Summary
Vi præsenterer protokoller til anvendelse af vores målrettede genetisk kodede calciumindikator (GECI) CatchER + til overvågning af hurtige calciumtransienter i det endoplasmatiske / sarkoplasmiske retikulum (ER / SR) af HEK293 og skeletmuskulatur C2C12-celler ved hjælp af realtids fluorescensmikroskopi. En protokol til in situ K d måling og kalibrering diskuteres også.
Abstract
Intracellulære calcium (Ca 2+ ) transienter fremkaldt af ekstracellulære stimuli initierer en lang række biologiske processer i levende organismer. I centrum for intracellulær calciumfrigivelse er de vigtigste intracellulære calciumlagringsorganeller, det endoplasmatiske retikulum (ER) og det mere specialiserede sarkoplasmiske retikulum (SR) i muskelceller. Den dynamiske frigivelse af calcium fra disse organeller medieres af ryanodinreceptoren (RyR) og inositol 1,4,5-triphosphatreceptoren (IP 3 R) med genopfyldning, der forekommer gennem sarco / endoplasmatisk reticulum calcium-ATPase (SERCA) -pumpen. En genetisk kodet calciumsensor (GECI) kaldet CatchER blev oprettet for at overvåge den hurtige calciumfrigivelse fra ER / SR. Her er de detaljerede protokoller til transfektion og ekspression af den forbedrede, ER / SR-målrettede GECI CatchER + i HEK293- og C2C12-celler og dens anvendelse til overvågning af IP3R-, RyR- og SERCA-pumpemedieret calciumtransientS i HEK293-celler ved anvendelse af fluorescensmikroskopi er skitseret. Den valgte receptoragonist eller inhibitor er dispergeret i kammeropløsningen, og intensitetsændringerne registreres i realtid. Med denne metode ses et fald i ER-calcium med RyR-aktivering med 4-chlor-m-cresol (4 cmc), den indirekte aktivering af IP 3 R med adenosintrifosfat (ATP) og hæmning af SERCA-pumpen med cyclopiazon Syre (CPA). Vi diskuterer også protokoller til bestemmelse af in situ K d og kvantificering af basal [Ca 2+ ] i C2C12 celler. Sammenfattende kan disse protokoller, der anvendes sammen med CatchER + , fremkalde receptormedieret calciumfrigivelse fra ER med fremtidig anvendelse ved undersøgelse af ER / SR-calciumrelaterede patologier.
Introduction
De spatio-temporale attributter af intracellulære calcium (Ca 2+ ) transienter aktiverer forskellige biologiske funktioner 1 . Disse Ca 2+ signaleringshændelser udløses ekstracellulært gennem forskellige stimuli og kontrolleres intracellulært af den store Ca 2+ opbevaringsorganelle og ved adskillige Ca 2+ pumper, kanaler og Ca 2+ bindingsproteiner. Ca 2+ transienter kan ændres væsentligt som følge af defekter med signalmodulation, hvilket fører til forskellige sygdomme 2 . På grund af hastigheden og kompleksiteten af Ca 2+ -signaleringssystemet, med endo- (ER) og sarkoplasmisk retikulum (SR) i midten, er der behov for genetisk kodede Ca 2+ prober, som er optimeret til pattedyrsekspression med hurtig kinetik. At observere globale og lokale Ca 2+ ændringer i forskellige celler 3 .
ER og SR, Dens modsætning i muskelceller, er de vigtigste intracellulære Ca 2+ opbevaringsorganeller og fungerer som Ca 2+ dræn, der hjælper med at forstærke Ca 2+ -signalet 4 . ER / SR er en integreret del i Ca 2+ -signalering med dobbelte roller som en sender og modtager af signaler 5 . Ryanodinreceptoren (RyR) og inositol-1,4,5-triphosphatreceptoren (IP 3 R) er Ca 2+ -frigivelsesreceptorer placeret på membranerne i ER / SR, som er reguleret af Ca 2+ 6 . Andre midler stimulerer direkte eller indirekte funktionen af disse receptorer. 4-chlor-m-cresol (4-cmc) er en potent agonist af RyR, der har en 10 gange højere følsomhed end koffein til induktion af SR Ca 2+ -frigivelse, hvor begge jævnligt anvendes til at studere RyR-medieret Ca 2+ -frigivelse i Sunde og syge celler 7 . ATP forøger IP3-medieret Ca2 + reLeasing gennem IP 3 R 8 . ATP binder til den purinergreceptor P2YR, en G-proteinkoblet receptor (GPCR), der udløser produktionen af IP3, der binder til IP3R for at frigive Ca2 + fra ER 9 , 10 . Seraco-endoplasmatiske reticulum-calcium ATPase-pumpen (SERCA) er en P-type ATPase-pumpe, der også er placeret på ER / SR-membranen, som reducerer cytosolisk Ca2 + og refiller ER / SR ved aktivt at pumpe ionet i ER / SR-lumen 11 . Specifikke hæmmere af SERCA-pumpen omfatter thapsigargin, fra Thapsia garganica og cyclopiazonsyre (CPA), fra Aspergillus og Penicillium . CPA har en lav affinitet for pumpen og blokkerer reversibelt Ca 2+ adgangspunktet 12 . Thapsigargin binder på den anden side irreversibelt til Ca 2+ fri pumpe ved rest F256 i M3-helixen med nanomolAr affinitet 11 . Analyse og kvantificering af ændringerne involveret i Ca 2+ stimulerede hændelser har været og forbliver en udfordring. Da ER / SR er det store subcellulære Ca 2+ indeholdende rum med en central funktion i udbredelsen af Ca 2+ signalet, har meget arbejde været fokuseret på at forstå ER / SR Ca 2+ signalering 5 .
