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Biology

लक्षित सीए के साथ ईआर / एसआर कैल्शियम रिलीज की निगरानी Published: May 19, 2017 doi: 10.3791/55822
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Chemistry, Center of Diagnostics and Therapeutics (CDT), Georgia State University

Summary

हम एचआईके 2 9 3 के एंडोप्लाज्मिक / सैर्कोप्लास्मिक रेटिकुलम (ईआर / एसआर) और वास्तविक समय प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर कंकाल की मांसपेशियों C2C12 कोशिकाओं में तेजी से कैल्शियम यात्रियों की निगरानी के लिए हमारे लक्षित आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम सूचक (जीईसीआई) कैचर + के आवेदन के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। स्वस्थानी के डी माप और अंशांकन के लिए एक प्रोटोकॉल भी चर्चा की गई है।

Abstract

बाहरी उत्तेजनाओं द्वारा विकसित इंट्रासेल्युलर कैल्शियम (सीए 2 + ) ट्रांसइंटर्स जीवित जीवों में जैविक प्रक्रियाओं की एक बहुत कुछ शुरू करते हैं। इंट्रासेल्युलर कैल्शियम रिलीज के केंद्र में प्रमुख इंट्रासेल्युलर कैल्शियम स्टोरेज ऑर्गेनेल, एन्डोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) और मांसपेशियों की कोशिकाओं में अधिक विशिष्ट सैर्कोप्लास्मिक रेटिकुलम (एसआर) हैं। इन ऑर्गेनेलों से कैल्शियम की गतिशील रिलीज़ रेनोोडीन रिसेप्टर (आरआईआर) और इनोसिटोल 1,4,5-त्रिफॉस्फेट रिसेप्टर (आईपी 3 आर) द्वारा सरको / एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम कैल्शियम एटपीस (एसईआरसीए) पंप के माध्यम से होने वाली फिर से भरने के साथ मध्यस्थ है। कैटरियल नामक एक आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम सेंसर (जीईसीआई) को ईआर / एसआर से कैल्शियम की तीव्र रिहाई पर नजर रखने के लिए बनाया गया था। यहां, एचईके 2 9 3 और सी 2 सी -212 कोशिकाओं में सुधार, ईआर / एसआर-लक्षित जीईसीआई कैचर + के अभिकर्मक और अभिव्यक्ति के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल और आईपी 3 आर, राइआर, और एसईआरसीए की निगरानी में इसके आवेदन पंप-मध्यस्थता कैल्शियम क्षणिकHEK293 में प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कोशिकाओं में रेखांकित किया गया है। रिसेप्टर एजिओनिस्ट या पसंद का अवरोधक चेंबर समाधान में छितरा हुआ है और वास्तविक समय में तीव्रता परिवर्तन दर्ज किए जाते हैं। इस पद्धति के साथ, ईआर कैल्शियम में कमी 4-क्लोरो-एम-क्रोसोल (4-सीसीसी), एडीनोसिन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) के साथ आईपी 3 आर के अप्रत्यक्ष सक्रियण, और साइक्लोपियाज़ोनिक के साथ सेरका पंप के निषेध के साथ RyR सक्रियण के साथ देखा जाता है एसिड (सीपीए) हम सी 2 के 2 बी 12 कोशिकाओं में सीटू के डी और क्वांटिंग बेसल [सीए 2 + ] को निर्धारित करने के लिए प्रोटोकॉल पर भी चर्चा करते हैं। संक्षेप में, इन प्रोटोकॉल, कैचर + के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जाता है, ईआर / एसआर कैल्शियम से संबंधित रोगों के अध्ययन में भावी आवेदन के साथ ईएस से रिसेप्टर मध्यस्थता कैल्शियम रिलीज प्राप्त कर सकता है।

Introduction

इंटरासेल्युलर कैल्शियम (सीए 2 + ) ट्रांसएक्टर्स के स्पेसिओ-अस्थायी विशेषताओं में कई जैविक कार्यों को सक्रिय किया जाता है 1 इन सीए 2+ सिग्नलिंग इवेंट अलग सीम 2 + स्टोरेज ऑनेगल द्वारा अलग-अलग उत्तेजनाओं के माध्यम से और इंट्रासेल्युलर नियंत्रित करके कई सीए 2 + पंपों, चैनलों और सीए 2 + बाध्यकारी प्रोटीन के माध्यम से पेश किए जाते हैं। सीए 2+ ट्रांसिल्वेनस सिग्नल मॉड्यूलेशन के साथ दोषों के परिणामस्वरूप महत्वपूर्ण रूप से परिवर्तित किया जा सकता है, जो विभिन्न रोगों के लिए अग्रणी है। सीए 2+ सिग्नलिंग सिस्टम की गति और जटिलता के कारण, केंद्र में एन्डो- (एआर) और सर्पोप्लाज्मिक रेटिकुलम (एसआर) के साथ, आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड सीए 2+ जांच जो कि गतिशील अभिव्यक्ति के लिए अनुकूलित किया गया है, उन्हें तेजी से कैनेटीक्स के साथ अनुकूलित किया गया है विभिन्न कोशिकाओं में ग्लोबल और स्थानीय सीए 2 + परिवर्तनों को देखने के लिए

