellulaire calcium (Ca 2+ ) transiënten die door extracellulaire stimuli worden opgewekt, beginnen een groot aantal biologische processen in levende organismen. In het centrum van intracellulaire calciumvrijstelling zijn de belangrijkste intracellulaire calciumopslagorganellen, het endoplasmatische reticulum (ER) en het meer gespecialiseerde sarcoplasmatische reticulum (SR) in spiercellen. De dynamische afgifte van calcium uit deze organellen wordt gemedieerd door de ryanodine-receptor (RyR) en de inositol 1,4,5-trifosfaatreceptor (IP 3 R) met hervulling die plaatsvindt via de sarco / endoplasmatische reticulum calcium ATPase (SERCA) pomp. Een genetische gecodeerde calciumsensor (GECI) genaamd CatchER werd gecreëerd om de snelle calciumvrijstelling van de ER / SR te controleren. Hier zijn de gedetailleerde protocollen voor de transfectie en expressie van de verbeterde, ER / SR-gerichte GECI CatchER + in HEK293- en C2C12-cellen en zijn toepassing bij het monitoren van IP 3 R, RyR en SERCA pompgemedieerde calcium transientS in HEK293 cellen met behulp van fluorescentiemicroscopie wordt geschetst. De gekozen receptor-agonist of -remmer wordt in de kameroplossing gedispergeerd en de intensiteitsveranderingen worden in real time opgenomen. Met deze methode wordt een vermindering van ER-calcium gezien met RyR-activering met 4-chlor-m-cresol (4 cmc), de indirecte activatie van IP 3 R met adenosintrifosfaat (ATP) en remming van de SERCA-pomp met cyclopiazonzuur Zuur (CPA). We bespreken ook protocollen om de in situ K d en kwantificerende basale [Ca 2+ ] in C2C12 cellen te bepalen. Samenvattend kunnen deze protocollen, gebruikt in combinatie met CatchER + , receptor-gemedieerde calciumvrijstelling van het ER ontlokken bij toekomstige toepassing bij het bestuderen van ER / SR-calcium gerelateerde pathologieën.
Introduction
De spatio-temporale eigenschappen van intracellulaire calcium (Ca 2+ ) transiënten activeren verschillende biologische functies 1 . Deze Ca 2+ signalerende gebeurtenissen worden extracellulaire door middel van verschillende stimuli geactiveerd en intracellulair geregeld door de grote Ca 2+ opslagorganelle en door talrijke Ca 2+ pompen, kanalen en Ca 2+ bindende eiwitten. Ca 2+ transiënten kunnen significant worden veranderd als gevolg van defecten met signaalmodulatie, die leiden tot verschillende ziekten 2 . Vanwege de snelheid en ingewikkeldheid van het Ca 2+ signaleringssysteem, met het endo- (ER) en sarcoplasmatische reticulum (SR) in het centrum, zijn genetisch gecodeerde Ca 2+ -probes die zijn geoptimaliseerd voor zoogdieruitdrukking met snelle kinetiek nodig Global en lokale Ca 2+ veranderingen in verschillende cellen waarnemen 3 .
De ER en de SR, Zijn tegenhanger in spiercellen, zijn de belangrijkste intracellulaire Ca 2+ opslagorganellen en fungeren als Ca 2+ wastafels die helpen om het Ca 2+ -signaal 4 te versterken. De ER / SR is een integraal onderdeel in Ca 2+ signalering met dubbele rollen als een zender en ontvanger van signalen 5 . De ryanodine-receptor (RyR) en de inositol-1,4,5-trifosfaatreceptor (IP 3R) zijn Ca 2+ -vrijgegeven receptoren die zich bevinden op de membranen van de ER / SR die gereguleerd worden door Ca 2+ 6 . Andere agenten stimuleren de functie van deze receptoren direct of indirect. 4-chloor-m-cresol (4-cmc) is een krachtige agonist van het RyR, met een 10-voudige hogere gevoeligheid dan cafeïne voor het induceren van SR Ca 2+ vrijlating, waarbij beide regelmatig worden gebruikt om RyR-gemedieerde Ca 2+ -vrijgave te bestuderen in Gezonde en zieke cellen 7 . ATP verhoogt IP 3- gemedieerde Ca 2+ reHuur via het IP 3 R 8 . ATP bindt aan de purinergere receptor P2YR, een G-eiwit gekoppelde receptor (GPCR), waardoor de productie van IP 3 wordt geactiveerd die bindt aan de IP 3 R om Ca 2+ van de ER 9 , 10 te laten vrijkomen. De pomp ATPase (SERCA) van de sarco-endoplasmatische reticulum-calcium ATPase is een P-type ATPase-pomp, ook op het ER / SR-membraan dat cytosolische Ca 2+ vermindert en de ER / SR refillert door de ion actief in de ER / SR lumen te pompen 11 . Specifieke remmers van de SERCA-pomp omvatten thapsigargine, van Thapsia garganica , en cyclopiazonzuur (CPA), van Aspergillus en Penicillium . CPA heeft een lage affiniteit voor de pomp en reversibel blokkeert het Ca 2+ toegangspunt 12 . Thapsigargin bindt daarentegen onherstelbaar aan de Ca 2+ vrije pomp bij residu F256 in de M3-helix met nanomolAr affiniteit 11 . Het analyseren en kwantificeren van de veranderingen die betrokken zijn bij Ca 2+ gestimuleerde gebeurtenissen is en blijft een uitdaging. Aangezien de ER / SR het belangrijkste subcellulaire Ca 2+ bevattende compartiment is met een centrale functie bij de voortplanting van het Ca 2+ signaal, is veel werk gericht op het begrijpen van ER / SR Ca 2+ signalering 5 .