Oprettelsen af syntetiske Ca 2+ farvestoffer hjalp med at fremme feltet og praksis med Ca 2+ billeddannelse. Selvom farvestoffer, såsom Mag-Fura-2, i vid udstrækning er blevet brugt til at måle rummere Ca 2+ i forskellige celler, har de 13 , 14 , 15 begrænsninger som ujævn farvestofbelastning, fotoblegning og manglende evne til at blive målrettet mod specifikke organeller . Opdagelsen af det grønne fluorescerende protein (GFP) og fremskridtet af fluorescerende protein-Baserede Ca 2+ prober har fremdrevet feltet Ca 2+ billeddannelse fremad 16 . Nogle af de eksisterende GECI'er er Förster resonans energioverførsel (FRET) par, der involverer gul fluorescerende protein (YFP), cyan fluorescerende protein (CFP), calmodulin og M13 bindende peptid 17 , 18 . Troponin C-baserede GECI'er er også tilgængelige som FRET-par CFP og Citrin og som enkeltfluoroforprober 19 , 20 , 21 . Andre, såsom GCaMP2 og R-GECO, er single fluorophore sensorer involverende calmodulin 22 , 23 . For at overvinde begrænsningerne af smal afstemning af K d' er og kooperativ binding forbundet med flere Ca 2+ bindingssteder fundet i deres Ca 2+ bindingsdomæner 24 , en ny klasse af calcium senSors blev skabt ved at designe et Ca 2+ bindingssted på overfladen af beta tønde i en kromofor-følsom placering af forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP) 25 , 26 . Denne stærkt spionerede sensor, kaldet CatchER, har en Kd på ~ 0,18 mM, ak ved nær diffusionsgrænsen og ak off på 700 s -1 . CatchER er blevet anvendt til at overvåge receptor-medieret ER / SR-calciumfrigivelse i forskellige pattedyrcellelinjer, såsom HeLa, HEK293 og C2C1225. På grund af sin hurtige kinetik blev CatchER anvendt i flexor digitorum brevis (FDB) muskelfibre af unge og gamle Friend Virus B NIH Jackson (FVB) mus for at afsløre, at mere Ca 2+ forbliver i SR efter 2 s depolarisering i FDB Fibre af gamle mus sammenlignet med hos unge mus 27 . For at overvinde dens lave fluorescens ved 37 ° C, hvilket forhindrer dets anvendelser ved calciumbilleddannelse af pattedyrCeller, har vi udviklet en forbedret version af CatchER kaldet CatchER + . CatchER + udviser forbedret fluorescens ved 37 ° C til bedre anvendelse i pattedyrsceller. Yderligere mutationer blev inkorporeret i CatchER for at forbedre termostabiliteten og fluorescensen ved 37 ° C 28 , 29 for at skabe CatchER + . CatchER + udviser en seks gange stigning i signal-støjforholdet (SNR) over CatchER 30 .
Her præsenteres protokollerne til kulturen og transfektionen af HEK293- og C2C12-celler med CatchER + og dens anvendelse til overvågning af ER / SR-receptor-medierede calciumtransienter. Repræsentative resultater er vist for CatchER + udtrykt i HEK293-celler behandlet med 4 cmc, CPA og ATP. Vi tilvejebringer også en protokol til bestemmelse af in situ K d af CatchER + i C2C12 myoblastceller og quaNtifikation af basal [Ca 2+ ].
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Slide forberedelse
- Placer 22 mm x 40 mm glasmikroskop dias i 6 cm cellekulturskåle, 1 dias pr. Skål.
- Udsæt hver side af hvert dias samt 6 cm skålen til ultraviolet (UV) lys i 15-20 minutter at sterilisere i en steril hætte.
- Dækk tallerkenerne med glider indvendigt med parafilm og opbevar ved 4 ° C, indtil de er klar til brug.
2. Fremstilling af medier, buffere, opløsninger og reagenser
- Forbered 1 L af Hank's afbalancerede saltopløsning (HBSS) i deioniseret vand og tilsæt 10 mM HEPES, 5 mM NaHC03 og 1 mM EGTA. Juster til pH 7,2-7,3 med NaOH. Filterbuffer med et 0,22 μm filter i en autoklaveret flaske.
- Forbered 900 ml højt glucose-Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) h i deioniseret vand. Tilsæt 44 mM NaHC03 og juster pH til 7,2-7,3 med HCI. Filtrer medier med et 0,22 μm filter i en autoklaveret flaske. Tilsæt 100 ml føtalt boviNe-serum (FBS) til medierne for at gøre FBS-koncentrationen 10%. Opbevares ved 4 ° C.
- Fremstill 1 l intracellulær buffer (125 mM KCI, 25 mM NaCl, 10 mM HEPES, 0,2 mM CaCl2, 0,5 mM EGTA, 0,2 mM MgCl2) i deioniseret vand og juster pH til 7,25. Den endelige [Ca2 + ] vil være ~ 100 nM. Før brug tilsættes 0,5 mM ATP. Opbevares ved stuetemperatur.
- Fremstill 1 l Ringer's buffer (121 mM NaCl, 2,4 mM K2 HPO4, 0,4 mM KH2 PO4, 10 mM HEPES og 1,2 mM MgCl2) i deioniseret vand og juster pH til 7,2. Opbevares ved stuetemperatur. Til anvendelse, alikvot 50 ml i et 50 ml rør og tilsæt 1,8 mM Ca 2+ og 10 mM glucose.