ईआर और एसआर, मांसपेशियों की कोशिकाओं में इसके समकक्ष, प्रमुख इंट्रासेल्युलर सीए 2+ स्टोरेज ऑर्गेनेल हैं और सीए 2 + सिंक के रूप में कार्य करते हैं जो सीए 2+ संकेत 4 को बढ़ाने में मदद करते हैं। ईआर / एसआर सीए 2+ में एक अभिन्न अंग है, जो एक ट्रांसमीटर और 5 सिग्नल के रिसीवर के रूप में दोहरी भूमिकाओं के साथ सिग्नल है। रायनोडाइन रिसेप्टर (आरआईआर) और इनॉसिटॉल 1,4,5-त्रिफॉस्फेट रिसेप्टर (आईपी 3 आर) सीए 2 + 6 द्वारा विनियमित ईआर / एसआर की झिल्ली पर स्थित सीए 2+ रिलीज रिसेप्टर्स हैं। अन्य एजेंट प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष रूप से इन रिसेप्टर्स के कार्य को उत्तेजित करते हैं। 4-क्लोरो-एम-क्रोसोल (4 सीसीसी) आरआरआर का एक शक्तिशाली एगोनिस्ट है, जिसमें एसआर सीए 2+ रिहाई के लिए कैफीन की तुलना में 10 गुना अधिक संवेदनशीलता होती है, जहां दोनों नियमित रूप से RyR- मध्यस्थता वाले सीए 2 ++ में पढ़ने के लिए नियोजित होते हैं स्वस्थ और रोगग्रस्त कोशिकाओं 7 एटीपी आईपी 3- वांछित सीए 2 + पुनः बढ़ाता हैआईपी 3 आर 8 के माध्यम से लीज एटीपी purinergic रिसेप्टर P2YR, एक जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर (जीपीसीआर) से जुड़ा है, आईआर 3, जो ईआर 9 , 10 से सीए 2+ को रिलीज करने के लिए आईपी 3 आर के लिए बाइंड करता है, का उत्पादन ट्रिगर करता है। सर्को एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम कैल्शियम एटपेज (एसईआरसीए) पंप एक पी-प्रकार एटपेश पंप है, जो ईआर / एसआर झिल्ली पर भी स्थित है जो साइटोसोल सीए 2 + को कम करता है और एआर / एसआर द्वारा ईआर / एसआर लुमेन 11 एसईआरसीए पंप के विशिष्ट अवरोधकों में थापसियागर्नाका, थापसिगैरगिन और एस्परगिलस और पेनिसीलियम से साइक्लोपियाज़ोनिक एसिड (सीपीए) शामिल हैं । सीपीए को पंप के लिए कम आत्मीयता है और सीए 2 + एक्सेस प्वाइंट 12 को उल्टे तौर पर अवरुद्ध करता है थापसिगैरगिन, दूसरी तरफ, एम 3 हेलिक्स में नैनोमोल के साथ अवशेष F256 पर सीए 2 + फ्री पंप को अपरिवर्तनीय रूप से बांधता हैएआर एफ़िनिटी 11 सीए 2+ प्रेरित घटनाओं में शामिल परिवर्तनों का विश्लेषण और मात्रा बढ़ा है और एक चुनौती बनी हुई है। चूंकि ईआर / एसआर सीए 2 + सिग्नल के प्रसार में एक केंद्रीय समारोह के साथ डिब्बे वाला प्रमुख सबसेल्युलर सीए 2+ है , बहुत काम ईआर / एसआर सीए 2+ सिग्नलिंग 5 को समझने पर केंद्रित है।