De creatie van synthetische Ca 2+ kleurstoffen hielp het veld en de praktijk van Ca 2+ beeldvorming. Hoewel kleurstoffen, zoals Mag-Fura-2, veel gebruikt zijn om gecompartementaliseerde Ca 2+ in verschillende cellen te meten, hebben ze 13 , 14 , 15 beperkingen zoals oneven kleurstofbelasting, fotobladen en het onvermogen om zich te richten op specifieke organellen . De ontdekking van het groene fluorescerende eiwit (GFP) en de bevordering van fluorescerende eiwit-Gebaseerde Ca 2+ probes heeft het veld van Ca 2+ beeldvorming naar voren gebracht 16 . Enkele van de bestaande GECI's zijn Förster resonantie energie-overdracht (FRET) paren die geel fluorescerend eiwit (YFP), cyaan fluorescerend eiwit (CFP), calmodulin en het M13 bindende peptide 17 , 18 omvatten . Troponine C-gebaseerde GECI's zijn ook beschikbaar als FRET-paren CFP en Citrine en als enkele fluorofore probes 19 , 20 , 21 . Anderen, zoals GCaMP2 en R-GECO, zijn enkele fluorofoor sensoren die Calmodulin 22 , 23 betreffen. Om de beperkingen van de smalle afstemming van Kd's en coöperatieve binding te elimineren die geassocieerd zijn met meerdere Ca2 + bindingsplaatsen die in hun Ca2 + bindende domeinen 24 gevonden worden , een nieuwe klasse van calcium senSors werd gecreëerd door een Ca 2+ bindingsplaats op het oppervlak van het bèta vat op te stellen in een chromofore gevoelige locatie van verbeterd groen fluorescerend eiwit (EGFP) 25 , 26 . Deze zeer voorspelde sensor, genaamd CatchER, heeft een Kd van ~ 0,18 mM, ak dichtbij de diffusielimiet en ak van 700 s -1 . CatchER is gebruikt om receptor-gemedieerde ER / SR calcium vrijgave in verschillende zoogdiercellijnen zoals HeLa, HEK293 en C2C12 25 te controleren. Door zijn snelle kinetiek werd CatchER gebruikt in flexor digitorum brevis (FDB) spiervezels van jonge en oude Friend Virus B NIH Jackson (FVB) muizen om te onthullen dat meer Ca 2+ in de SR achterblijft na 2 s depolarisatie in de FDB Vezels van oude muizen vergeleken met die van jonge muizen 27 . Om zijn lage fluorescentie bij 37 ° C te overwinnen, die haar toepassingen bij het calciumbeelden van zoogdier verhindertCellen hebben we een verbeterde versie van CatchER ontwikkeld, genaamd CatchER + . CatchER + vertonen verbeterde fluorescentie bij 37 ° C voor betere toepassing in zoogdiercellen. Aanvullende mutaties werden opgenomen in CatchER om de thermostabiliteit en fluorescentie bij 37 ° C 28 , 29 te verbeteren om CatchER + te creëren. CatchER + vertoont een zesvoudige toename van de signaal-ruisverhouding (SNR) over CatchER 30 .
Hier worden de protocollen voor de cultuur en transfectie van HEK293- en C2C12-cellen met CatchER + en de toepassing ervan voor het monitoren van ER / SR-receptor-gemedieerde calciumtransiënten weergegeven. Representatieve resultaten worden getoond voor CatchER + uitgedrukt in HEK293 cellen behandeld met 4 cmc, CPA en ATP. We bieden ook een protocol voor de bepaling van de in situ K d van CatchER + in C2C12 myoblastcellen en quaNtificatie van basale [Ca 2+ ].
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Slide Voorbereiding
- Plaats 22 mm x 40 mm glasmicroscoopschuiven in 6 cm celcultuurschotels, 1 glijbaan per schotel.
- Laat elke zijde van elke dia en de 6 cm gerecht aan ultraviolet (UV) licht gedurende 15-20 minuten blootstellen aan steriliseren in een steriele kap.
- Bedek de afwas met glijbanen binnenkant met parafilm en berg bij 4 ° C tot gebruiksklaar.
2. Bereiding van media, buffers, oplossingen en reagentia
- Bereid 1 liter van Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) in gedeïoniseerd water en voeg 10 mM HEPES, 5 mM NaHCO3 en 1 mM EGTA toe. Pas bij pH 7,2-7,3 met NaOH aan. Filterbuffer met een 0,22 μm filter in een geautoclaveerde fles.
- Bereid 900 ml hoge glucose Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) h in gedeïoniseerd water. Voeg 44 mM NaHCO3 toe en pas de pH aan op 7,2-7,3 met HC1. Filter media met een 0,22 μm filter in een geautoclaveerde fles. Voeg 100 ml foetale boeren toeNe serum (FBS) naar de media om de FBS-concentratie 10% te maken. Bewaren bij 4 ° C.
- Bereid 1 liter intracellulaire buffer (125 mM KCl, 25 mM NaCl, 10 mM HEPES, 0,2 mM CaCl2, 0,5 mM EGTA, 0,2 mM MgCl2) in gedeïoniseerd water en stel de pH op op 7,25. De laatste [Ca2 + ] zal ~ 100 nM zijn. Voeg voor gebruik 0,5 mM ATP toe. Bewaar op kamertemperatuur.
- Bereid 1 L van Ringer's buffer (121 mM NaCl, 2,4 mM K2 HPO4, 0,4 mM KH2P04, 10 mM HEPES en 1,2 mM MgCl2) in gedeïoniseerd water en stel de pH op op 7.2. Bewaar op kamertemperatuur. Om te gebruiken, doseer 50 ml in een 50 ml buis en voeg 1,8 mM Ca 2+ en 10 mM glucose toe.
- Bereid 1 liter KCl-spoeloplossing (125 mM KCl, 25 mM NaCl, 10 mM HEPES, 0,2 mM MgCl2) in gedeïoniseerd water en stel de pH aan op 7,25.
- Oplos 5 mg ionomycine in 1 ml dimethylsulfoxide (DMSO). Aliquot 30 μL in microtubes en opslaan bij -206; C.
