ניטור ER / SR סידן שחרור עם CA ממוקד Published: May 19, 2017 doi: 10.3791/55822

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Florence N. Reddish¹, Cassandra L. Miller¹, Rakshya Gorkhali¹, Jenny J. Yang¹

¹Department of Chemistry, Center of Diagnostics and Therapeutics (CDT), Georgia State University

Summary

אנו מציגים פרוטוקולים ליישום של מחוון סידן מקודד גנטית ממוקד גנטית (GECI) Catcher ⁺ לניטור מהיר trans סידן ב reticulum endoplasmic / sarcoplasmic (ER / SR) של HEK293 ו שלד שריר תאים C2C12 באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בזמן אמת. פרוטוקול למדידה באתרו K _d וכיול נדון גם.

Abstract

סידן תאיים (Ca ^{2 +} ) transients עורר על ידי גירויים תאיים ליזום מספר רב של תהליכים ביולוגיים אורגניזמים חיים. במרכזו של שחרור סידן תאיים הם האורגנים הגדולים אחסון סידן תאיים, reticulum endoplasmic (ER) ואת reticulum sarcoplasmic מיוחדים (SR) בתאי שריר. שחרור דינמי של סידן מן האברונים האלה מתווכת על ידי קולטן ryanodine (RyR) ו inositol קולטן 1,4,5-triphosphate (IP ₃ R) עם מילוי המתרחשים באמצעות משאבת הסרקו / endoplasmic סידן ATPase (SERCA). חיישן סידן מקודד גנטית (GECI) בשם Catcher נוצר כדי לפקח על שחרור סידן מהיר ER / SR. הנה, פרוטוקולים מפורטים עבור transfection וביטוי של שיפור, ER / SR- ממוקד GECI Catcher ⁺ ב HEK293 ו C2C12 תאים ויישומה ניטור IP ₃ R, ריר, SERCA משאבת בתיווך סידן חולףS בתאים HEK293 באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מתואר. קולטן אגוניסט או מעכב של בחירה הוא התפזר פתרון קאמרי ואת השינויים בעוצמה נרשמות בזמן אמת. עם שיטה זו, ירידה סידן ER נראה עם הפעלת ריר עם 4-chloro-m-cresol (4-cmc), ההפעלה העקיפה של IP ₃ R עם אדנוזין טריפוספט (ATP), וכן עיכוב של משאבת SERCA עם cyclopiazonic חומצה (CPA). כמו כן, אנו דנים בפרוטוקולים לקביעת באתרו K _ב ו לכמת הבסיס [Ca ^{2 +} ] בתאי C2C12. לסיכום, פרוטוקולים אלה, המשמשים יחד עם Catcher ⁺ , יכולים לעורר קולטן בתיווך סידן בתיווך עם יישום עתידי בחקר ER / SR סידן פתולוגיות הקשורות.

Introduction

התכונות הספציו-טמפורליות של סידן תאיים (Ca ^{2 +} ) חולפות פונקציות ביולוגיות שונות ¹ . אלה Ca ^{2 +} אירועים איתות מופעלות מחוץ לתאי באמצעות גירויים שונים נשלט intracellularly על ידי Ca ^{2 +} האחסון הגדולות אחסון על ידי רבים Ca ^{2 +} משאבות, ערוצים, Ca ^{2 +} חלבונים מחייב. Ca ^{2 +} transients יכול להיות שונה באופן משמעותי כתוצאה של פגמים עם אפנון האות, המוביל למחלות שונות ² . בגלל המהירות ואת המורכבות של Ca ^{2 +} מערכת איתות, עם endo- (ER) ו sarcoplasmic reticulum (SR) במרכז, גנטית מקודדים Ca ^{2 +} בדיקות כי כבר אופטימיזציה עבור ביטוי יונקים עם קינטיקה מהירה יש צורך כדי לעקוב אחר Ca ^{2 +} המקומי המקומי שינויים בתאים שונים ³ .

ER ו SR, עמיתו בתאי השריר, הם תאיים מרכזי תא Ca ^{2 +} אחסון ולפעול כמו Ca ^{2 +} כיורים המסייעים להגביר את Ca ^{2 +} אות ⁴ . ER / SR הוא חלק בלתי נפרד Ca ^{2 +} איתות עם תפקידים כפולים כמו משדר מקלט של אותות ⁵ . הקולטן ryanodine (RyR) ו inositol קולטן 1,4,5-triphosphate (IP ₃ R) הם Ca ^{2 +} קולטנים שחרור ממוקם על הקרומים של ER / SR כי מוסדרים על ידי Ca ^{2 + 6} . סוכנים אחרים במישרין או בעקיפין לעורר את הפונקציה של קולטנים אלה. 4-chloro-m-cresol (4-cmc) הוא אגוניסט חזק של ריר, בעל 10 רגישות גבוהה יותר מאשר קפאין להפקת SR Ca ^{2 +} שחרור שבו שניהם מועסקים באופן קבוע ללמוד RI בתיווך Ca ^{2 +} שחרור ב תאים בריאים וחולים. ATP מגדיל IP _3- מתווכת Ca ^{2 +} מחדשחכירה באמצעות IP ₃ R ⁸ . ATP נקשר לקולטן הפורינרגי P2YR, קולטן G יחד עם ה- GPR, המפעיל את ייצור ה- IP ₃ המחובר ל- IP ₃ R כדי לשחרר Ca ^{2 +} ממכשיר ה- ER ^{9 , 10} . המשאבה הסרקו-endoplasmic reticulum סידן ATPase (SERCA) היא משאבת ATPase מסוג P, הממוקמת גם על קרום ER / SR המפחית cytosolic Ca ^{2 +} וממלא את ER / SR על ידי פעיל לשאוב את יון לתוך לומן ER / SR ¹¹ . מעכבים ספציפיים של המשאבה SERCA כוללים thapsigargin, מ Thapsia garganica , וחומצה cyclopiazonic (CPA), מ Aspergillus ו פניציליום . מחיר לרכישה יש זיקה נמוכה עבור המשאבה וחוסמת באופן הפוך את נקודת הגישה ^{2 +} Ca ¹² . Thapsigargin, לעומת זאת, באופן בלתי הפיך נקשר המשאבה Ca ^{2 +} חינם ב שאריות F256 ב הסליל M3 עם nanomolז. ניתוח וכימות השינויים הכרוכים Ca ^{2 +} אירועים מגורה כבר ונשאר אתגר. מאז ER / SR הוא תת subcellular מרכזי Ca ^{2 +} המכיל תא עם פונקציה מרכזית בהפצה של האות Ca ^{2 +} , הרבה עבודה כבר התמקדו בהבנה ER / SR Ca ^{2 +} איתות ⁵ .