सिंथेटिक Ca 2+ रंजियों के निर्माण ने सीए 2 + इमेजिंग के क्षेत्र और प्रथा को आगे बढ़ाने में मदद की। यद्यपि मैग-फुरा -2 जैसे रंगों का इस्तेमाल विभिन्न कोशिकाओं, 13 , 14 , 15 में compartmentalized Ca 2+ को मापने के लिए व्यापक रूप से किया गया है , जैसे कि असमान डाई लोडिंग, फोटोबलीचिंग और विशिष्ट ऑर्गनल्स को लक्षित करने की अक्षमता । हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) की खोज और फ्लोरोसेंट प्रोटीन की प्रगति -आधारित सीए 2+ जांच ने सीए 2 + इमेजिंग फॉरवर्ड 16 के फील्ड को आगे बढ़ाया है। कुछ मौजूदा जीईसीआई फोर्स्टर अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (एफआरईटी) जोड़े हैं जिनमें पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (वाईएफपी), सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन (सीएफपी), कंडोडाडुलिन और एम 133 बाइंडिंग पेप्टाइड 17 , 18 शामिल हैं । ट्रॉपिनिन सी-आधारित जीईसीआई सीएफपी और सिट्रिन के एफईआरईटी जोड़े के रूप में उपलब्ध हैं और 1 9 , 20 , 21 के एकल फ्लोराफोरे जांच के रूप में उपलब्ध हैं। दूसरों, जैसे कि जीसीएएमपी 2 और आर-जीईको एकल फ्लोरोफोरे सेंसर हैं जिसमें शीतोडुलिन 22 , 23 शामिल हैं । क्यू डी के संकीर्ण ट्यूनिंग की सीमाओं को दूर करने के लिए और सीए 2 + बाइंडिंग डोमेन में मिली कई सीए 2 + बाइंडिंग साइट से जुड़ी सहकारी बंधन 24 , कैल्शियम सेन का एक उपन्यास वर्गसॉर्स को सीए 2 + बाइंडिंग साइट को बीटा बैरल की सतह पर बढ़ाया हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ईजीएफपी) 25 , 26 के क्रोमोफोर संवेदनशील स्थान में डिजाइन करके बनाया गया था। कैचियर नामक यह बेहद चिंतित संवेदक के पास प्रसार सीमा के निकट 0.18 मिमी, ए के एक कश्मीर डी है और 700 एस -1 के एके बंद है सीलायर का उपयोग विभिन्न स्तनधारी सेल लाइनों जैसे हेला, एचईके 2 9 3, और सी 2 सी बी 2 25 में रिसेप्टर-मध्यस्थता ईआर / एसआर कैल्शियम रिलीज की निगरानी के लिए किया गया है। अपने तेज कैनेटीक्स की वजह से, कैचियर का प्रयोग युवा और पुराने मित्र वायरस बी एनआईएच जैक्सन (एफवीबी) चूहों के फ्लेक्स डेंटेरोरम ब्रेविस (एफडीबी) मांसपेशियों के तंतुओं में किया गया था, जो यह पता लगाने के लिए कि सीए 2 + 2 एफडीबी में वी 2 युवा चूहों की तुलना में पुराने चूहों के फाइबर 27 37 डिग्री सेल्सियस पर अपने कम प्रतिदीप्ति को दूर करने के लिए, जो स्तनधारी के कैल्शियम इमेजिंग में अपने अनुप्रयोगों को बाधित करता हैकोशिकाओं, हमने कैचर का एक बेहतर संस्करण कैचर नामक + विकसित किया है कैचर + स्तनधारी कोशिकाओं में बेहतर आवेदन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ाया प्रतिदीप्ति दर्शाता है। Catcher + बनाने के लिए थर्मोस्टाबिलिटी और प्रतिदीप्ति 37 डिग्री सेल्सियस 28 , 2 9 पर सुधार करने के लिए अतिरिक्त म्यूटेशन को कैचर में शामिल किया गया था। कैचर + कैचियर 30 पर शोर अनुपात (एसएनआर) के संकेत में छः गुना वृद्धि दिखाती है

यहाँ, संस्कृति और एचईके 2 9 3 और C2C12 कोशिकाओं के संचय के लिए प्रोटोकॉल और सीएआरएआर + और ईआर / एसआर रिसेप्टर-मध्यस्थता वाले कैल्शियम यात्रियों की निगरानी के लिए इसके आवेदन प्रस्तुत किए जाते हैं। प्रतिनिधि परिणाम 4-सीसीसी, सीपीए और एटीपी के साथ इलाज वाले HEK293 कोशिकाओं में व्यक्त कैचर + के लिए दिखाए गए हैं। हम C2C12 myoblast कोशिकाओं और योग्यता में Catcher + के सीटू के डी को निर्धारित करने के लिए एक प्रोटोकॉल भी प्रदान करते हैंबेसल के एनटीफिकेशन [सीए 2 + ]

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Protocol

1. स्लाइड तैयार करना

  1. 6 सेमी सेल संस्कृति व्यंजन में 22 मिमी x 40 मिमी कांच खुर्दबीन स्लाइस रखें, प्रति डिश 1 स्लाइड।
  2. प्रत्येक स्लाइड के प्रत्येक पक्ष के साथ-साथ पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश के लिए 6 सेमी डिश को एक बाँझ हुड में बाँझ डालने के लिए 15-20 मिनट का पर्दाफाश करें।
  3. पाराफिल्म के अंदर स्लाइड्स के साथ व्यंजन को कवर करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें जब तक उपयोग के लिए तैयार न हो।