- Forbered 1 l KCl skylleopløsning (125 mM KCI, 25 mM NaCl, 10 mM HEPES, 0,2 mM MgCl2) i deioniseret vand og juster pH til 7,25.
- Opløs 5 mg ionomycin i 1 ml dimethylsulfoxid (DMSO). Aliquot 30 μL i mikrotubes og opbevar ved -206; C.
- Klargør cyclopiazonsyre (CPA) lager ved at opløse CPA i DMSO. Sørg for, at den endelige procentdel af DMSO er ≤ 1% for CPA tilsat til cellerne for at forhindre apoptose. Fremstil 20 mM 4-chlor-m-cresol (4 cm) ved at opløse i filtreret H20 og lade det opløse natten over ved omrystning ved 37 ° C. Forbered ATP-stammen ved opløsning i filtreret H20 til 100 mM.
- For at bestemme in situ Kd fremstilles 15 ml hver af 1 mM EGTA, 0,2 mM, 0,6 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM, 50 mM og 100 mM Ca 2+ i KCl-buffer ved anvendelse af en 100 MM EGTA-stamme og en 1 M CaCl2-stamopløsning opløst i deioniseret vand.
3. Cellekultur
- Culture C2C12 myoblast- og HEK293-celler ifølge ATCC-protokoller for hver ved anvendelse af 10 cm cellekulturskål i en steril UV-hætte.
BEMÆRK: C2C12-celler bør ikke få lov til at vokse højere end ~ 70% konfluens, da myoblasterne begynder at differentiereTe i myotubes. Både HEK293 og C2C12 celler vokser let og bør ikke få lov til at vokse forbi 100% konfluens for at opretholde celleintegriteten. Derudover bør celler ikke overføres mere end 10 gange før de anvendes til et forsøg for at bevare cellehelsen.
4. Transfektion af HEK293-celler
- Sæt HEK293 celler på steriliserede 22 mm x 40 mm glasmikroskop dias i 6 cm tallerkner, så de er ~ 70% sammenflydende transfektionsdagen.
- Næste dag følger producentens protokol for transfektionsreagenset at transficere celler ved anvendelse af 2 μg CatchER + cDNA og et 1: 3 (vægt / volumen) DNA: transfektionsreagensforhold i det reducerede serummedium ( f.eks. Opti-MEM).
- Tøm DMEM-medierne fra fadet, og tilsæt 3 ml reduceret serummedium. Tilsæt DNA: transfektionsreagensblanding til fadet og inkuber i 4-6 timer ved 37 ° C.
- Efter inkubation vaskes cellerne med 5-6 ml HBSS. Kassér HBSS fSkålen og erstattes med 3 ml frisk DMEM og inkuberes ved 37 ° C i 48 timer for at tillade ekspression af GECI.
- Transfektion af C2C12 myoblastceller
- For C2C12 myoblastceller trypsiniserer cellerne ved at tilføje nok trypsin til at dække bunden af fadet (1-2 ml). Placer fadet i en 37 ° C inkubator i 2-6 minutter for at tillade trypsin at løsne cellerne fra bunden af fadet.
- Når inkubationen er færdig, fjern trypsinet og aspirer cellerne i 8 ml DMEM. Pipetter cellerne grundigt med DMEM for at jævne dispergere og genopsætte te celler og frø dem på sterile coverlips i 6 cm cellekulturskåle indeholdende 3 ml DMEM, så den endelige sammenfløjning er 60%.
- Transfekter cellerne samme dag som beskrevet i trin 4.2-4.3. Inkubér i 24 timer ved 37 ° C.
- Gentag trin 4.4.
5. Fremstilling af dias og fluorescensmikroskop
- Tænd mMikroskop og lyskilde, så åbner du det enkle PCI-program. Lad mikroskopet varme op i 15-20 minutter eller indtil kameraet til opladning (CCD) køler til -65 ° C. Klargør kammeret og skub med celler, mens du venter.
- Dæk bunden af det lavprofilerede åbent diamantbad billedkammer med et tyndt lag tætningsmiddel ved hjælp af en bomuldspindel.
- Tag diaset indeholdende transficerede celler ud af inkubatoren og skyll forsigtigt tre gange med 1 ml Ringer's buffer med 10 mM glucose og 1,8 mM Ca 2+ forvarmet til 37 ° C.
- Lad 1 ml Ringer's buffer i skålen for at forhindre, at celler tørrer, og brug tænger til at tage glideren ud af fadet. Tillad overskydende opløsning at absorbere på et laboratorievæv ved at berøre kanten af lysbilledet til et laboratorievæv. Placer derefter på kammerets side, der indeholder fedtet, med celler vendt op mod fedt og fastgør kammeret på scenemonteringen ved hjælp af en skruetrækker.
- Tilføj 1ML Ringer's buffer til kammeret for at forhindre, at celler tørrer, mens kammeret monteres på scenen og fuldfører resten af mikroskopopsætningen. Når vakuumsugeslangen er fastgjort til kammeret, er det endelige volumen, som kammeret rummer, ~ 450 μL.
- Skift mikroskopmålet til 40X olieinddrivningsmålet.
- Brug linsepapir og objektivrensningsopløsning til at rengøre og tørre målet. Gnid ikke målet. Dab forsigtigt, indtil overfladen er ren.
- Tilsæt en dråbe af nedsænkningsolien til målet.
- Placer mounten på mikroskopetrinnet og tilsæt vakuumspidsen til kammeret. Når vakuumsugeslangen er fastgjort til kammeret og tændt, er det endelige volumen, som kammeret rummer, ~ 450 μL. Dette sidste volumen er niveau med kammerets sider. Det er afgørende for kammeropløsningen at være niveau under forsøget for at forhindre løsningen i at falde ned i målet på grund af overfyldning.