- Bereid de cyclopiazonzuur (CPA) voorraad op door CPA in DMSO op te lossen. Zorg ervoor dat het uiteindelijke percentage DMSO ≤ 1% is voor de CPA die aan de cellen wordt toegevoegd om apoptose te voorkomen. Bereid 20 mM 4-chloor-m-cresol (4 cm) door op te lossen in gefilterde H20 en laat het oplossen overnacht door schudden bij 37 ° C. Bereid de ATP-voorraad op door in gefiltreerde H20 tot 100 mM op te lossen.
- Om de in situ Kd te bepalen, bereiden 15 ml elk van 1 mM EGTA, 0,2 mM, 0,6 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM, 50 mM en 100 mM Ca 2+ in KCl-buffer met een 100 MM EGTA voorraad en een 1 M CaCl2 voorraad opgelost in gedeïoniseerd water.
3. Celcultuur
- Cultuur C2C12 myoblast- en HEK293-cellen volgens ATCC-protocollen voor elk met behulp van 10 cm celcultuurschotels in een steriele UV-kap.
OPMERKING: C2C12 cellen mogen niet hoger worden dan 70% samenvloeiing, aangezien de myoblasten zullen beginnen differentiërenTe in myotubes. Zowel HEK293 als C2C12 cellen groeien gemakkelijk en mogen niet meer dan 100% confluentie groeien om de celintegriteit te behouden. Daarnaast mogen cellen niet meer dan 10 keer worden doorgegeven voordat ze gebruikt worden voor een experiment om de gezondheid van de cellen te behouden.
4. Transfectie van HEK293 cellen
- Zaad HEK293 cellen op gesteriliseerde 22 mm x 40 mm glasmicroscoopschuiven in 6 cm gerechten zodat ze ~ 70% samenvloeien op de dag van transfectie.
- Volg de volgende dag het protocol van de fabrikant voor het transfectie-reagens om cellen te transfecteren met behulp van 2 μg CatchER + cDNA en een 1: 3 (gewicht / volume) DNA-transfectie-reagensverhouding in het gereduceerde serummedium ( bijv. Opti-MEM).
- Leg de DMEM media uit het gerecht en voeg 3 ml gereduceerde serummedia toe. Voeg DNA: transfectie-reagensmengsel aan de schotel toe en incubeer gedurende 4-6 uur bij 37 ° C.
- Na incubatie wassen de cellen met 5-6 ml HBSS. Verwijder de HBSS fRoer de schotel en vervang met 3 ml frisse DMEM en incubeer ze gedurende 48 uur bij 37 ° C om expressie van de GECI toe te staan.
- Transfectie van C2C12 myoblastcellen
- Voor C2C12 myoblastcellen, trypsineer cellen door voldoende trypsine toe te voegen om de bodem van de schotel (1-2 ml) te bedekken. Plaats de schotel in een 37 ° C incubator gedurende 2-6 minuten, zodat de trypsine de cellen van de bodem van de schotel loslaat.
- Zodra de incubatie is voltooid, verwijder de trypsine en aspireer de cellen in 8 ml DMEM. Pipetteer de cellen grondig met de DMEM om de cellen te gelijkmatig verspreiden en opnieuw op te schorten en zaad ze op steriele deklagen in 6 cm celcultuurschalen die 3 ml DMEM bevatten, zodat de uiteindelijke samenloop 60% is.
- Transfecteer de cellen op dezelfde dag als beschreven in stap 4.2-4.3. Incubeer gedurende 24 uur bij 37 ° C.
- Herhaal stap 4.4.
5. Bereiding van Slide en Fluorescentie Microscoop
- Schakel m aanMicroscoop en lichtbron, open dan het Simple PCI-programma. Laat de microscoop gedurende 15-20 minuten opwarmen of tot de CCD-camera op -65 ° C koelt. Bereid de kamer en doei met cellen terwijl u wacht.
- Bedek de bodem van de lage profiel open diamantbadafbeeldingskamer met een dunne laag afdichtmiddel, met een katoenen doek.
- Neem de dia met getransfecteerde cellen uit de incubator en schud driemaal met 1 ml Ringer's buffer met 10 mM glucose en 1,8 mM Ca 2+ voorverwarmd tot 37 ° C.
- Laat 1 ml Ringer's buffer in de schotel, om te voorkomen dat cellen drogen, en gebruik een tang om de glijbaan uit de schotel te nemen. Laat de overmaat oplossing op een laboratoriumweefsel opnemen door de rand van de dia aan een laboratoriumweefsel aan te raken. Plaats vervolgens op de kant van de kamer die het vet bevat met cellen naar boven gericht naar vet en bevestig de kamer op de podiumbevestiging met een schroevendraaier.
- Voeg 1 toeML Ringer's buffer naar de kamer om te voorkomen dat cellen drogen terwijl de kamer op het podium wordt geplaatst en de rest van de microscoopopstelling voltooit. Zodra de vacuümzuigerslang aan de kamer is bevestigd, is het eindvolume dat de kamer bevat ~ 450 μL.
- Schakel de microscoopdoelstelling in op de 40X-oliedempingsdoelstelling.
- Gebruik lenspapier en lensreinigingsoplossing om het doel te reinigen en te drogen. Wrijf niet de doelstelling. Druppel zachtjes tot het oppervlak schoon is.
- Voeg een druppel van de dompelolie toe aan het doel.
- Plaats de berg op de microscoopfase en voeg de vacuümtip toe aan de kamer. Zodra de vacuümzuigerslang aan de kamer is bevestigd en ingeschakeld is, is het eindvolume dat de kamer bevat ~ 450 μL. Dit laatste volume is vlak bij de zijkanten van de kamer. Het is absoluut noodzakelijk dat de kameroplossing tijdens het experiment gelijk is om te voorkomen dat de oplossing in de doelstelling komt doordat het overvol is.