2. मीडिया, बफर, समाधान, और अभिकर्मकों की तैयारी

  1. विखंडित पानी में 1 एल हांक के संतुलित नमक समाधान (एचबीएसएस) तैयार करें और 10 मिमी एचईपीईएस, 5 एमएम नाहोको 3 और 1 एमएम ईजीटीए जोड़ें। NaOH के साथ पीएच 7.2-7.3 के साथ समायोजित करें एक ऑटोक्लाइवेट बोतल में 0.22 माइक्रूटर फिल्टर के साथ फिल्टर बफर।
  2. डीओनेनाइज्ड पानी में उच्च ग्लूकोज़ डल्बेकेडो के संशोधित ईगल के मध्यम (डीएमईएम) एच के 900 एमएल तैयार करें। 44 एमएम नाहोको 3 जोड़ें और एचएचएल के साथ पीएच को 7.2-7.3 में समायोजित करें। एक आटोक्लेव की बोतल में 0.22 माइक्रोन फिल्टर के साथ मीडिया को फ़िल्टर करें। 100 एमएल का भ्रूण बोवी जोड़ेंएफबीएस एकाग्रता 10% करने के लिए मीडिया में नेत्र सीरम (एफबीएस) 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें
  3. डीओनाइज्ड पानी में 1 एल इंट्रासेल्युलर बफर (125 मिमी केएलएल, 25 मिमी NaCl, 10 मिमी HEPES, 0.2 मिमी CaCl 2 , 0.5 मिमी ईजीटीए, 0.2 मिमी एमजीसीएल 2 ) तैयार करें और पीएच को 7.25 में समायोजित करें। अंतिम [सीए 2 + ] 100 एनएम होगा। उपयोग करने से पहले, 0.5 एमएम एटीपी जोड़ें। कमरे के तापमान पर रखो।
  4. 1 एल रिंगर बफर (121 मिमी NaCl, 2.4 मिमी कश्मीर 2 एचपीओ 4 , 0.4 मिमी केएच 2 पीओ 4 , 10 मिमी एचईपीईएस, और 1.2 मिमी एमजीसीएल 2 ) विआयनीकृत पानी में तैयार करें और पीएच को 7.2 में समायोजित करें। कमरे के तापमान पर रखो। 50 एमएल ट्यूब में 50 एमएल का उपयोग करने के लिए, 1.8 एमएम सीए 2 + और 10 एमएम ग्लूकोज जोड़ें।
  5. डीओनाइज्ड पानी में 1 एल के KCl कुल्ला समाधान (125 मिमी केएलएल, 25 मिमी NaCl, 10 मिमी HEPES, 0.2 मिमी एमजीसीएल 2 ) तैयार करें और पीएच को 7.25 में समायोजित करें।
  6. 1 एमएल डायमिथाइल सल्फ़ॉक्साइड (डीएमएसओ) में 5 मिलीग्राम ionomycin भंग। सूक्ष्म कणों में 30 μL की विभाज्य और -20 में स्टोर6; सी।
  7. डीएमएसओ में सीपीए को भंग करके साइक्लोपियाज़ोनिक एसिड (सीपीए) स्टॉक तैयार करें एपोपटोसिस को रोकने के लिए सीएपी के लिए डीएमएसओ का अंतिम प्रतिशत 1% है। फ़िल्टर किए गए एच 2 हे में भंग करके और इसे 37 डिग्री सेल्सियस पर मिलाते हुए रातोंरात भंग करने से 20 मिमी 4-क्लोरो-एम-क्रोसोल (4-सीएमसी) तैयार करें। फ़िल्टर किए गए एच 2 ओ से 100 मिमी में भंग करके एटीपी स्टॉक तैयार करें।
  8. सीटू के डी में निर्धारित करने के लिए, 1 एमएम ईजीटीए, 0.2 एमएम, 0.6 एमएम, 2 एमएम, 5 एमएम, 10 एमएम, 20 एमएम, 50 एमएम, और 100 एमएम सीए 2+ के प्रत्येक 15 मिलीलीटर तैयार करें। डीएमआई ईजीटीए स्टॉक और 1 एम CaCl 2 शेयर विआयनीकृत पानी में भंग।

3. सेल संस्कृति

  1. एक सीडी यूवी हुड में 10 सेमी सेल संस्कृति व्यंजनों का उपयोग करने के लिए एटीसीसी प्रोटोकॉल के अनुसार संस्कृति C2C12 myoblast और HEK293 कोशिकाओं।
    नोट: C2C12 कोशिकाओं को ~ 70% संगम से अधिक विकसित करने की अनुमति नहीं दी जानी चाहिए क्योंकि मैयॉब्लास्ट अलग होने लगेंगे।मैट्यूब्यूस में दोनों HEK293 और C2C12 कोशिकाओं को आसानी से बढ़ता है और सेल अखंडता को बनाए रखने के लिए पिछले 100% सामंजस्य को विकसित करने की अनुमति नहीं दी जानी चाहिए। इसके अतिरिक्त, सेल स्वास्थ्य को संरक्षित करने के लिए किसी प्रयोग के उपयोग से पहले 10 बार से अधिक कोशिकाओं को नहीं निकाला जाना चाहिए।