יצירת סינתטי Ca ^{2 +} צבעים עזר לקדם את השדה והנוהג של Ca ^{2 +} הדמיה. למרות צבעים, כגון מג-פורה -2, נעשה שימוש נרחב למדידת Ca ^{2 +} תאים בתאים שונים, ^{13 , 14 , 15} יש להם מגבלות כגון עומס צבע אחיד, photobleaching, ואת חוסר היכולת להיות ממוקד לארגנים ספציפיים . גילוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) וקידום של חלבון פלואורסצנטי,מבוסס Ca ^{2 +} בדיקות יש דחף את שדה Ca ^{2 +} הדמיה קדימה ¹⁶ . חלק GECIs הקיימים הם Förster תהודה העברת אנרגיה (סריג) זוגות מעורבים חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP), חלבון פלואורסצנטי ציאן (CFP), רמודודולין ואת פפטיד M13 מחייב ^{17 , 18} . Troponin C מבוססי GECIs זמינים גם כמו זוגות סריג של CFP ו Citrine וכן בדיקות fluorophore יחיד ^{19 , 20 , 21} . אחרים, כגון GCaMP2 ו- R-GECO הם חיישנים fluorophore יחיד המעורבים רגוע ^{22 , 23} . כדי להתגבר על המגבלות של כוונון צר של K _ד 'ו שיתופית קשורה הקשורים מספר Ca ^{2 +} אתרים מחייב למצוא Ca ² שלהם ⁺ תחומים מחייב ²⁴ , מחלקה חדשנית של סידן סןסורס נוצר על ידי עיצוב Ca ^{2 +} אתר מחייב על פני השטח של חבית ביתא במיקום רגיש chromophore של חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (EGFP) ^{25 , 26} . זה חיישן touted, קרא Catcher, יש K _d של ~ 0.18 מ"מ, ak _על גבול דיפוזיה, ו ak של 700 s ^-1 . Catcher שימש כדי לפקח על קולטן בתיווך ER / SR סידן לשחרר שורות תאים יונקים שונים כגון HeLa, HEK293, ו C2C12 ²⁵ . בגלל הקינטיקה המהירה שלה, Catcher היה בשימוש סיבי שריר מכופף digitorum brevis (FDB) של צעירים וידידים חבר 'ה ב NIH ג' קסון (FVB) עכברים לחשוף כי יותר Ca ^{2 +} נשאר SR לאחר 2 של פוליאוריזציה של FDB סיבי עכברים ישנים בהשוואה לזו של עכברים צעירים ²⁷ . כדי להתגבר על הקרינה נמוכה ב 37 מעלות צלזיוס, אשר מעכב את היישומים שלה הדמיה סידן של יונקיםתאים, פיתחנו גרסה משופרת של Catcher שנקרא Catcher ⁺ . Catcher ⁺ תערוכות משופרת הקרינה על 37 מעלות צלזיוס ליישום טוב יותר בתאי יונקים. מוטציות נוספות שולבו Catcher כדי לשפר את thermostability ו פלואורסצנטי ב 37 ° C ^{28 , 29} , כדי ליצור Catcher ⁺ . Catcher ⁺ מציג עלייה פי שישה ביחס האות לרעש (SNR) מעל Catcher ³⁰ .

כאן, הפרוטוקולים של התרבות transfection של HEK293 ו C2C12 תאים עם Catcher ⁺ ויישומו לניטור ER / SR קולטן בתיווך סידן חולפים מוצגים. תוצאות נציג מוצגים עבור Catcher ⁺ לידי ביטוי HEK293 תאים שטופלו 4-cmc, CPA ו- ATP. כמו כן, אנו מספקים פרוטוקול לקביעת באתרו K של Catcher ⁺ ב C2C12 תאים myoblast ו quaNtification של הבסיס [Ca ^{2 +} ].

Protocol

1. הכנת שקופיות

1. מקום 22 מ"מ x 40 מ"מ זכוכית שקופיות מיקרוסקופ ב 6 ס"מ מנות תרבות התא, 1 שקופית לכל צלחת.
2. לחשוף כל צד של כל שקופית, כמו גם את צלחת 6 ס"מ אור אולטרה סגול (UV) במשך 15-20 דקות לעקר ברדס סטרילית.
3. מכסים את הכלים עם שקופיות בפנים עם parafilm ו חנות ב 4 ° C עד מוכן לשימוש.