- Gebruik de heldere veldmodus, stel de winst aan op 175 en de belichtingstijd naar 0,03 s om de cellen te concentreren.
- Zodra cellen gefocust zijn, schakel over naar de fluorescentiemodus met behulp van 488 nm excitatie. Verander de belichtingstijd naar 0,07 s. Zoek een zichtveld dat voldoende cellen heeft die gezond zijn met voldoende fluorescentie op het beeld.
- Zodra een selectieveld gekozen is, neem foto's in de fluorescentie en de heldere veldmodus.
- Omcirkel een regio van belang (ROI) in de cellen of om de hele cel om de intensiteit van het gekozen gebied op te nemen.
6. Imaging Drug-geïnduceerde Ca 2+ Transiënten en In Situ K d Kalibratie
- Start intensiteitsmeting met frame rate ingesteld op 1 om de 5 s.
- Laat de basisintensiteit stabiliseren voor 20-30 frames (100-150 s). Indien nodig, verlaag de frAmes / s tijdens deze stap om photobleaching te voorkomen.
- Bereken de hoeveelheid 4 cmc die nodig is van een 20 mM voorraad op basis van het eindkamer volume van ~ 450 μl om een uiteindelijke concentratie van 200 μM te maken. Maak indien nodig verdunningen van de voorraad.
- Neem 60 μL Ringer's buffer voorzichtig uit de kamer en plaats in een microcentrifugebuis. Verdun de berekende hoeveelheid van 4 cmc met deze oplossing en voeg terug in de kamer om de beoogde reactie op te roepen van de cellen die worden afgebeeld.
- Voeg de berekende hoeveelheid van 4 cmc toe aan de microcentrifugebuis en meng door pipettering.
- Voeg de oplossing voorzichtig toe op het zichtveld, terwijl u de gebeurtenismerker in de intensiteitsmeting tegelijkertijd toevoegt.
- Laat de tijd toe om het geneesmiddel te binden aan de receptor en de daaropvolgende signaalvermindering, dan wassen met 3-6 ml Ringer's buffer met 1,8 mM Ca 2+ en 10 mM glucose terwijl tegelijkertijd de gebeurtenismerker wordt toegevoegd. Aangezien het kamervolume 450 &# 181; L en is verbonden met een vacuüm, waarbij 3-6 ml buffer wordt toegevoegd, zorgt ervoor dat de voormalige oplossing die het geneesmiddel bevat, weggewassen is en met de nieuw toegevoegde oplossing is vervangen.
- Herhaal 6.1-6.7 voor 100 μM ATP en 15 μM CPA, met behulp van een nieuwe dia van getransfecteerde cellen voor elke test.
- Zodra de meting is voltooid, beëindig de dataverzameling in het intensiteitsmetingsvenster in het Simple PCI-programma.
- Neem fluorescentie en brightfieldbeelden van de cellen.
- Open het gegevensbestand voor het experiment. Hercirculeer de cellen of regio's van belang om de intensiteitswaarden opnieuw te berekenen, indien nodig.
- Om de in situ K d in C2C12 myoblastcellen te bepalen, volg het protocol zoals omschreven in sectie 4.2 en sectie 5 en zet 1 ml 0 mM Ca 2+ Ringer's buffer in de kamer.
- Permeabiliseer de cellen gedurende 15-30 s met 0,002-0,005% saponine in intracellulaire buffer om de cellen van elkeCatchER + die in de cytosol mag zijn. Was de cellen met 3-6 ml 1 ml EGTA in KCl buffer met 10 μM ionomycine. Laat de intensiteit afnemen tot een plateau is bereikt.
- Spoel met 3-6 ml KCl buffer met 10 μM ionomycine en laat de intensiteit stabiliseren en voeg vervolgens elke Ca 2+ oplossing die gedetailleerd is in stap 2.7. Laat de intensiteit tussen elke toevoeging een plateau bereiken.
- Om de sensor te kalibreren voor basale [Ca 2+ ] kwantificering, volg stap 6.12. Gebruik de EGTA en de 100 mM Ca 2+ buffer van stap 2.7 om de minimale en maximale fluorescentie-intensiteit te verkrijgen.
7. Data Processing
- Download het spreadsheetbestand van de intensiteitsmetingsgegevens.
- Normaliseer de gegevens voor elke cel naar de basisintensiteit (F / F 0 ). Bepaal de genormaliseerde data versus de tijd in een grafisch programma.
- Om de% verandering te berekenen, trek je de genormaliseerde piekval afUe van 1 en vermenigvuldigen met 100. Bereken de gemiddelde en standaardafwijking als meerdere cellen werden afgebeeld.
- Om de signaal-ruisverhouding te berekenen, opent SNR het beeldbestand dat is opgeslagen uit het experiment in een beeldverwerkingssoftware, zoals ImageJ, en meet het signaal, getransfecteerde cellen en geluid, achtergrond. Bereken de SNR met behulp van de vergelijking SNR = signaal / geluid.
- Om de in situ Kd van de verzamelde fluorescentiebeeldingsgegevens te berekenen, gemiddelde de intensiteitsgegevens, die de plateaus omvatten, na de toevoeging van elke Ca 2+ -concentratie en EGTA (0 mM Ca 2+ ). Bereken de fractieverzadiging (relatieve intensiteit) met θ = (F - F min ) / (F max - F min ), waarbij θ de relatieve intensiteit is, F de fluorescentie op elk moment is, F min de minimale fluorescentieintensiteit is en F max is de maximale fluorescentie-intensiteit, om de verandering in de intensiteit van t te zienHij probeert met de toevoeging van Ca 2+ in vergelijking met de minimumintensiteit. Bepaal de relatieve intensiteitsgegevens tegen de [Ca 2+ ] in elk grafisch en curve montageprogramma. Gebruik de 1: 1 bindingsvergelijking θ = [M T ] / (K d + [M T ]) vertaald voor elk grafisch en curve fitting programma om de K d te berekenen. M T is de totale metaalconcentratie.