4. HEK293 कोशिकाओं के अभिकर्मक

  1. 6 सेमी व्यंजन में निष्फल 22 मिमी x 40 मिमी कांच खुर्दबीन स्लाइड पर बीज HEK293 कोशिकाओं ताकि वे अभिकर्मक के दिन ~ 70% मिला हुआ हो।
  2. अगले दिन, सीकर -2 सीडीएनए और 1: 3 (वजन / मात्रा) डीएनए: कम सीरम मीडिया में अभिकर्मक अभिकर्मक अनुपात ( जैसे ऑप्टी-एमईएम) का उपयोग कर ट्रांसफ़ेक्ट सेल के अभिकर्मक अभिकर्मक के लिए निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करें।
  3. डिश से डीएमईएम मीडिया को खाली करें, और 3 एमएल कम सीरम मीडिया जोड़ें। डीएनए जोड़ें: अभिकर्मक अभिकर्मक मिश्रण को डिश और 37 से 4-6 घंटे के लिए सेते डिग्री सेल्सियस
  4. ऊष्मायन के बाद, एचबीएसएस के 5-6 एमएल के साथ कोशिकाओं को धो लें। एचबीएसएस एफ छोड़ेंडिश ROM और ताजा डीएमईएम के 3 एमएल के साथ प्रतिस्थापित करें और उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए जीईसीआई की अभिव्यक्ति की अनुमति देने के लिए ले लें।
  5. C2C12 myoblast कोशिकाओं के अभिकर्मक
    1. सी 2 सी 12 12 माइॉब्लास्ट कोशिकाओं के लिए, डिश (1-2 एमएल) के नीचे कवर करने के लिए पर्याप्त ट्रिप्सिन जोड़कर कोशिकाओं का परीक्षण करें। डिश के नीचे से कोशिकाओं को ढीला करने के लिए ट्रिप्सिन को 2-6 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें।
    2. ऊष्मायन पूरा हो जाने के बाद, trypsin को हटा दें और डीएमईएम के 8 एमएल में कोशिकाओं को महाप्राणण करें। डीएमईएम के साथ कोशिकाओं को अच्छी तरह से पिपेट करने के लिए समान रूप से ते कोशिकाओं को फैलाने और फिर से निलंबित करना और उन्हें 6 सेमी सेल संस्कृति डिश में बाँझ कंडोम पर डिएमएम का 3 एमएल युक्त बीज बांटना ताकि अंतिम संगम 60% हो।
    3. वही दिन कोशिकाओं को संक्रमित करें जैसा कि चरण 4.2-4.3 में उल्लिखित है। 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए सेते
    4. चरण 4.4 को दोहराएं।

5. स्लाइड और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप की तैयारी

  1. मी चालू करेंआईक्स्कोस्कोप और प्रकाश स्रोत, फिर साधारण PCI प्रोग्राम खोलें। माइक्रोस्कोप को 15-20 मिनट या चार्ज-युग्मित डिवाइस (सीसीडी) कैमरा -65 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा होने तक गर्म होने दें। चैम्बर तैयार करें और प्रतीक्षा करते समय कोशिकाओं के साथ स्लाइड करें।
  2. एक कपास झाड़ू का उपयोग करते हुए सीलेंट की पतली परत के साथ कम प्रोफ़ाइल ओपन हीरा स्नान इमेजिंग चैम्बर के नीचे कवर करें।
  3. इनक्यूबेटर के बाहर ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं वाली स्लाइड को ले जाएं और धीरे-धीरे 1 एमएल की घंटी के साथ 10 एमएम ग्लूकोज और 1.8 एमएम सीए 2 + 37 डिग्री सेल्सियस के साथ प्रीफिट के साथ तीन बार कुल्ला।
  4. डिश में रिंगर के बफर के 1 एमएल छोड़ दें, कोशिकाओं को सूखने से रोकने के लिए, और डिश के बाहर स्लाइड लेने के लिए संदंश का उपयोग करें। प्रयोगशाला के ऊतकों को स्लाइड के किनारे को छूकर प्रयोगशाला के ऊतकों पर अवशोषित करने के लिए अधिक समाधान दें। फिर कक्ष के किनारे पर रखें जिसमें स्क्वेड्रियर का उपयोग करके स्टेज माउंट पर तेल और सुरक्षित कक्ष की ओर का सामना करने वाले कोशिकाओं के साथ ग्रीस युक्त होता है।
  5. 1 जोड़ेंरिंगर के बफर के एमएल के लिए कक्ष में सुखाने से कोशिकाओं को रोकने के लिए मंच पर कक्ष बढ़ते हुए और बाकी माइक्रोस्कोप सेटअप को पूरा करना। वैक्यूम चूषण नली चैम्बर से जुड़ा हुआ है, एक बार चैम्बर धारण अंतिम मात्रा ~ 450 μL है।
  6. 40X तेल विसर्जन उद्देश्य को माइक्रोस्कोप उद्देश्य स्विच करें।
  7. उद्देश्य को साफ और सूखने के लिए लेंस पेपर और लेंस सफाई समाधान का उपयोग करें। उद्देश्य रगड़ना मत जब तक सतह साफ न हो जाए
  8. उद्देश्य के लिए विसर्जन तेल की एक बूंद जोड़ें
  9. माउंट को माइक्रोस्कोप स्टेज पर रखें और वैक्यूम टिप को चैंबर में जोड़ें। वैक्यूम चूषण नली चैम्बर से जुड़ा हुआ है और चालू हो जाने पर, चैम्बर धारण की अंतिम मात्रा ~ 450 μL है। यह अंतिम मात्रा कक्ष के पक्ष के साथ स्तर है। ओवरफिलिंग के कारण उद्देश्य में फैलाव से समाधान को रोकने के लिए, प्रयोग के दौरान, कक्ष के समाधान के लिए स्तर होना आवश्यक है।
  10. उज्ज्वल क्षेत्र मोड का उपयोग करके, कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित करने के लिए लाभ को 175 और एक्सपोजर का समय 0.03 s पर समायोजित करें।
  11. एक बार कोशिकाएं केंद्रित होती हैं, 488 एनएम उत्तेजना का उपयोग करके प्रतिदीप्ति मोड पर स्विच करें। एक्सपोज़र टाइम को 0.07 एस में बदलें दृश्य के एक क्षेत्र का पता लगाएं जिसमें पर्याप्त कोशिकाएं हैं जो छवि को पर्याप्त प्रतिदीप्ति के साथ स्वस्थ हैं।
  12. एक बार देखने का क्षेत्र चुना गया है, प्रतिदीप्ति और उज्ज्वल क्षेत्र मोड में चित्र लें।
  13. चुने हुए क्षेत्र से तीव्रता को रिकॉर्ड करने के लिए कोशिकाओं में ब्याज क्षेत्र (आरओआई) का मंडल करें या पूरे सेल को सर्कल करें।