2. הכנה של מדיה, Buffers, פתרונות, ריאגנטים

1. הכן 1 L של פתרון מלח מאוזן של האנק (HBSS) במים deionized ולהוסיף 10 מ"מ HEPES, 5 מ"מ NaHCO ₃ , ו 1 מ"מ EGTA. התאם ל- pH 7.2-7.3 עם NaOH. חיץ מסנן עם מסנן 0.22 מיקרומטר לתוך בקבוק autoclaved.
2. הכן 900 מ"ל של גלוקוז גבוהה של Dulbecco השתנה של נשר בינוני (DMEM) ש במים deionized. הוסף 44 מ"מ NaHCO ₃ ולהתאים את ה- pH 7.2-7.3 עם HCl. סנן מדיה עם מסנן 0.22 מיקרומטר לתוך בקבוק autoclaved. הוסף 100 מ"ל של עוברי boviNe בסרום (FBS) לתקשורת כדי להפוך את ריכוז FBS 10%. חנות ב 4 ° C.
3. הכן 1 L למאגר תאיים (125 מ"מ KCl, 25 מ"מ NaCl, 10 מ"מ HEPES, 0.2 מ"מ CaCl ₂ , 0.5 מ"מ EGTA, 0.2 מ"מ MgCl ₂ ) במים deionized, ולהתאים את ה- pH ל -7.25. הסופי [Ca ^{2 +} ] יהיה ~ 100 ננומטר. לפני השימוש, הוסף 0.5 מ"מ ATP. חנות בטמפרטורת החדר.
4. הכן 1 L של המאגר של רינגר (121 מ"מ NaCl, 2.4 מ"מ K ₂ HPO ₄ , 0.4 מ"מ KH ₂ PO ₄ , 10 מ"מ HEPES, ו 1.2 מ"מ MgCl ₂ ) במים deionized, ולהתאים את ה- pH 7.2. חנות בטמפרטורת החדר. כדי להשתמש, aliquot 50 מ"ל לתוך צינור 50 מ"ל ולהוסיף 1.8 מ"מ Ca ^{2 +} ו 10 מ"מ גלוקוז.
5. הכן 1 L של פתרון KCl לשטוף (125 מ"מ KCl, 25 מ"מ NaCl, 10 HEPES מ"מ, 0.2 מ"מ MgCl ₂ ) במים deionized, ולהתאים את ה- pH ל 7.25.
6. ממיסים 5 מ"ג של יונומיצין ב 1 מ"ל של דימתיל sulfoxide (DMSO). Aliquot 30 μL לתוך microtubes ולאחסן ב -206; ג.
7. הכן את חומצה cyclopiazonic (CPA) המניות על ידי הפיכת CPA לתוך DMSO. ודא אחוז הסופי של DMSO הוא ≤ 1% עבור CPA הוסיף לתאים כדי למנוע אפופטוזיס. הכן 20 מ"מ 4-chloro-m-cresol (4-cmc) על ידי המסת לתוך מסונן H ₂ O ולתת לו לפזר בן לילה על ידי רועד ב 37 מעלות צלזיוס. הכן את מלאי ה- ATP על ידי המסת מסוננים H ₂ O ל 100 מ"מ.
8. כדי לקבוע את K ב _D באתרו , להכין 15 מ"ל כל 1 מ"מ EGTA, 0.2 מ"מ, 0.6 מ"מ, 2 מ"מ, 5 מ"מ, 10 מ"מ, 20 מ"מ, 50 מ"מ, ו 100 מ"מ Ca ^{2 +} במאגר KCl באמצעות 100 MM EGTA המניות 1 מ 'CaCl ₂ מלאי מומס במים deionized.

3. תרבות התא

1. תרבות C2C12 myoblast ו HEK293 תאים על פי פרוטוקולים ATCC עבור כל שימוש 10 ס"מ תרבית תרבות צלחות ברדס UV סטרילית.
   הערה: תאים C2C12 לא צריך להיות מותר לגדול גבוה יותר מאשר מפגש ~ 70% מאז myoblasts יתחילו differentiaTe לתוך myotubes. הן HEK293 ו C2C12 תאים לגדול בקלות ולא צריך להיות מותר לגדול בעבר 100% confluency לשמור על שלמות התא. בנוסף, תאים לא צריך להיות passaged יותר מ 10 פעמים לפני השימוש בהם עבור ניסוי כדי לשמור על בריאות התא.

4. transfection של תאים HEK293

1. זרע HEK293 תאים על גבי 22 מ"מ x x 40 מ"מ זכוכית שקופיות מיקרוסקופ ב 6 ס"מ צלחות כך שהם ~ 70% confluent יום transfection.
2. למחרת, בצע את הפרוטוקול של היצרן עבור מגיב transfection כדי transfect תאים באמצעות 2 מיקרוגרם של CDNA ⁺ CDNA ו 1: 3 (משקל / נפח) DNA: יחס מגיב transfection בתקשורת בסרום מופחת ( למשל Opti-MEM).
3. רוקן את התקשורת DMEM מהצלחת, ולהוסיף 3 מ"ל של התקשורת בסרום מופחת. הוסף DNA: תערובת מגיב transfection למאכל ו דגירה של 4-6 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.
4. לאחר הדגירה, לשטוף את התאים עם 5-6 מ"ל של HBSS. מחק את HBSS fROM את המנה ולהחליף עם 3 מ"ל של DMEM טרי דגירה אותם על 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות כדי לאפשר ביטוי של GECI.
5. Transfection של תאים C2C12 myoblast
   1. עבור תאים C2C12 myoblast, תאים trypsinize על ידי הוספת מספיק טריפסין כדי לכסות את החלק התחתון של צלחת (1-2 מ"ל). מניחים את המנה 37 ° C חממה עבור 2-6 דקות כדי לאפשר טריפסין כדי לשחרר את התאים מהחלק התחתון של המנה.
   2. לאחר הדגירה הושלם, להסיר את טריפסין לשאוב את התאים 8 מ"ל של DMEM. פיפטה התאים ביסודיות עם DMEM לפזר באופן שווה מחדש להשעות תאים te וזרע אותם על coverslips סטרילית ב 6 ס"מ צלחות תרבות התא המכיל 3 מ"ל של DMEM כך המפגש הסופי הוא 60%.
   3. Transfect התאים באותו היום כפי שתואר בשלב 4.2-4.3. לדגור על 24 שעות ב 37 ° C.
   4. חזור על שלב 4.4.