- Om het basale calcium te kwantificeren uit de in 6.13 beschreven kalibratie, gemiddelde de intensiteitsgegevens, die de plateaus omvatten, na de toevoeging van 1 mM EGTA (F min ) en 100 mM Ca 2+ (Fmax). Gebruik de kalibratievergelijking [Ca 2+ ] = K d ([F - F min ) / (F max - F)] om het basale calcium te berekenen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit gedeelte zal de resultaten illustreren die zijn bereikt met behulp van de eerder beschreven methodes met behulp van de geoptimaliseerde ER / SR-gerichte GECI CatchER + om veranderingen in ER / SR Ca 2+ te monitoren via verschillende receptor gemedieerde pathways.
Figuur 1 illustreert ER leeglopen door de RyR gestimuleerd met 200 μM 4 cmc. 4 cmc is een agonist van de RyR. Toevoeging van het geneesmiddel induceert een afname in ER calcium, zoals gemeten door de afname in de CatchER + fluorescentie-intensiteit. Zoals gemarkeerd staat het hier beschreven protocol de visualisatie en meting van receptor gemedieerde Ca 2+ transiënten met behulp van CatchER +, die informatie verschaft over de veranderingen in ER Ca 2+ .
Zoals afgebeeld in figuur 2 , wordt de toevoeging van 15 μM CPA, om de SERCA pomp omkeerbaar te blokkeren, produceert een grote afname in de fluorescentie-intensiteit die een plateau vormt. Aangezien de functie van de SERCA-pomp wordt geremd, worden de ER Ca 2+ -vrijgegevenskanalen nog steeds actief Ca 2+ vrijgegeven in het cytosol waardoor de fluorescentie-intensiteit afneemt. De cellen herstellen na het wassen van CPA weg met Ringer's buffer die 1,8 mM Ca 2+ en 10 mM glucose bevatte. Deze resultaten bevestigen het vermogen van CatchER + om Ca 2+ transienten die specifiek zijn voor de SERCA-pomp, te controleren.
Figuur 3 toont representatieve data voor de indirecte activatie van de IP3R met 200 μM ATP in HEK293 cellen getransfecteerd met CatchER + . ATP bindt aan de P2Y receptor, een G-eiwit gekoppelde receptor, die IP 3 genereert die Ca 2+ vrijgave activeert via de IP 3 R. Hoewel de veranderingIs klein, geeft de toevoeging van 200 μM ATP een zichtbare afname in signaalintensiteit. Het wassen van de cellen met Ringer's buffer die 1,8 mM Ca 2+ en 10 mM glucose bevat, maakt het ER mogelijk om op te vullen en het signaal terug te keren naar de basislijn. Deze resultaten benadrukken het vermogen van CatchER + om IP 3 R-gemedieerde calciumafgifte te monitoren door indirecte stimulatie.
In Figuur 4 werd CatchER + getransfecteerd in C2C12 myoblastcellen om de in situ Kd te bepalen. De gegevens werden verzameld zoals beschreven in het protocol. C2C12 myoblastcellen werden gedurende 15-30 s met 0,005% saponine gepermeabiliseerd, vervolgens gewassen met 1 mM EGTA in KCl-buffer die 10 μM ionomycine bevatte. De verschillende Ca2 + concentraties werden bereid in KCl buffer die 10 μM ionomycine bevatte en werden op een stapsgewijze wijze toegevoegd. De gegevens werden genormaliseerd en gemonteerd met behulp van de 1: 1 bindVergelijking. De gemiddelde Kd was 3,1 ± 1,4 mM voor 7 cellen. De zwakke affiniteit van CatchER + laat het toe om Ca 2+ te detecteren in hoge Ca 2+ organellen zoals de ER of SR. Om de basale [Ca2 + ] in de SR te bepalen, werden C2C12-cellen door 15-30 s met 0,005% saponine gedepandeerd, gewassen met KCl-buffer en vervolgens gewassen met 1 mM EGTA in KCl-buffer die 10 μM ionomycine bevat om F min . Na het wassen van de EGTA weg met KCl buffer werd een maximale Fmax van 100 mM Ca2 + met 10 μM ionomycine toegevoegd. De basale Ca2 + werd berekend op 0,4 ± 0,2 mM.
Figuur 1: Stimulatie van RyR met behulp van 4 cmc in HEK293 cellen. ( A ) Afbeelding van de activatie van RyR met 4 cmc. ( B ) Intensiteit opname van HEK293 cellenGetransfecteerd met CatchER + , gelokaliseerd in het ER, behandeld met 200 μM 4 cmc. Stimulatie van de RyR met 4 cmc zorgt voor een afname van de genormaliseerde fluorescentie-intensiteit die direct verband houdt met een afname in [Ca 2+ ] ER . N verwijst naar het aantal getoonde cellen. De gemiddelde signaalvermindering was 12,0 ± 2,2%. De aanwezigheid van 1,8 mM Ca 2+ in de buffer van de buffer vergemakkelijkt het hervullen van het ER, dat weerspiegeld in het intensiteitsherstel naar de basislijn. Inzetbeelden tonen de cellen voor en na de behandeling met 4 cm. SNR werd berekend op 4,3 ± 0,8. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Afname in [Ca 2+ ] ER met behulp van de omkeerbare SERCA pUmp remmer CPA in HEK293 cellen. ( A ) De remming van de SERCA pomp door CPA. ( B ) Live beeldvorming van HEK293 cellen getransfecteerd met CatchER + , gelokaliseerd in het ER, behandeld met 15 μM CPA. Omdat Ca 2+ nog steeds door de IP 3 R en RyR kan doorlopen, veroorzaakt de blokkering van de SERCA-pomp met CPA een afname in de genormaliseerde fluorescentie-intensiteit die direct verband houdt met een afname van [Ca 2+ ] ER . N verwijst naar het aantal getoonde cellen. Insetbeelden zijn HEK293-cellen getransfecteerd met CatchER + voor en na de behandeling. De gemiddelde signaalvermindering was 21,0 ± 0,3%. De aanwezigheid van 1,8 mM Ca 2+ in de buffer van de buffer vergemakkelijkt het hervullen van het ER, dat weerspiegeld in het intensiteitsherstel naar de basislijn. SNR werd berekend op 5,5 ± 0,8. Klik hier om een grotere versie vandit figuur.