6. इमेजिंग ड्रग प्रेरित सीए 2+ ट्रांसइन्टेन्ट्स और सीटू के डी कैलिब्रेशन में

  1. प्रत्येक 5 एस पर सेट फ्रेम दर के साथ तीव्रता माप प्रारंभ करें
  2. 20-30 फ्रेम (100-150 एस) के लिए स्थिर करने के लिए आधार रेखा की तीव्रता की अनुमति दें यदि आवश्यक हो, तो fr को कम करेंफोटोबलीचिंग को रोकने के लिए इस चरण के दौरान एम्स / एस।
  3. 200 माइक्रोन का अंतिम एकाग्रता बनाने के लिए ~ 450 μL के अंतिम चैम्बर वॉल्यूम के आधार पर 20 एमएम स्टॉक से आवश्यक 4-सीएमसी की मात्रा की गणना करें। आवश्यक रूप में स्टॉक के dilutions करें
  4. ध्यान से 60 μL घंटी के बफर को चैंबर से ले जाओ और एक सूक्ष्मदर्शी ट्यूब में रखें। इस समाधान के साथ 4-सीसीसी की गणना की मात्रा को पतला करें और इमेजेट की गई कोशिकाओं से अपेक्षित प्रतिक्रिया को आह्वान करने के लिए कक्ष में वापस जोड़ें।
  5. Microcentrifuge ट्यूब के लिए 4-सेमी सीटी की गणना की मात्रा जोड़ें और pipetting द्वारा मिश्रण।
  6. दृढ़ता से मापने के क्षेत्र में समाधान जोड़ें, जबकि तीव्रता माप में ईवेंट मार्कर को एक साथ जोड़ना।
  7. रिसेप्टर और बाद में संकेत कम करने के लिए दवा के लिए समय की अनुमति दें, फिर रिंगर के बफर के 3-6 एमएल के साथ 1.8 एमएम सीए 2+ और 10 एमएम ग्लूकोज के साथ धो लें जबकि एक साथ ईवेंट मार्कर को जोड़ते हैं। चूंकि चैम्बर वॉल्यूम 450 है &# 181; एल और एक वैक्यूम से जुड़ा है, बफर के 3-6 एमएल जोड़ने से यह सुनिश्चित होता है कि दवा युक्त पूर्व समाधान धोया गया है और नए जोड़े गए समाधान के साथ बदल दिया गया है।
  8. प्रत्येक परख के लिए ट्रांसफ़ेक्ट सेल की एक नई स्लाइड का उपयोग करते हुए, 100 माइक्रोन एटीपी और 15 माइक्रोन सीपीए के लिए 6.1-6.7 दोहराएं।
  9. माप पूरा हो जाने के बाद, सरल PCI प्रोग्राम में तीव्रता माप विंडो में डेटा संग्रह समाप्त करें।
  10. कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति और उज्ज्वल चित्र लें
  11. प्रयोग के लिए डेटा फ़ाइल खोलें यदि आवश्यक हो, तो यहां तीव्रता के मूल्यों की फिर से गणना करने के लिए, कक्षों या रुचि के क्षेत्रों को पुनः मंडल करें।
  12. सी 2 सी 1212 मेयब्लस्ट कोशिकाओं में सीटू के डी में निर्धारित करने के लिए, खंड 4.2 और अनुभाग 5 में उल्लिखित प्रोटोकॉल का पालन करें और 1 एमएल का 0 एमएम सीए 2 + रिंगर के बफर को चैम्बर में रखें।
    1. किसी भी कोशिकाओं को खाली करने के लिए 15-30 s के लिए इंट्रासेल्यूलर बफर में 0.002-0.005% सैपोनिन वाले कोशिकाओं को स्थिर करेंकैचर + जो कि साइटोसोल में हो सकता है 10 माइक्रोन ionomycin के साथ केएलएल बफर में 3 एमएलएल 1 एमएल ईजीटीए युक्त कोशिकाओं को धोएं। एक पठार तक पहुंचने तक तीव्रता कम होने दें।
    2. 10 माइक्रोन ionomycin के साथ 3-6 एमएल केएल बफर के साथ कुल्ला और तीव्रता को स्थिर करने की अनुमति दें, फिर चरण 2.7 में विस्तृत प्रत्येक Ca 2+ समाधान जोड़ें। तीव्रता प्रत्येक जोड़ के बीच एक पठार तक पहुंचने की अनुमति दें
  13. बेसल [Ca 2+ ] मात्रा का ठहराव के लिए संवेदक जांचने के लिए, चरण 6.12 का पालन करें। न्यूनतम और अधिकतम प्रतिदीप्ति तीव्रता प्राप्त करने के लिए चरण 2.7 से ईजीटीए और 100 मिमी सीए 2 + बफर का उपयोग करें।