5. הכנת מיקרוסקופ שקופיות פלואורסצנטי

1. הפעל את mIcroscope ומקור האור, ולאחר מכן לפתוח את תוכנית PCI פשוטה. אפשר המיקרוסקופ כדי להתחמם במשך 15-20 דקות או עד תשלום מצמידים המכשיר (CCD) המצלמה מתקרר ל -65 ° C. הכן את החדר שקופית עם תאים בזמן ההמתנה.
2. מכסים את החלק התחתון של פרופיל נמוך יהלום פתוח תא הדמיה עם שכבה דקה של איטום, באמצעות צמר גפן.
3. קח את השקופית המכילה תאים transfected מתוך חממה בעדינות לשטוף שלוש פעמים עם 1 מ"ל של המאגר של רינגר עם 10 גלוקוז מ"מ ו 1.8 מ"מ CA ^{2 +} שחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס.
4. השאירו 1 מ"ל של המאגר של רינגר בצלחת, כדי למנוע התייבשות תאים, ולהשתמש מלקחיים לקחת את השקופית מתוך המנה. אפשר פתרון עודף לספוג על רקמת מעבדה על ידי נגיעה בקצה השקופית לרקמה במעבדה. לאחר מכן מקום על הצד של החדר המכיל את השומן עם תאים הפונים כלפי מעלה לכיוון השמן ואת החדר מאובטח על הר הבמה באמצעות מברג.
5. הוסף 1מ"ל של המאגר של רינגר לתא כדי למנוע תאים מתייבש בעת הרכבה החדר על הבמה ומשלים את שאר ההתקנה מיקרוסקופ. לאחר צינור שאיבה ואקום מחובר לתא, נפח הסופי החדר מחזיקה ~ 450 μL.
6. החלף את המטרה מיקרוסקופ כדי 40X שמן טבילה המטרה.
7. השתמש בנייר עדשות ובפתרון ניקוי העדשות לניקוי וייבוש המטרה. לא לשפשף את המטרה. מטפטפים בעדינות עד שהמשטח נקי.
8. הוסף טיפה אחת של שמן טבילה אל המטרה.
9. מניחים את הר על הבמה מיקרוסקופ ולהוסיף את קצה ואקום לתא. לאחר צינור שאיבה ואקום מחובר לחדר מופעלת, נפח הסופי החדר מחזיקה ~ 450 μL. זה נפח סופי הוא ברמה עם הצדדים של החדר. זה הכרחי עבור הפתרון קאמרית להיות ברמה, במהלך הניסוי, כדי למנוע את הפתרון נשפך לתוך המטרה עקב מילוי יתר.
10. באמצעות מצב שדה בהיר, להתאים את הרווח 175 ואת זמן החשיפה ל 0.03 s כדי למקד את התאים.
11. לאחר התאים ממוקדים, לעבור למצב הקרינה באמצעות עירור 488 ננומטר. שנה את זמן החשיפה ל- 0.07 s. אתר שדה תצוגה שיש בו מספיק תאים כי הם בריאים עם הקרינה נאותה לתמונה.
12. לאחר שדה הראייה נבחר, לצלם במצב הקרינה ואת שדה בהיר.
13. מעגל אזור עניין (ROI) בתאים או מעגל את התא כולו כדי להקליט את העוצמה מהאזור הנבחר.