Figuur 3: ATP vermindert [Ca 2+ ] ER in HEK293 cellen. ( A ) Schematisch van de indirecte activatie van IP 3 R met ATP via de purinergere receptor P2YR. P2YR is een GPCR die IP 3 genereert bij ATP binding. De IP 3 activeert de IP 3 R, stimulerende calciumafgifte van de ER. ( B ) Real time beeldvorming van HEK293 cellen getransfecteerd met CatchER + , gelokaliseerd in het ER, behandeld met 200 μM ATP. Indirecte stimulatie van de IP 3 R via de P2Y receptor met ATP zorgt voor een afname in de genormaliseerde fluorescentie-intensiteit die direct verband houdt met een afname in [Ca 2+ ] ER . N verwijst naar het aantal getoonde cellen. De gemiddelde signaalvermindering was 6,0 ± 3,0%. SNR was cBerekend op 6,7 ± 2,7. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: In situ Kd van CatchER + in C2C12 myoblastcellen. Representatief trace voor genormaliseerde intensiteit verzameld uit permeabiliseerde C2C12 myoblastcellen getransfecteerd met CatchER + . Cellen werden gedurende 15-30 s door middel van 0,005% saponine in intracellulaire buffer doordrenkt. EGTA en Ca2 + oplossingen werden bereid in KCl buffer, n verwijst naar het aantal getoonde cellen. ( A ) Inzet fluorescentiebeelden zijn representatief voor cellen voor en na de behandeling. 0,3, 0,6, 2, 5, 10, 20, 50 en 100 mM Ca2 + werd toegevoegd aan permeabiliseerde C2C12 myoblastcellen in aanwezigheid van 10 uMIonomycine om een Kd van 3,1 ± 1,4 mM te krijgen. ( B ) Inset-fluorescentiebeelden zijn representatief voor cellen bij minimale en maximale waarden, na toevoeging van 1 mM EGTA en 100 mM Ca2 + met respectievelijk 10 μM ionomycine. De basale Ca2 + werd berekend op 0,4 ± 0,2 mM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Live single-cell imaging van fluorescerende probes, zoals CatchER + , is een effectieve techniek om ingewikkelde ER / SR Ca 2+ signalering processen in elke cel te analyseren in reactie op receptor agonisten of antagonisten. Deze techniek is ook bruikbaar voor imaging met meerdere golflengten tegelijkertijd, zoals nodig voor Fura-2 of image CatchER + en Rhod-2 samen om respectievelijk respectievelijk ER en cytosolische calciumveranderingen te controleren. Er zijn verschillende kritische stappen in dit protocol; Celtransfectie kan een groot effect hebben op de levensvatbaarheid van beeldvorming. Lage transfectiesnelheden kunnen resulteren in onvoldoende expressie van de GECI voor het monitoren van calciumreacties. Anderzijds zal overexpressie van CatchER + geen buffer effect hebben op ER / ER Ca 2+ , een probleem geassocieerd met synthetische calcium kleurstoffen. Bufferende effecten van Ca 2+ probes worden beïnvloed door de [Ca 2+ ] in de organelle, de K d van de pMantel en de concentratie van de sonde die nodig is voor meting. Cytosolische [Ca2 + ] is typisch in het lage nanomolaire bereik, maar de vereiste sondeconcentratie ligt in een vergelijkbaar bereik. In dit geval was de hoeveelheid kleurstofconcentratie en zijn vermogen bij het bufferen van cytosolisch calcium, en is het een grote zorg voor cellulair beeldvorming. In tegenstelling hiermee is ER / SR [Ca2 + ] in de 100's van micromolair tot millimolair bereik 31, zoals we voor verschillende zoogdiercellijnen 25 bepalen . Aangezien 0,1-1 uM expressie van CatchER + voldoende is om detectie van ER calcium mogelijk te maken, is het buffer effect van CatchER verwaarloosbaar. Zo kan CatchER + Ca 2+ flux monitoren in hoge [Ca 2+ ] omgevingen zonder buffering effect op luminale ER / SR Ca 2+ 32 .
Verschillende factoren kunnen de transfectie-efficiëntie van de GECI beïnvloeden, zoals de incubatietijd, thE transfectie reagens, de incubatietemperatuur en de cel confluentie. De celconfluiëntie, wanneer u de cellen op de dia zaait, kan de beeldkwaliteit aanzienlijk beïnvloeden. Lage samenvloeiing kan resulteren in een laag aantal cellen (n) en minder statistische nauwkeurigheid, terwijl hoge niveaus van samenvloeiing leiden tot overlappende lagen cellen die grote variabelen produceren in beeldvorming. De tijd en de temperatuur voor transfectie moeten worden geoptimaliseerd op basis van het celtype. Bovendien is het toevoegen van DMEM met gereduceerde serummedia optimaal voor langere transfectietijden om apoptose te voorkomen. De oorspronkelijke GECI CatchER-fluorescentie in zoogdiercellen, wanneer gekweekt en getransfecteerd, was slechts 30 ° C. De fluorescentie van CatchER werd succesvol geoptimaliseerd en verbeterd voor expressie bij 37 ° C, wat resulteerde in de nieuwe, verbeterde variant CatchER + . Een western blot met behulp van een antilichaam tegen EGFP kan worden uitgevoerd om de expressie van Ca2 + probe te bevestigen.