7. डाटा प्रोसेसिंग

  1. तीव्रता माप डेटा की स्प्रैडशीट फ़ाइल डाउनलोड करें।
  2. प्रत्येक सेल के आधारभूत तीव्रता (एफ / एफ 0 ) के लिए डेटा को सामान्यीकृत करें किसी भी रेखांकन कार्यक्रम में सामान्यीकृत बनाम समय का प्लॉट करें।
  3. % परिवर्तन की गणना करने के लिए, सामान्यीकृत शिखर वैल को घटाना1 से हो और 100 गुणा करें। यदि एकाधिक कोशिकाओं को चित्रित किया गया था तो औसत और मानक विचलन की गणना करें।
  4. शोर अनुपात, एसएनआर में संकेत की गणना करने के लिए, इमेज प्रोसेसिंग सॉफ़्टवेयर में प्रयोग से सहेजी गई छवि फ़ाइल को खोलें, जैसे कि इमेजज, और फिर सिग्नल, ट्रांसफ़ेक्टेड सेल और शोर, पृष्ठभूमि को मापें। समीकरण SNR = सिग्नल / शोर का उपयोग करके एसएनआर की गणना करें।
  5. प्रत्येक सीए 2 + एकाग्रता और ईजीटीए (0 एमएम सीए 2 + ) के अतिरिक्त के बाद, प्लेटो के साथ तीव्रता वाले आंकड़े, एकत्रित प्रतिदीप्ति इमेजिंग डेटा से स्वस्थानी के डी में गणना करने के लिए। Θ = (एफ - एफ मिनट ) / (एफ अधिकतम - एफ मिनट ) का उपयोग करके आंशिक संतृप्ति (रिश्तेदार तीव्रता) की गणना करें, जहां θ रिश्तेदार तीव्रता है, एफ किसी भी बिंदु पर प्रतिदीप्ति है, एफ मिन न्यूनतम प्रतिदीप्ति तीव्रता है, और टी की तीव्रता में परिवर्तन को देखने के लिए, एफ अधिकतम अधिकतम प्रतिदीप्ति तीव्रता हैवह न्यूनतम तीव्रता की तुलना में सीए 2 + के अलावा के साथ जांच करता है। किसी भी रेखांकन और वक्र फिटिंग कार्यक्रम में [सीए 2 + ] के सापेक्ष रिश्तेदार तीव्रता डेटा का प्लॉट करें। कश्मीर डी की गणना करने के लिए 1: 1 बाइंडिंग समीकरण θ = [M T ] / (K d + [M T ]) का उपयोग करें और किसी भी रेखांकन और वक्र फिटिंग प्रोग्राम के लिए अनुवादित करें। एम टी कुल धातु एकाग्रता है
  6. 6.13 में उल्लिखित कैलिब्रेशन से बेसल कैल्शियम को मापने के लिए, 1 एमएम ईजीटीए (एफ मिन ) और 100 एमएम सीए 2+ (एफ मैक्स ) के अतिरिक्त के बाद, प्लेटोस के साथ तीव्रता वाले डेटा की औसत। बेसल कैल्शियम की गणना करने के लिए अंशांकन समीकरण [Ca 2+ ] = K d ([F - F min ) / (एफ अधिकतम - एफ)] का उपयोग करें

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Representative Results

इस खंड में पूर्ववर्ती विधियों का प्रयोग करके हासिल किए गए परिणामों को समझाया जाएगा जो ईआर / एसआर सीए 2+ में विभिन्न रिसेप्टर मध्यस्थता मार्गों के माध्यम से परिवर्तनों की निगरानी के लिए अनुकूलित ईआर / एसआर-लक्षित जीईसीआई कैचर + का उपयोग कर रहे हैं।

चित्रा 1 चित्रा 1 ईआर को 200 सुक्ष्ममापी 4-सीसीसी के साथ उत्तेजित RyR के माध्यम से खाली को दिखाता है। 4-सीएमसी आरआरआर के एक एगोनिस्ट है। दवा के अलावा ईएआर कैल्शियम में कमी के रूप में कैचर + फ्लोरोसेंस तीव्रता में कमी द्वारा मापा जाता है। जैसा कि चिन्हित है, यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल कैटेर + का उपयोग कर रिसेप्टर-मध्यस्थता वाले सीए 2 + ट्रैन्टर के विज़ुअलाइज़ेशन और माप की अनुमति देता है + जो ईआर सीए 2+ में परिवर्तनों के बारे में जानकारी प्रदान करता है।