- Brug den lyse felttilstand til at justere forstærkningen til 175 og eksponeringstiden til 0,03 s for at fokusere cellerne.
- Når cellerne er fokuserede, skift til fluorescensmodus ved hjælp af 488 nm excitation. Ændre eksponeringstiden til 0,07 s. Find et synsfelt, der har nok celler, der er sunde med tilstrækkelig fluorescens til billedet.
- Når et synsfelt er valgt, skal du tage billeder i fluorescens og lyse felttilstand.
- Cirkel en region af interesse (ROI) i cellerne eller cirkulere hele cellen for at optage intensiteten fra det valgte område.
6. Imaging Drug-inducerede Ca 2+ transienter og i situ K d Kalibrering
- Start intensitetsmåling med billedhastighed indstillet til en hver 5. s.
- Tillad baselineintensiteten at stabilisere sig i 20-30 rammer (100-150 s). Om nødvendigt reducer du frAmes / s under dette trin for at forhindre photobleaching.
- Beregn mængden af 4 cm cm, der er nødvendig fra en 20 mM stamme baseret på slutkammervolumen på ~ 450 μL for at opnå en slutkoncentration på 200 μM. Gør fortyndinger af lageret efter behov.
- Tag forsigtigt 60 μL Ringer's buffer fra kammeret og anbring det i et mikrocentrifugerør. Fortynd den beregnede mængde 4 cm med denne opløsning og tilføj tilbage til kammeret for at fremkalde det tilsigtede respons fra cellerne, der afbildes.
- Tilsæt den beregnede mængde 4 cm til mikrocentrifugerøret og bland ved pipettering.
- Tilsæt forsigtigt opløsningen over synsfeltet, samtidig med at tilføjelsesmarkøren tilføjes i intensitetsmåling.
- Tillad tid for lægemidlet at binde til receptoren og efterfølgende signalminskning, vask derefter med 3-6 ml Ringer's buffer med 1,8 mM Ca 2+ og 10 mM glucose, samtidig med at tilføjelsesmarkøren tilføjes. Da kammervolumenet er 450 ° C,# 181; L og er forbundet til et vakuum, idet tilsætning af 3-6 ml buffer sikrer, at den tidligere opløsning indeholdende lægemidlet er blevet vasket væk og erstattet med den nyligt tilsatte opløsning.
- Gentag 6,1-6,7 for 100 μM ATP og 15 μM CPA ved anvendelse af et nyt dias af transficerede celler for hvert assay.
- Når målingen er afsluttet, afslut dataopsamlingen i intensitetsmålingsvinduet i Simple PCI-programmet.
- Tag fluorescens og brightfield billeder af cellerne.
- Åbn datafilen til eksperimentet. Her, omcirkulere de celler eller regioner af interesse for at genberegne intensitetsværdierne, hvis det er nødvendigt.
- For at bestemme in situ K d i C2C12 myoblastceller, følg protokollen som skitseret i afsnit 4.2 og afsnit 5 og sæt 1 ml 0 mM Ca2 + Ringers buffer i kammeret.
- Permeabiliser cellerne med 0,002-0,005% saponin i intracellulær buffer i 15-30 s for at tømme cellerne af enhverCatchER +, der kan være i cytosolen. Vask cellerne med 3-6 ml 1 ml EGTA i KCl buffer med 10 μM ionomycin. Lad intensiteten falde, indtil et plateau er nået.
- Skyl med 3-6 ml KCl buffer med 10 μM ionomycin og lad intensiteten stabilisere, og tilsæt derefter hver Ca 2+ opløsning detaljeret i trin 2.7. Tillad intensiteten at nå et plateau mellem hver tilføjelse.
- For at kalibrere sensoren til basal [Ca 2+ ] kvantificering, følg trin 6.12. Brug EGTA og 100 mM Ca 2+ -pufferen fra trin 2.7 for at opnå den minimale og maksimale fluorescensintensitet.
7. Databehandling
- Download regnearkfilen af intensitetsmålingsdataene.
- Normaliser dataene for hver celle til baseline intensiteten (F / F 0 ). Plot de normaliserede data versus tid i ethvert grafprogram.
- For at beregne% -ændringen trækker du den normaliserede toppvalUe fra 1 og multiplicere med 100. Beregn gennemsnits- og standardafvigelsen, hvis flere celler blev afbildet.
- For at beregne signal-støjforholdet åbner SNR den billedfil, der er gemt fra eksperimentet i en billedbehandlingssoftware, såsom ImageJ, og måler så signalet, transfekterede celler og støj, baggrund. Beregn SNR ved hjælp af ligningen SNR = signal / støj.
- For at beregne in situ Kd fra de indsamlede fluorescensbilleddannelsesdata, gennemsnittet intensitetsdataene, der omfatter plateauerne, efter tilsætningen af hver Ca 2+ -koncentration og EGTA (0 mM Ca 2+ ). Beregn fraktioneret mætning (relativ intensitet) ved hjælp af θ = (F - F min ) / (F max - F min ), hvor θ er den relative intensitet, F er fluorescensen på et hvilket som helst punkt, F min er den mindste fluorescensintensitet og F max er den maksimale fluorescensintensitet for at se ændringen i intensiteten af tHan sondrer med tilsætningen af Ca 2+ i forhold til den mindste intensitet. Plot de relative intensitetsdata mod [Ca 2+ ] i et hvilket som helst grafisk og kurvefittingprogram. Brug 1: 1 bindingsligningen θ = [M T ] / (K d + [M T ]) oversat til ethvert grafisk og kurvefittingprogram til beregning af K d . M T er den samlede metalkoncentration.