Bovendien, de mijThod en consistentie van het leveren van reagentia is kritisch. Reagentia kunnen door middel van perfusie, kleine volume diffusie of door mechanische pompen worden toegevoegd aan de kamer, die allemaal verschillende reacties kunnen opwekken. Het is absoluut noodzakelijk dat de oplossingkamer goed afgesloten is door een laag afdichtingsvet op de bodem van de kamer aan te brengen die op de dia wordt geplaatst. De juiste golflengten moeten voor de sonde geselecteerd worden. Excitatie- en emissiegolflengten voor CatchER + zijn respectievelijk 395/488 nm en 510 nm. Voor celbeelden wordt slechts 488 nm gebruikt voor excitatie om het schadelijke effect van UV-licht op cellen te voorkomen. Daarom zou het gebruik van optische filters die op 488 nm opwekken en de emissie bij 510 nm verzamelen, aanvaardbaar zijn om te gebruiken met CatchER + . Om fotobakken te voorkomen, kunnen inspanningen worden gericht op het optimaliseren van lichtintensiteit en lichtbelichting, zoals frames / s 33 .
Terwijl dit protocol ideaal is om de eff. Te analyserenEct van ER / SR veranderingen met behulp van CatchER + Ca 2+ ER / SR fluorescerende sonde, er zijn beperkingen zoals verwacht in elk experiment. Aangezien single-cell live imaging alleen een klein celbeeld analyseert, kan het aantal cellen (n) gemiddeld van 1-100 cellen afwijken, maar kan lager zijn voor grotere cellijnen. Dit leidt tot lagere cijfers en statistisch gevarieerde resultaten zonder meerdere proeven. Een n> 6 is nodig voor statistische nauwkeurigheid. Om een grotere n te krijgen, moeten veel gerechten worden afgebeeld of tegelijkertijd andere technieken moeten worden gebruikt. Daarnaast is CatchER + een enkele golflengte ER / SR Ca 2+ sonde, dit leidt tot de problemen van andere enkele golflengte probes en kleurstoffen door het signaal niet te kwantificeren, niet weten of signaal waar is in tegenstelling tot verstoring van de cellen Artefact, en met grotere ruis in vergelijking met ratiometrische systemen 34 .
Dit werk laat zien dat deze geoptimaliseerde Ca 2+ probes kunnenWorden toegepast in verschillende celtypes of weefseltypes om de door de receptor gemedieerde ER / SR Ca 2+ -vrijgave te controleren. CatchER + is een enkele golflengte ER / SR Ca 2+ sonde. Daarom is het belangrijk dat de experimentele parameters en instellingen consistent zijn voor kwantitatieve meting. Een gedetailleerde kalibratie van calciumconcentratie en Kd van de calciumsensor in de cellijnen zijn extra belangrijke metingen voor kwantitatieve analyse.
Deze ontwikkelde calciumsensoren kunnen ook gericht zijn op specifieke locaties binnen de ER / SR om de veel verschillende Ca 2+ transienten die bestaan, te monitoren in vergelijking met de globale Ca 2+ veranderingen in verschillende biologische en pathologische omstandigheden. Deze bevindingen zullen de velden van Ca 2+ beeldvorming en probe-ontwerp verder doordringen om toekomstige instrumenten voor de diagnose van Ca 2+ -gebonden ziekten te verschaffen. De gerapporteerde protocollen en ontwikkelde sensor kunnen ook aangepast worden voor geneesmiddel dOverzichten tegen ziekten die verband houden met calciumsignalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door NIH GM62999, NIH EB007268, NIH AG15820, B & B Seed Grant en een NIH Aanvullende Grant naar FR, BB-fellowship naar CM, CDT-gemeenschap aan RG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-Chloro-3-methylphenol (4-CmC) | Sigma-Aldrich | C55402 | |
| 515DCXR dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | NC338059 | |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| Calcium chloride dihydrate | EMD Millipore | 102382 | |
| Corning tissue-culture treated culture dishes (100 mm) | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
| Corning tissue-culture treated culture dishes (60 mm) | Sigma-Aldrich | CLS430166 | |
| Cyclopiazonic Acid (CPA) | EMD Millipore | 239805 | |
| D(+)-Glucose | ACROS Organics | 41095-0010 | |
| Dow Corning 111 Valve Lubricant & Sealant | Warner Instruments | 64-0275 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D7777 | |
| Ethylenebis(oxyethylenenitrilo) tetraacetic Acid (EGTA) |
ACROS Organics | 409911000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher | 26140087 | |
| Fisherbrand Cover Glasses 22x40 mm | Fisher Scientific | 12-544B | |
| Hanks’ Balanced Salts (HBSS) | Sigma-Aldrich | H4891 | |
| HEPES, Free Acid, Molecular Biology Grade | EMD Millipore | 391340 | |
| Immersion Oil without autofluorescence | Leica | 11513859 | |
| Ionomycin, Free Acid | Fisher Scientific | 50-230-5804 | |
| Leica DM6100B inverted microscope with a cooled EM-CCD camera | Hamamatsu | C9100-13 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher | 11668019 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | ThermoFisher | L3000015 | |
| Low Profile Open Diamond Bath Imaging Chamber | Warner Instruments | RC-26GLP | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Fisher Scientific | M33-500 | |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 51985034 | |
| Potassium Chloride | EMD Millipore | PX1405 | |
| Potassium Phosphate, Dibasic | EMD Millipore | PX1570 | |
| Potassium Phosphate, Monobasic | EMD Millipore | PX1565 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| SimplePCI Image Analysis Software | Hamamatsu | N/A | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-3 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sterivex-GV 0.22 µm filter | EMD Millipore | SVGVB1010 | |
| Till Polychrome V Xenon lamp | Till Photonics | N/A | |
| Trypsin (2.5%), no phenol red (10x) | ThermoFisher | 15090046 |
References
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).