6. הדמיה סמים המושרה Ca ^{2 +} חולפים ב Situ K _ד כיול

1. הפעל את עוצמת העוצמה עם קצב המסגרת שנקבע בכל 5 שניות.
2. אפשר את עוצמת הבסיס לייצב עבור 20-30 מסגרות (100-150 s). במידת הצורך, להקטין את frAmes / s במהלך שלב זה כדי למנוע photobleaching.
3. חישוב כמות של 4 ס"מ נדרש ממלאי 20 מ"מ מבוסס על נפח החדר הסופי של μL ~ 450 לעשות ריכוז סופי של 200 מיקרומטר. לעשות דילולים של המניה לפי הצורך.
4. בזהירות לקחת 60 μL של חיץ רינגר מן החדר מקום בצינור microcentrifuge. לדלל את הסכום המחושב של 4-cmc עם פתרון זה ולהוסיף חזרה לחדר כדי לעורר את התגובה המיועדת מן התאים להיות צילמו.
5. מוסיפים את הסכום המחושב של 4-cmc לצינור microcentrifuge ומערבבים על ידי pipetting.
6. הוסיפו בעדינות את הפתרון מעל שדה הראייה, תוך הוספת סמן האירוע במדידת העוצמה.
7. אפשר זמן התרופה כדי לאגד את הקולטן ולאחר מכן ירידה האות, ולאחר מכן לשטוף עם 3-6 מ"ל של המאגר של רינגר עם 1.8 מ"מ Ca ^{2 +} ו 10 מ"מ גלוקוז בעת ובעונה אחת להוסיף את סמן האירוע. מאז נפח החדר הוא 450 &# 181; L והוא מחובר ואקום, הוספת 3-6 מ"ל של חיץ מבטיחה כי הפתרון הקודם המכיל את התרופה נשטף והחליף עם הפתרון החדש הוסיף.
8. חזור על 6.1-6.7 עבור 100 מיקרומטר ATP ו -15 מיקרומטר מחיר לרכישה, באמצעות שקופית חדשה של תאים transfected עבור כל assay.
9. לאחר המדידה תושלם, לסיים את איסוף הנתונים בחלון המדידה עוצמת בתוכנית פשוטה PCI.
10. קח תמונות פלואורסצנטי ו brightfield של התאים.
11. פתח את קובץ הנתונים עבור הניסוי. הנה, מעגל מחדש את התאים או אזורים של עניין כדי לחשב מחדש את העוצמה ערכים, במידת הצורך.
12. כדי לקבוע את באתרו K ב C2C12 תאים myoblast, בצע את הפרוטוקול כפי שמתואר בסעיף 4.2 ו סעיף 5 ו לשים 1 מ"ל של 0 mM Ca ^{2 +} חיץ של רינגר בחדר.
    1. Permeabilize התאים עם 0.002-0.005% saponin במאגר תאיים עבור 15-30 s לרוקן את התאים של כלCatcher ⁺ זה יכול להיות cytosol. לשטוף את התאים עם 3-6 מ"ל של 1 מ"ל EGTA במאגר KCl עם 10 מיקרומטר ionomycin. אפשר את עוצמת הירידה עד להגיע לרמה.
    2. לשטוף עם 3-6 מ"ל של חיץ KCl עם 10 מיקרומטר יונומיצין ולאפשר את העוצמה לייצב, ולאחר מכן להוסיף כל Ca ^{2 +} פתרון מפורט בשלב 2.7. אפשר את העוצמה להגיע לרמה בין כל תוספת.
13. כדי לכייל את החיישן עבור basal [Ca ^{2 +} ] כימות, בצע את שלב 6.12. השתמש EGTA ואת 100 מ"מ Ca ^{2 +} חיץ משלב 2.7 כדי לקבל את עוצמת הקרינה המינימלית והמקסימלית.

עיבוד נתונים

1. הורד את קובץ הגיליון האלקטרוני של נתוני מדידת העוצמה.
2. לנרמל את הנתונים עבור כל תא על עוצמת הבסיס (F / F ₀ ). מגרש את הנתונים המנורמלים לעומת הזמן בכל תוכנית גרפים.
3. כדי לחשב את השינוי%, לחסר את שיא השיא מנורמלUe מ 1 ו להכפיל ידי 100. לחשב את סטיית הממוצע ו סטנדרטי אם תאים מרובים היו צילמו.
4. כדי לחשב את יחס אות לרעש, SNR, לפתוח את קובץ התמונה שנשמר בניסוי בתוכנת עיבוד תמונה, כגון ImageJ, ולאחר מכן למדוד את האות, תאים transfected, רעש, רקע. חישוב SNR באמצעות המשוואה SNR = אות / רעש.
5. כדי לחשב את K באתרו _D מן הנתונים שנאספו הדמיה פלואורסצנטי, הממוצע נתוני עוצמת, המרכיבים את המישורים, לאחר תוספת של כל Ca ^{2 +} ריכוז EGTA (0 mM Ca ^{2 +} ). לחשב את הרוויה החלקית (בעוצמה יחסית) באמצעות θ = (F - F _דקות ) / (F _מקס - F _דקות ), כאשר θ היא עוצמת יחסית, F הוא הקרינה בכל נקודה, F _דקות היא עוצמת הקרינה המינימלית, ו F _{מקסימום} הוא עוצמת הקרינה המרבי, כדי לראות את השינוי בעוצמת tהוא לחקור עם תוספת של Ca ^{2 +} לעומת עוצמת המינימום. מגרש את נתוני האינטנסיביות היחסית כנגד [Ca ²⁺ ] בכל תוכנית התאמה של גרפים ועקומות. השתמש במשוואת הכריכה 1: 1 θ = [M _T ] / (K _d + [M _T ]) המתורגם לכל תוכנית התאמה של גרפים ועקומות כדי לחשב את K _d . M _T הוא ריכוז המתכת הכולל.
6. כדי לכמת את הסידן הבסיסי מהכיול המתואר ב -6.13, ממוצע נתוני האינטנסיביות, המהווים את המישורים, לאחר תוספת של 1 מ"מ EGTA (F _דקות ) ו -100 מ"מ Ca ^{2 +} (F _{מקסימום} ). השתמש במשוואה כיול [Ca ^{2 +} ] = K _ד ([F - F _דקות ) / (F _מקס - F)] כדי לחשב את הסידן הבסיסי.

Representative Results

סעיף זה ימחיש את התוצאות שהושגו בשיטות שתוארו קודם לכן באמצעות ה- GECI Catcher המיועד ל- ER / SR המיועד לזיהוי שינויים ב- ER / SR Ca ^{2 +} באמצעות מסלולים שונים בתיווך קולטן.

איור 1 ממחיש ER לרוקן דרך ריר מגורה עם 200 מיקרומטר 4 ס"מ. 4-cmc הוא אגוניסט של RyR. תוספת של התרופה גורם לירידה סידן ER כפי שנמדד על ידי ירידה בעוצמת הקרינה ⁺ Catcher. כפי שמסומן, הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר הדמיה ומדידה של קולטן בתיווך Ca ^{2 +} הארעיים באמצעות Catcher ⁺ המספק מידע על השינויים CA Ca ^{2 +} .