- For at kvantificere det basale calcium fra kalibreringen skitseret i 6.13, gennemsnittet intensitetsdata, der omfatter plateauerne, efter tilsætningen af 1 mM EGTA (Fmin) og 100 mM Ca 2+ (Fmax). Brug kalibreringsligningen [Ca 2+ ] = K d ([F - F min ) / (F max - F)] for at beregne det basale calcium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dette afsnit illustrerer de resultater, der blev opnået ved anvendelse af de tidligere beskrevne metoder ved anvendelse af den optimerede ER / SR-målrettede GECI CatchER + til overvågning af ændringer i ER / SR Ca 2+ gennem forskellige receptormedierede veje.
Figur 1 illustrerer ER tømning gennem RyR stimuleret med 200 μM 4 cmc. 4 cmc er en agonist af RyR. Tilsætning af lægemidlet inducerer et fald i ER-calcium målt ved faldet i CatchER + fluorescensintensiteten. Som markeret tillader den her beskrevne protokol visualisering og måling af receptor-medierede Ca 2+ -transienter under anvendelse af CatchER +, som tilvejebringer information om ændringerne i ER Ca 2+ .
Som afbildet i figur 2 er tilsætningen af 15 μM CPA, til reversibelt blokering af SERCA-pumpen, giver et stort fald i fluorescensintensiteten, der danner et plateau. Da SERCA-pumpens funktion er hæmmet, frigiver ER Ca 2+ -frigivningskanalerne aktivt Ca 2+ aktivt i cytosolen, hvilket får fluorescensintensiteten til at falde. Cellerne gendannes efter vask af CPA væk med Ringer's buffer indeholdende 1,8 mM Ca 2+ og 10 mM glucose. Disse resultater bekræfter CatchER +'s evne til at overvåge Ca 2+ transienter, der er specifikke for SERCA-pumpen.
Figur 3 viser repræsentative data for den indirekte aktivering af IP3R med 200 μM ATP i HEK293-celler transficeret med CatchER + . ATP binder til P2Y-receptoren, en G-proteinkoblet receptor, som genererer IP 3, som aktiverer Ca 2+ -frigivelse gennem IP 3 R. Selv om forandringenEr lille, giver tilsætningen af 200 μM ATP et synligt fald i signalintensiteten. Vaskning af cellerne med Ringer's buffer indeholdende 1,8 mM Ca 2+ og 10 mM glucose gør det muligt for ER at refillere og signalet returnerer til basislinjen. Disse resultater fremhæver CatchER +'s evne til at overvåge IP 3 R-medieret calciumfrigivelse gennem indirekte stimulering.
I figur 4 blev CatchER + transficeret i C2C12 myoblastceller for at bestemme in situ Kd. Dataene blev indsamlet som beskrevet i protokollen. C2C12 myoblastceller blev permeabiliseret med 0,005% saponin i 15-30 s derefter vasket med 1 mM EGTA i KCl buffer indeholdende 10 μM ionomycin. De forskellige Ca2 + -koncentrationer blev fremstillet i KCl-buffer indeholdende 10 μM ionomycin og blev tilsat trinvis. Dataene blev normaliseret og monteret under anvendelse af 1: 1 bindingenLigning. Den gennemsnitlige Kd var 3,1 ± 1,4 mM for 7 celler. CatchER + 's svage affinitet gør det muligt at påvise Ca 2+ i høje Ca 2+ organeller som ER eller SR. For at bestemme basal [Ca 2+ ] i SR blev C2C12-celler permeabiliseret med 0,005% saponin i 15-30 s, vasket med KCl-buffer og derefter vasket med 1 mM EGTA i KCl-buffer indeholdende 10 μM ionomycin for at opnå F min . Efter vask af EGTA væk med KCl-buffer blev der tilsat maksimalt Fmax, 100 mM Ca 2+ med 10 μM ionomycin. Basal Ca 2+ blev beregnet til at være 0,4 ± 0,2 mM.
Figur 1: Stimulering af RyR ved anvendelse af 4 cmc i HEK293 celler. ( A ) Afbildning af aktiveringen af RyR med 4 cm. ( B ) Intensitetsoptagelse af HEK293-cellerTransficeret med CatchER + , lokaliseret i ER, behandlet med 200 μM 4 cmc. Stimulering af RyR med 4 cmc forårsager et fald i den normaliserede fluorescensintensitet, der direkte korrelerer med et fald i [Ca 2+ ] ER . N henviser til antallet af afbildede celler. Det gennemsnitlige signalfald var 12,0 ± 2,2%. Tilstedeværelsen af 1,8 mM Ca 2+ i Ringers bufferen lette genopfyldning af ER reflekteret i intensitetsgendannelsen til baseline. Insetbilleder viser cellerne før og efter behandling med 4 cm. SNR blev beregnet til 4,3 ± 0,8. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Fald i [Ca 2+ ] ER ved hjælp af den reversible SERCA pUmp-hæmmer-CPA i HEK293-celler. ( A ) Inhiberingen af SERCA-pumpen ved CPA. ( B ) Levende billeddannelse af HEK293-celler transficeret med CatchER + , lokaliseret i ER, behandlet med 15 μM CPA. Da Ca 2+ stadig kan strømme gennem IP 3 R og RyR, forårsager blokering af SERCA-pumpen med CPA et fald i den normaliserede fluorescensintensitet, der direkte korrelerer med et fald i [Ca 2+ ] ER . N henviser til antallet af afbildede celler. Insetbilleder er HEK293-celler transficeret med CatchER + før og efter behandling. Det gennemsnitlige signalfald var 21,0 ± 0,3%. Tilstedeværelsen af 1,8 mM Ca 2+ i Ringers bufferen lette genopfyldning af ER reflekteret i intensitetsgendannelsen til baseline. SNR blev beregnet til at være 5,5 ± 0,8. Klik her for at se en større version afDenne figur.