- Berridge, M. J. Calcium signalling remodelling and disease. Biochem. Soc. Trans. 40, 297-309 (2012).
- Tang, S., Reddish, F., Zhuo, Y., Yang, J. J. Fast kinetics of calcium signaling and sensor. Curr. Opin. Chem. Biol. 27, 90-97 (2015).
- Rizzuto, R., Pozzan, T. Microdomains of intracellular Ca2+: Molecular determinants and functional consequences. Physiol. Rev. 86 (1), 369-408 (2006).
- Berridge, M. J. The endoplasmic reticulum: a multifunctional signaling organelle. Cell Calcium. 32 (5-6), 235-249 (2002).
- Clapham, D. E. Calcium Signaling. Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).
- HerrmannFrank, A., Richter, M., Sarkozi, S., Mohr, U., LehmannHorn, F. 4-chloro-m-cresol, a potent and specific activator of the skeletal muscle ryanodine receptor. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1289 (1), 31-40 (1996).
- Ferris, C. D., Huganir, R. L., Bredt, D. S., Cameron, A. M., Snyder, S. H. Inositol trisphosphate receptor: phosphorylation by protein kinase C and calcium calmodulin-dependent protein kinases in reconstituted lipid vesicles. Proc. Natl. Acad. Sci. 88 (6), 2232-2235 (1991).
- Dubyak, G. R., el-Moatassim, C. Signal transduction via P2-purinergic receptors for extracellular ATP and other nucleotides. Am. J. Physiol., Cell Physiol. 265 (3 Pt 1), C577-C606 (1993).
- Song, Z., Vijayaraghavan, S., Sladek, C. D. ATP increases intracellular calcium in supraoptic neurons by activation of both P2X and P2Y purinergic receptors. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 292 (1), R423-R431 (2007).
- Brini, M., Carafoli, E. Calcium Pumps in Health and Disease. Physiol. Rev. 89 (4), 1341-1378 (2009).
- Michelangeli, F., East, J. M. A diversity of SERCA Ca2+ pump inhibitors. Biochem. Soc. Trans. 39 (3), 789-797 (2011).
- Hofer, A. M., Landolfi, B., Debellis, L., Pozzan, T., Free Curci, S. Ca2+ dynamics measured in agonist-sensitive stores of single living intact cells: a new look at the refilling process. Embo J. 17 (7), 1986-1995 (1998).
- Hofer, A. M., Machen, T. E. Technique For InSitu Measurement of Calcium in Intracellular Inositol 1,4,5-Trisphosphate-Sensitive Stores Using The Fluorescent Indicator Mag-Fura-2. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90 (7), 2598-2602 (1993).
- Raju, B., Murphy, E., Levy, L. A., Hall, R. D., London, R. E. A fluorescent indicator for measuring cytosolic free magnesium. Am J Physiol. 256, (1989).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).
- Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. Y. Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (50), 17404-17409 (2004).
- Heim, N., Griesbeck, O. Genetically Encoded Indicators of Cellular Calcium Dynamics Based on Troponin C and Green Fluorescent Protein. J. Biol. Chem. 279 (14), 14280-14286 (2004).
- Mank, M., et al. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophys. J. 90 (5), 1790-1796 (2006).
- Garaschuk, O., Griesbeck, O., Konnerth, A. Troponin C-based biosensors: A new family of genetically encoded indicators for in vivo calcium imaging in the nervous system. Cell Calcium. 42 (4-5), 351-361 (2007).
- Carlson, H. J., Campbell, R. E. Mutational Analysis of a Red Fluorescent Protein-Based Calcium Ion Indicator. Sensors. 13 (9), 11507-11521 (2013).
- Wang, Q., Shui, B., Kotlikoff, M. I., Sondermann, H. Structural Basis for Calcium Sensing by GCaMP2. Structure. 16 (12), 1817-1827 (2008).
- Koldenkova, V. P., Nagai, T. Genetically encoded Ca2+ indicators: Properties and evaluation. Biochim. Biophys. Acta-Mol. Cell Res. 1833 (7), 1787-1797 (2013).
- Tang, S., et al. Design and application of a class of sensors to monitor Ca2+ dynamics in high Ca2+ concentration cellular compartments. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (39), 16265-16270 (2011).
- Zou, J., et al. Developing sensors for real-time measurement of high Ca2+ concentrations. Biochemistry. 46 (43), 12275-12288 (2007).
- Wang, Z. -M., Tang, S., Messi, M. L., Yang, J. J., Delbono, O. Residual sarcoplasmic reticulum Ca2+ concentration after Ca2+ release in skeletal myofibers from young adult and old mice. Pflugers Arch., EJP. 463 (4), 615-624 (2012).
- Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 24 (1), 79-88 (2006).
- Siemering, K. R., Golbik, R., Sever, R., Haseloff, J. Mutations that suppress the thermosensitivity of green fluorescent protein. Current Biology. 6 (12), 1653-1663 (1996).
- Reddish, F. N. Design Of Genetically-Encoded Ca2+ Probes With Rapid Kinetics for Sub-Cellular Application [dissertation]. , Georgia State University. (2016).
- Seo, M. D., Enomoto, M., Ishiyama, N., Stathopulos, P. B., Ikura, M. Structural insights into endoplasmic reticulum stored calcium regulation by inositol 1,4,5-trisphosphate and ryanodine receptors. Biochim. Biophys. Acta-Mol. Cell Res. 1853 (9), 1980-1991 (2015).
- Lambert, D. G. Calcium signaling protocols. , Humana Press. (1999).
- Stephens, D. J., Allan, V. J. Light microscopy techniques for live cell imaging. Science. 300 (5616), 82-86 (2003).
- Bootman, M. D., Rietdorf, K., Collins, T., Walker, S., Sanderson, M. Ca2+-sensitive fluorescent dyes and intracellular Ca2+ imaging. Cold Spring Harb. 2013 (2), Cold Spring. 83-99 (2013).