כפי שמתואר באיור 2 , תוספת של 15 מיקרומטר מחיר לרכישה, כדי לחסום באופן הפוך את המשאבה SERCA, מייצרת ירידה גדולה בעוצמת הקרינה היוצרת הרמה. כמו הפונקציה של המשאבה SERCA הוא עכבות, ER CA ^{2 +} ערוצי שחרור עדיין פעיל משחרר Ca ^{2 +} לתוך cytosol גורם עוצמת הקרינה לרדת. התאים להתאושש לאחר שטיפת מחיר לרכישה משם עם המאגר של רינגר המכיל 1.8 מ"מ Ca ^{2 +} ו 10 מ"מ גלוקוז. תוצאות אלה מאשרות את היכולת של Catcher ⁺ לפקח Ca ^{2 +} הארעיים ספציפיים המשאבה SERCA.

איור 3 מציג נתונים מייצג עבור ההפעלה העקיפה של ה- IP ₃ R עם 200 מיקרומטר ATP ב HEK293 תאים transfected עם Catcher ⁺ . ATP נקשר לקולטן P2Y, קולטן G- חלבון מצמידים, אשר מייצר IP ₃ המפעילה Ca ^{2 +} שחרור דרך ה- IP ₃ R. למרות השינויהוא קטן, תוספת של 200 מיקרומטר ATP מייצרת ירידה ניכרת עוצמת האות. שטיפת התאים עם המאגר של רינגר המכיל 1.8 מ"מ Ca ^{2 +} ו 10 מ"מ גלוקוז מאפשר ER כדי למלא את האות לחזור לקו הבסיס. תוצאות אלה מדגישות את היכולת של Catcher ⁺ לפקח על ה- IP ₃ R- בתיווך סידן שחרור באמצעות גירוי עקיף.

באיור 4 , Catcher ⁺ היה transfected לתוך תאים C2C12 myoblast כדי לקבוע את באתרו K _ד . הנתונים נאספו כפי שתואר בפרוטוקול. C2C12 תאים myoblast היו permeabilized עם saponin 0.005% עבור 15-30 s מכן שטף עם 1 מ"מ EGTA במאגר KCl המכיל 10 ionomycin מיקרומטר. ריכוז Ca ^{2 +} שונים הוכנו במאגר KCl המכיל 10 ionomycin מיקרומטר והוספו בצורה מדורגת. הנתונים מנורמל והותאם באמצעות 1: 1 לאגד- משוואה. הממוצע K _ד היה 3.1 ± 1.4 מ"מ עבור 7 תאים. זיקה חלשה של Catcher ⁺ מאפשר לה לחוש Ca ^{2 +} גבוה Ca ^{2 +} organelles כמו ER או SR. כדי לקבוע את הבסיס [Ca ^{2 +} ] ב SR, תאים C2C12 היו permeabilized עם saponin 0.005% עבור 15-30 s, שטף עם חיץ KCl, ולאחר מכן שטף עם 1 מ"מ EGTA במאגר KCl המכיל 10 מיקרומטר ionomycin להשיג F _דקות . לאחר שטיפת EGTA משם עם חיץ KCl מקסימום, F _{מקסימום} , של 100 מ"מ Ca ^{2 +} עם 10 מיקרומטר ionomycin נוסף. הבסיס Ca ^{2 +} חושב להיות 0.4 ± 0.2 מ"מ.

איור 1: גירוי של ריר באמצעות 4 ס"מ ב HEK293 תאים. ( א ) תיאור ההפעלה של ריר עם 4 ס"מ. ( B ) הקלטה בעוצמה של HEK293 תאיםTransfected עם Catcher ⁺ , מקומי ER, שטופלו 200 מיקרומטר 4 ס"מ. גירוי של ריר עם 4 ס"מ גורם לירידה בעוצמת הקרינה מנורמל באופן ישיר בקורלציה לירידה [Ca ^{2 +} ] _ER . N מתייחס למספר התאים שצולמו. ההפחתה הממוצעת של האות הייתה 12.0 ± 2.2%. נוכחות של 1.8 מ"מ Ca ^{2 +} במאגר של רינגר הקל על מילוי של ER משתקף התאוששות עוצמת הבסיס. תמונות הבלט להראות את התאים לפני ואחרי הטיפול עם 4 ס"מ. SNR חושב להיות 4.3 ± 0.8. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2: ירידה [CA ^{2 +} ] _ER באמצעות P SERCA הפיך pUmp מעכב CPA ב HEK293 תאים. ( א ) עיכוב משאבת SERCA על ידי רו"ח. ( B ) הדמיה חיה של תאים HEK293 transfected עם Catcher ⁺ , מקומי ER, שטופלו עם CPA 15 מיקרומטר. בגלל Ca ^{2 +} עדיין יכול לזרום דרך ה- IP ₃ R ו RR, חסימת המשאבה SERCA עם רו"ח גורם לירידה בעוצמת הקרינה מנורמל באופן ישיר בקורלציה לירידה [Ca ^{2 +} ] _ER . N מתייחס למספר התאים שצולמו. תמונות Inset הן HEK293 תאים transfected עם Catcher ⁺ לפני ואחרי הטיפול. הירידה הממוצעת של האות הייתה 21.0 ± 0.3%. נוכחות של 1.8 מ"מ Ca ^{2 +} במאגר של רינגר הקל על מילוי של ER משתקף התאוששות עוצמת הבסיס. SNR חושב להיות 5.5 ± 0.8. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר שלהדמות הזאת.