Figur 3: ATP reducerer [Ca2 + ] ER i HEK293 celler. ( A ) Skematisk af den indirekte aktivering af IP3R med ATP gennem den purinergreceptor P2YR. P2YR er en GPCR, som genererer IP 3 ved ATP-binding. IP 3 aktiverer IP 3 R, der stimulerer calciumfrigivelse fra ER. ( B ) Realtidsbilleddannelse af HEK293-celler transficeret med CatchER + , lokaliseret i ER, behandlet med 200 μM ATP. Indirekte stimulering af IP 3 R via P2Y-receptoren med ATP forårsager et fald i den normaliserede fluorescensintensitet, der direkte korrelerer med et fald i [Ca 2+ ] ER . N henviser til antallet af afbildede celler. Det gennemsnitlige signalfald var 6,0 ± 3,0%. SNR var cBeregnet til 6,7 ± 2,7. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: In situ Kd af CatchER + i C2C12 myoblastceller. Repræsentativt spor for normaliseret intensitet opsamlet fra permeabiliserede C2C12 myoblastceller transficeret med CatchER + . Celler blev permeabiliseret med 0,005% saponin i intracellulær buffer i 15-30 s. EGTA- og Ca2 + -opløsninger blev fremstillet i KCl-buffer, n henviser til antallet af afbildede celler. ( A ) Inset fluorescensbilleder er repræsentative for celler før og efter behandling. 0,3, 0,6, 2, 5, 10, 20, 50 og 100 mM Ca2 + blev tilsat til permeabiliserede C2C12 myoblastceller i nærvær af 10 μMIonomycin for at få en Kd på 3,1 ± 1,4 mM. ( B ) Insetfluorescensbilleder er repræsentative for celler ved minimums- og maksimumsværdier efter tilsætning af 1 mM EGTA og 100 mM Ca 2+ med henholdsvis 10 μM ionomycin. Basal Ca 2+ blev beregnet til at være 0,4 ± 0,2 mM. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Levende enkeltcellebilleddannelse af fluorescerende prober, såsom CatchER + , er en effektiv teknik til at analysere intrikate ER / SR Ca 2+ signalprocesser i hver celle som reaktion på receptoragonister eller antagonister. Denne teknik er også nyttig til billeddannelse ved anvendelse af flere bølgelængder samtidigt, som det er nødvendigt for Fura-2 eller til image CatchER + og Rhod-2 sammen for at overvåge henholdsvis henholdsvis ER- og cytosolisk calciumændringer. Der er flere kritiske trin i denne protokol; Celletransfektion kan have en stor effekt på billedets levedygtighed. Lavtransfektionshastigheder kan resultere i utilstrækkelig ekspression af GECI til overvågning af calciumresponser. På den anden side vil overekspression af CatchER + ikke have en buffringsvirkning på ER / ER Ca 2+ , et problem forbundet med syntetiske calciumfarvestoffer. Buffervirkninger af Ca 2+ prober påvirkes af [Ca 2+ ] i organellen, K d af pKappe og koncentrationen af sonden der kræves til måling. Cytosolisk [Ca2 + ] er typisk i den lave nanomolære rækkevidde, men den krævede probekoncentration er i et sammenligneligt interval. I dette tilfælde var mængden af farvestofkoncentration og dens evne til at buffre cytosolisk calcium, og er en stor bekymring for cellulær billeddannelse. I modsætning hertil er ER / SR [Ca2 + ] i 100'erne af mikromolær til millimolært område 31, som vi bestemt for forskellige pattedyrcellelinjer 25 . Eftersom 0,1-1 μM ekspression af CatchER + er tilstrækkelig til at muliggøre detektion af ER-calcium, er buffersekvensen af CatchER ubetydelig. CatchER + kan således overvåge Ca 2+ flux i høje [Ca 2+ ] miljøer uden nogen buffringsvirkning på luminal ER / SR Ca 2+ 32 .
Flere faktorer kan påvirke transfektionseffektiviteten af GECI, såsom inkubationstiden, thE-transfektionsreagens, inkubationstemperaturen og cellekonfluensen. Cellekonfluensen kan, når der sættes celler på diaset, påvirke billedkvaliteten betydeligt. Lav konfluens kan resultere i et lavt antal celler (n) og mindre statistisk nøjagtighed, mens høje niveauer af konfluens fører til overlappende lag af celler, som producerer store variabler i billeddannelse. Tiden og temperaturen for transfektion bør optimeres baseret på celletypen. Derudover er tilsætning af DMEM med reduceret serummedium optimal for længere transfektionstider for at forhindre apoptose. Den oprindelige GECI CatchER-fluorescens i pattedyrceller, når den dyrkes og transficeres, var kun 30 ° C. Fluorescensen af CatchER blev optimeret optimalt og forbedret til ekspression ved 37 ° C, hvilket resulterede i den nye, forbedrede variant CatchER + . Et western blot ved anvendelse af et antistof mod EGFP kan udføres for at bekræfte ekspressionen af Ca2 + probe.
Desuden er migThod og konsistens af reagenslevering er kritisk. Reagenser kan tilsættes til kammeret ved perfusion, små volumediffusion eller ved mekaniske pumper, som alle kan fremkalde forskellige reaktioner. Det er afgørende, at opløsningskammeret er ordentligt forseglet ved at påføre et lag tætningsmiddelfedt på bunden af kammeret, som vil blive anbragt på glideren. De korrekte bølgelængder skal vælges til sonden. Excitations- og emissionsbølgelængder for CatchER + er henholdsvis 395/488 nm og 510 nm. Til celledannelse anvendes kun 488 nm til excitation for at undgå skadelig virkning af UV-lys på celler. Anvendelse af eventuelle optiske filtre, som exciterer ved 488 nm og opsamler emissionen ved 510 nm, ville derfor være acceptabel at anvende til at blive afbildet med CatchER + . For at forhindre photobleaching kan indsatsen være fokuseret på at optimere lysintensitet og lyseksponering som rammer / s 33 .
Mens denne protokol er ideel til at analysere effEct af ER / SR ændringer ved anvendelse af CatchER + Ca 2+ ER / SR fluorescerende probe, er der begrænsninger som forventet i ethvert eksperiment. Da single cell live imaging kun analyserer en lille ramme af celler, kan antallet af celler (n) variere fra 1-100 celler i gennemsnit, men kan være lavere for større cellelinjer. Dette fører til lavere celle tal og statistisk varierede resultater uden flere forsøg. En n> 6 er nødvendig for statistisk nøjagtighed. For at få en større n, skal mange retter afbildes eller andre teknikker skal bruges samtidigt. Derudover er CatchER + en enkeltbølgelængde ER / SR Ca 2+ probe, hvilket fører til problemerne med andre enkeltbølgelængdeprober og farvestoffer, idet man ikke er i stand til at kvantificere signalet, uden at vide, om signalet er sandt i modsætning til forstyrrelser af cellerne Artefakt og har større støj sammenlignet med ratiometriske systemer 34 .
Dette arbejde viser, at disse optimerede Ca 2+ prober kanAnvendes i forskellige celletyper eller vævstyper til overvågning af receptor-medieret ER / SR Ca 2+ -frigivelse. CatchER + er en enkeltbølgelængde ER / SR Ca 2+ probe. Derfor er det vigtigt, at de eksperimentelle parametre og indstillinger er konsistente til kvantitativ måling. En detaljeret kalibrering af calciumkoncentrationen og Kd af calciumsensoren i cellelinierne er yderligere vigtige målinger til kvantitativ analyse.
Disse udviklede calciumsensorer kan også målrettes til specifikke steder inden for ER / SR for at overvåge de meget forskellige Ca 2+ transienter, der eksisterer i forhold til globale Ca 2+ ændringer i forskellige biologiske og patologiske tilstande. Disse resultater vil fortsætte med at skubbe felterne Ca 2+ billeddannelse og probe design frem for at tilvejebringe fremtidige værktøjer til diagnosticering af Ca 2+ -relaterede sygdomme. De rapporterede protokoller og udviklede sensorer kan også tilpasses til lægemiddel dAfdækning mod sygdomme forbundet med calciumsignalering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af NIH GM62999, NIH EB007268, NIH AG15820, B & B Seed Grant og en NIH Supplementary Grant til FR, BB-stipendium til CM, CDT-fællesskab til RG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-Chloro-3-methylphenol (4-CmC) | Sigma-Aldrich | C55402 | |
| 515DCXR dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | NC338059 | |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| Calcium chloride dihydrate | EMD Millipore | 102382 | |
| Corning tissue-culture treated culture dishes (100 mm) | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
| Corning tissue-culture treated culture dishes (60 mm) | Sigma-Aldrich | CLS430166 | |
| Cyclopiazonic Acid (CPA) | EMD Millipore | 239805 | |
| D(+)-Glucose | ACROS Organics | 41095-0010 | |
| Dow Corning 111 Valve Lubricant & Sealant | Warner Instruments | 64-0275 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D7777 | |
| Ethylenebis(oxyethylenenitrilo) tetraacetic Acid (EGTA) |
ACROS Organics | 409911000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher | 26140087 | |
| Fisherbrand Cover Glasses 22x40 mm | Fisher Scientific | 12-544B | |
| Hanks’ Balanced Salts (HBSS) | Sigma-Aldrich | H4891 | |
| HEPES, Free Acid, Molecular Biology Grade | EMD Millipore | 391340 | |
| Immersion Oil without autofluorescence | Leica | 11513859 | |
| Ionomycin, Free Acid | Fisher Scientific | 50-230-5804 | |
| Leica DM6100B inverted microscope with a cooled EM-CCD camera | Hamamatsu | C9100-13 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher | 11668019 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | ThermoFisher | L3000015 | |
| Low Profile Open Diamond Bath Imaging Chamber | Warner Instruments | RC-26GLP | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Fisher Scientific | M33-500 | |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 51985034 | |
| Potassium Chloride | EMD Millipore | PX1405 | |
| Potassium Phosphate, Dibasic | EMD Millipore | PX1570 | |
| Potassium Phosphate, Monobasic | EMD Millipore | PX1565 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| SimplePCI Image Analysis Software | Hamamatsu | N/A | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-3 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sterivex-GV 0.22 µm filter | EMD Millipore | SVGVB1010 | |
| Till Polychrome V Xenon lamp | Till Photonics | N/A | |
| Trypsin (2.5%), no phenol red (10x) | ThermoFisher | 15090046 |
References
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).
- Berridge, M. J. Calcium signalling remodelling and disease. Biochem. Soc. Trans. 40, 297-309 (2012).
- Tang, S., Reddish, F., Zhuo, Y., Yang, J. J. Fast kinetics of calcium signaling and sensor. Curr. Opin. Chem. Biol. 27, 90-97 (2015).