איור 3: ATP מקטין [Ca ^{2 +} ] _ER ב HEK293 תאים. ( א ) סכמטי של ההפעלה העקיפה של IP ₃ R עם ATP דרך P2YR קולטן purinergic. P2YR הוא GPCR שיוצר IP ₃ על ATP מחייב. ה- IP ₃ מפעיל את ה- IP ₃ R, מגרה את שחרור הסידן מהמכשיר. ( ב ) הדמיה בזמן אמת של תאים HEK293 transfected עם Catcher ⁺ , מקומי ER, שטופלו עם 200 מיקרומטר ATP. גירוי עקיף של ה- IP ₃ R דרך קולטן P2Y עם ATP גורם לירידה בעוצמת הקרינה מנורמל כי בקורלציה ישירה לירידה [CA ^{2 +} ] _ER . N מתייחס למספר התאים שצולמו. הירידה הממוצעת האות היה 6.0 ± 3.0%. SNR היה cAlculated להיות 6.7 ± 2.7. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4: במקום K K של Catcher ⁺ ב C2C12 תאים myoblast. עקבות נציג עבור עוצמת מנורמל שנאספו מ permeabilized C2C12 תאים myoblast transfected עם Catcher ⁺ . תאים היו permeabilized עם 0.005% saponin במאגר תאיים עבור 15-30 s. EGTA ו Ca ^{2 +} פתרונות הוכנו חיץ KCl, N מתייחס למספר תאים צילמו. ( א ) תמונות פלואורסצנט הבלעה הם נציג של תאים לפני ואחרי הטיפול. 0.3, 0.6, 2, 5, 10, 20, 50, ו 100 מ"מ Ca ^{2 +} נוספה לתאים my2l12 permeabilized permeabilized בנוכחות 10 מיקרומטרIonomycin כדי לקבל K _ד של 3.1 ± 1.4 מ"מ. ( ב ) תמונות פלואורסצנט הבלעה מייצגים תאים בערכים מינימום ומקסימום, לאחר תוספת של 1 מ"מ EGTA ו 100 מ"מ Ca ^{2 +} עם 10 מיקרומטר ionomycin כל, בהתאמה. הבסיס Ca ^{2 +} חושב להיות 0.4 ± 0.2 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

חי בודד תא הדמיה של בדיקות ניאון, כגון Catcher ⁺ , היא טכניקה יעילה לנתח מסובך ER / SR Ca ^{2 +} תהליכי איתות בכל תא בתגובה אגוניסטים קולטן או אנטגוניסטים. טכניקה זו שימושית גם עבור הדמיה תוך שימוש באורכי גל מרובים בו זמנית, כגון הצורך Fura-2 או תמונה Catcher ⁺ ו Rhod-2 יחד כדי לפקח הן ER ושינויים סידן cytosolic, בהתאמה. ישנם מספר צעדים קריטיים בפרוטוקול זה; Transfection תא יכול להיות בעל השפעה רבה על הכדאיות של הדמיה. שיעורים נמוכים transfection יכול לגרום ביטוי מספיק של GECI לניטור תגובות סידן. מצד שני, overexpression של Catcher ⁺ לא תהיה השפעה אגירה על ER / ER Ca ^{2 +} , בעיה הקשורים צבעים סידן סינתטי. Buffering ההשפעות של Ca ^{2 +} בדיקות מושפעים [Ca ^{2 +} ] באורגנל, K _ד של pחלוק וריכוז החללית הנדרשת למדידה. Cytosolic [Ca ^{2 +} ] הוא בדרך כלל בטווח nanomolar נמוך, עם זאת, הריכוז בדיקה נדרש הוא בטווח דומה. במקרה זה, כמות ריכוז צבע ויכולתה במאגר סידן cytosolic היה, והוא, הדאגה העיקרית עבור הדמיה הסלולר. לעומת זאת, ER / SR [Ca ^{2 +} ] הוא ב 100s של micromolar ל millimolar טווח ³¹ כפי שקבענו עבור שורות תאים יונקים שונים ²⁵ . מאז 0.1-1 ביטוי מיקרומטר של Catcher ⁺ מספיק כדי לאפשר זיהוי של סידן ER, אפקט חציצה של Catcher הוא זניח. לפיכך, Catcher ⁺ יכול לפקח Ca ^{2 +} השטף בסביבות [Ca ^{2 +} ] גבוהה ללא כל אפקט חציצה על לומינל ER / SR Ca ^{2 + 32} .

מספר גורמים יכולים להשפיע על יעילות transfection של GECI כגון זמן הדגירה, thE מגיב transfection, טמפרטורת הדגירה, ואת confluency התא. התא confluency, כאשר זריעת התאים בשקופית, יכול להשפיע באופן משמעותי על איכות הדמיה. Low confluency יכול לגרום למספר נמוך של תאים (n) ופחות דיוק סטטיסטי, בעוד רמות גבוהות של confluency להוביל שכבות חופפות של תאים המייצרים משתנים גדולים הדמיה. הזמן והטמפרטורה עבור transfection צריך להיות מותאם בהתאם לסוג התא. בנוסף, הוספת DMEM עם התקשורת בסרום מופחתת היא אופטימלית עבור transfection פעמים ארוכות יותר כדי למנוע אפופטוזיס. GECI המקורי Catcher הקרינה בתאי יונקים, כאשר תרבותי transfected, היה רק ​​30 מעלות צלזיוס. הקרינה של Catcher היה אופטימיזציה אופטימיזציה משופרת עבור ביטוי ב 37 מעלות צלזיוס וכתוצאה מכך החדש, משופרת גרסה Catcher ⁺ . כתם המערבי באמצעות נוגדן נגד EGFP ניתן לבצע כדי לאשר את הביטוי של Ca ^{2 +} בדיקה.

יתר על כן, אניThod ועקביות של משלוח מגיב הוא קריטי. ריאגנטים ניתן להוסיף לחדר על ידי זלוף, דיפוזיה נפח קטן, או על ידי משאבות מכניות, כל אשר יכול להפיק תגובות שונות. זה הכרחי כי החדר הפתרון הוא חתום כראוי על ידי החלת שכבת איטום על החלק התחתון של החדר כי ימוקמו על השקופית. יש לבחור את אורך הגל הנכון עבור החללית. אורכי גירוי ופליטה עבור Catcher ⁺ הם 395/488 ננומטר ו 510 ננומטר, בהתאמה. עבור הדמיה תא, רק 488 ננומטר משמש עירור, כדי למנוע את ההשפעה המזיקה של אור UV על תאים. לכן, באמצעות כל מסננים אופטיים אשר לרגש ב 488 ננומטר ולאסוף את הפליטה ב 510 ננומטר יהיה מקובל להשתמש בתמונה עם Catcher ⁺ . כדי למנוע photobleaching, המאמצים עשוי להיות ממוקד כדי לייעל את עוצמת האור ואת החשיפה לאור כגון מסגרות / ³³ .

בעוד פרוטוקול זה אידיאלי לנתח את effEct של ER / SR שינויים באמצעות Catcher ₊ Ca ^{2 +} ER / SR פלואורסצנטי בדיקה, יש מגבלות כצפוי בכל ניסוי. מאחר שתא בודד של דימות חי בודק רק מסגרת קטנה של תאים, מספר התאים (n) יכול לנוע בין 1 ל -100 תאים בממוצע, אך יכול להיות נמוך יותר עבור שורות תאים גדולות יותר. זה מוביל מספרי תאים נמוכים ותוצאות מגוונות סטטיסטית ללא ניסויים מרובים. נדרש n> 6 לדיוק סטטיסטי. כדי לקבל n גדול, מנות רבות חייב להיות צילמו או טכניקות אחרות יש להשתמש, במקביל. בנוסף, Catcher ⁺ הוא אורך גל יחיד ER / SR Ca ^{2 +} בדיקה, זה מוביל לנושאים אחרים של בדיקות אורך גל יחיד וצבעים עם לא להיות מסוגל לכמת את האות, לא לדעת אם האות נכון לעומת הפרעה של תאים חפץ, ורעש גדול בהשוואה למערכות ratiometric ³⁴ .

עבודה זו מראה כי אלה אופטימיזציה Ca ^{2 +} בדיקות יכוללהיות מיושם סוגי תאים שונים או סוגי רקמות לפקח קולטן בתיווך ER / SR Ca ^{2 +} שחרור. Catcher ⁺ הוא אורך גל יחיד ER / SR Ca ^{2 +} בדיקה. לכן, חשוב כי הפרמטרים הניסוי והגדרות עקביים למדידה כמותית. כיול מפורט של ריכוז סידן K _ד של חיישן סידן בקווים התא הם מדידות חשובות נוספות לניתוח כמותי.

אלה חיישנים סידן פיתח יכול גם להיות ממוקד למיקומים ספציפיים בתוך ER / SR כדי לפקח על שונה מאוד Ca ^{2 +} ארעיים הקיימים לעומת העולמי Ca ^{2 +} שינויים בתנאים ביולוגיים ופתולוגיים שונים. ממצאים אלה ימשיכו לדחוף את השדות של Ca ^{2 +} הדמיה ועיצוב בדיקה קדימה כדי לספק כלים עתידיים לאבחון Ca ^{2 +} הקשורות מחלות. הפרוטוקולים המדווחים והחיישן המפותח יכולים גם להיות מותאמים לתרופה dIscoveries נגד מחלות הקשורות עם סידן איתות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-Chloro-3-methylphenol (4-CmC)	Sigma-Aldrich	C55402
515DCXR dichroic mirror	Chroma Technology Corp.	NC338059
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	A26209
Calcium chloride dihydrate	EMD Millipore	102382
Corning tissue-culture treated culture dishes (100 mm)	Sigma-Aldrich	CLS430167
Corning tissue-culture treated culture dishes (60 mm)	Sigma-Aldrich	CLS430166
Cyclopiazonic Acid (CPA)	EMD Millipore	239805
D(+)-Glucose	ACROS Organics	41095-0010
Dow Corning 111 Valve Lubricant & Sealant	Warner Instruments	64-0275
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D7777
Ethylenebis(oxyethylenenitrilo) tetraacetic Acid (EGTA)	ACROS Organics	409911000
Fetal Bovine Serum (FBS)	ThermoFisher	26140087
Fisherbrand Cover Glasses 22x40 mm	Fisher Scientific	12-544B
Hanks’ Balanced Salts (HBSS)	Sigma-Aldrich	H4891
HEPES, Free Acid, Molecular Biology Grade	EMD Millipore	391340
Immersion Oil without autofluorescence	Leica	11513859
Ionomycin, Free Acid	Fisher Scientific	50-230-5804
Leica DM6100B inverted microscope with a cooled EM-CCD camera	Hamamatsu	C9100-13
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	ThermoFisher	11668019
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	ThermoFisher	L3000015
Low Profile Open Diamond Bath Imaging Chamber	Warner Instruments	RC-26GLP
Magnesium Chloride Hexahydrate	Fisher Scientific	M33-500
Opti-MEM	ThermoFisher	51985034
Potassium Chloride	EMD Millipore	PX1405
Potassium Phosphate, Dibasic	EMD Millipore	PX1570
Potassium Phosphate, Monobasic	EMD Millipore	PX1565
Saponin	Sigma-Aldrich	47036
SimplePCI Image Analysis Software	Hamamatsu	N/A
Sodium Bicarbonate	Fisher Scientific	S233-3
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S271-500
Sterivex-GV 0.22 µm filter	EMD Millipore	SVGVB1010
Till Polychrome V Xenon lamp	Till Photonics	N/A
Trypsin (2.5%), no phenol red (10x)	ThermoFisher	15090046