- Rizzuto, R., Pozzan, T. Microdomains of intracellular Ca2+: Molecular determinants and functional consequences. Physiol. Rev. 86 (1), 369-408 (2006).
- Berridge, M. J. The endoplasmic reticulum: a multifunctional signaling organelle. Cell Calcium. 32 (5-6), 235-249 (2002).
- Clapham, D. E. Calcium Signaling. Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).
- HerrmannFrank, A., Richter, M., Sarkozi, S., Mohr, U., LehmannHorn, F. 4-chloro-m-cresol, a potent and specific activator of the skeletal muscle ryanodine receptor. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1289 (1), 31-40 (1996).
- Ferris, C. D., Huganir, R. L., Bredt, D. S., Cameron, A. M., Snyder, S. H. Inositol trisphosphate receptor: phosphorylation by protein kinase C and calcium calmodulin-dependent protein kinases in reconstituted lipid vesicles. Proc. Natl. Acad. Sci. 88 (6), 2232-2235 (1991).
- Dubyak, G. R., el-Moatassim, C. Signal transduction via P2-purinergic receptors for extracellular ATP and other nucleotides. Am. J. Physiol., Cell Physiol. 265 (3 Pt 1), C577-C606 (1993).
- Song, Z., Vijayaraghavan, S., Sladek, C. D. ATP increases intracellular calcium in supraoptic neurons by activation of both P2X and P2Y purinergic receptors. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 292 (1), R423-R431 (2007).
- Brini, M., Carafoli, E. Calcium Pumps in Health and Disease. Physiol. Rev. 89 (4), 1341-1378 (2009).
- Michelangeli, F., East, J. M. A diversity of SERCA Ca2+ pump inhibitors. Biochem. Soc. Trans. 39 (3), 789-797 (2011).
- Hofer, A. M., Landolfi, B., Debellis, L., Pozzan, T., Free Curci, S. Ca2+ dynamics measured in agonist-sensitive stores of single living intact cells: a new look at the refilling process. Embo J. 17 (7), 1986-1995 (1998).
- Hofer, A. M., Machen, T. E. Technique For InSitu Measurement of Calcium in Intracellular Inositol 1,4,5-Trisphosphate-Sensitive Stores Using The Fluorescent Indicator Mag-Fura-2. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90 (7), 2598-2602 (1993).
- Raju, B., Murphy, E., Levy, L. A., Hall, R. D., London, R. E. A fluorescent indicator for measuring cytosolic free magnesium. Am J Physiol. 256, (1989).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).
- Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. Y. Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (50), 17404-17409 (2004).
- Heim, N., Griesbeck, O. Genetically Encoded Indicators of Cellular Calcium Dynamics Based on Troponin C and Green Fluorescent Protein. J. Biol. Chem. 279 (14), 14280-14286 (2004).
- Mank, M., et al. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophys. J. 90 (5), 1790-1796 (2006).
- Garaschuk, O., Griesbeck, O., Konnerth, A. Troponin C-based biosensors: A new family of genetically encoded indicators for in vivo calcium imaging in the nervous system. Cell Calcium. 42 (4-5), 351-361 (2007).
- Carlson, H. J., Campbell, R. E. Mutational Analysis of a Red Fluorescent Protein-Based Calcium Ion Indicator. Sensors. 13 (9), 11507-11521 (2013).
- Wang, Q., Shui, B., Kotlikoff, M. I., Sondermann, H. Structural Basis for Calcium Sensing by GCaMP2. Structure. 16 (12), 1817-1827 (2008).
- Koldenkova, V. P., Nagai, T. Genetically encoded Ca2+ indicators: Properties and evaluation. Biochim. Biophys. Acta-Mol. Cell Res. 1833 (7), 1787-1797 (2013).
- Tang, S., et al. Design and application of a class of sensors to monitor Ca2+ dynamics in high Ca2+ concentration cellular compartments. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (39), 16265-16270 (2011).
- Zou, J., et al. Developing sensors for real-time measurement of high Ca2+ concentrations. Biochemistry. 46 (43), 12275-12288 (2007).
- Wang, Z. -M., Tang, S., Messi, M. L., Yang, J. J., Delbono, O. Residual sarcoplasmic reticulum Ca2+ concentration after Ca2+ release in skeletal myofibers from young adult and old mice. Pflugers Arch., EJP. 463 (4), 615-624 (2012).
- Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 24 (1), 79-88 (2006).
- Siemering, K. R., Golbik, R., Sever, R., Haseloff, J. Mutations that suppress the thermosensitivity of green fluorescent protein. Current Biology. 6 (12), 1653-1663 (1996).
- Reddish, F. N. Design Of Genetically-Encoded Ca2+ Probes With Rapid Kinetics for Sub-Cellular Application [dissertation]. , Georgia State University. (2016).
- Seo, M. D., Enomoto, M., Ishiyama, N., Stathopulos, P. B., Ikura, M. Structural insights into endoplasmic reticulum stored calcium regulation by inositol 1,4,5-trisphosphate and ryanodine receptors. Biochim. Biophys. Acta-Mol. Cell Res. 1853 (9), 1980-1991 (2015).
- Lambert, D. G. Calcium signaling protocols. , Humana Press. (1999).
- Stephens, D. J., Allan, V. J. Light microscopy techniques for live cell imaging. Science. 300 (5616), 82-86 (2003).
- Bootman, M. D., Rietdorf, K., Collins, T., Walker, S., Sanderson, M. Ca2+-sensitive fluorescent dyes and intracellular Ca2+ imaging. Cold Spring Harb. 2013 (2), Cold Spring. 83-99 (2013).