जैसा कि चित्रा 2 में दर्शाया गया है, 1 के अलावा5 सुक्ष्ममापी सीपीए, SERCA पंप को अतिक्रमण करने के लिए, प्रतिदीप्ति तीव्रता में एक बड़ी कमी पैदा करता है जो एक पठार का निर्माण करता है। जैसा कि SERCA पंप के कार्य को हिचकते हैं, ईआर सीए 2+ रिहाई चैनल अभी भी सियासोल में सीए 2 + को सक्रिय कर रहे हैं जिससे फ्लोरोसेंस की तीव्रता कम हो सकती है। कोशिकाओं को सीपीए को धोने के बाद रिंगर के बफ़र से दूर हो गया, जिसमें 1.8 मिमी सीए 2+ और 10 मिमी ग्लूकोज शामिल थे। ये परिणाम SERCA पंप के लिए विशिष्ट Ca 2+ ट्रैवेलर्स को मॉनिटर करने के लिए कैचर + की क्षमता की पुष्टि करते हैं।

चित्रा 3 चित्रा 3 आईपी 3 आर के अप्रत्यक्ष सक्रियण के लिए प्रतिनिधि डेटा से पता चलता है जिसमें 200 माइक्रोग्राम एटीपी में हेके 2 9 3 कोशिकाओं को कैचर + के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया। एटीपी पी 2 वाई रिसेप्टर, जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर से जुड़ा है, जो आईपी 3 बनाता है जो आईएपी 3 आर के माध्यम से सीए 2+ रिलीज को सक्रिय करता है। हालांकि परिवर्तनछोटा है, 200 माइक्रोन एटीपी के अलावा सिग्नल की तीव्रता में एक दृश्य कमी आती है। रिंगर के बफर वाले कोशिकाओं को धोने से 1.8 मिमी सीए 2+ और 10 मिमी ग्लूकोज युक्त ईआर को फिर से भरना और बेसलाइन पर लौटने के लिए संकेत देता है। ये परिणाम अप्रत्यक्ष उत्तेजना के माध्यम से आईपी 3 आर-मध्यस्थता वाले कैल्शियम रिहाई की निगरानी के लिए कैचर + की क्षमता को उजागर करते हैं।

चित्रा 4 में , CATCHER + को सी 2 सी 12 12 मेयब्लास्ट कोशिकाओं में ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था ताकि सीटू के डी को निर्धारित किया जा सके। प्रोटोकॉल में रेखांकित डेटा एकत्र किया गया था। सीसीसी 122 मेनोब्लास्ट कोशिकाओं को 15-30 एस के लिए 0.005% सैपोनिन के साथ परिमेय किया गया था, फिर केएमएल बफर में 1 एमएम ईजीटीए युक्त 10 माइक्रोन ionomycin युक्त धोया गया था। केएल बफर में 10 माइक्रोन ionomycin युक्त विभिन्न सीए 2+ सांद्रता तैयार की गई थी और एक कदमवाही तरीके से इसमें जोड़ा गया था। डेटा सामान्यीकृत था और 1: 1 बाइंड का प्रयोग करके फिट किया गया थाआईएनजी समीकरण औसत कोशिका 7 कोशिकाओं के लिए 3.1 ± 1.4 मिमी थी। कैचर + के कमजोर आकर्षण ने सीए 2+ को उच्च सीए 2 + ऑर्गेनेल जैसे इआर या एसआर को समझने की अनुमति दी। एसआर में बेसल [सीए 2 + ] का निर्धारण करने के लिए, सीसीसी 2 12 कोशिकाओं को केसीएल बफर के साथ धोया गया, 15-30 एस के लिए 0.005% सैपोनिन के साथ permeabilized किया गया, और फिर 1 एमएम ईजीटीए में केएमएल बफर युक्त 10 माइक्रोन ionomycin युक्त एफ मिन । केएलएल बफर के साथ ईजीटीए को धोने के बाद अधिकतम अधिकतम, एफ मैक्स , 100 एमएम सीए 2 + 10 माइक्रोन ionomycin के साथ जोड़ा गया था। मूल सीए 2 + 0 की गणना 0.4 ± 0.2 मिमी थी।

आकृति 1
चित्रा 1: एचईके 2 9 3 कोशिकाओं में 4 सेमी सीएम का उपयोग करके आरएआर का प्रेरणा ( ए ) 4-सीसीसी के साथ आरआईआर के सक्रियण की रूपरेखा ( बी ) HEK293 कोशिकाओं की तीव्रता रिकॉर्डिंगकैचर + के साथ ट्रांसफ़ेक्ट, ईआर में स्थानीयकृत, 200 माइक्रोन 4-सीसीसी के साथ इलाज किया गया। 4-सीसीसी के साथ RyR की उत्तेजना सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति तीव्रता में कमी का कारण बनती है जो सीधे [सीए 2+ ] ईआर में कमी से संबंधित होती है। N छवियों की संख्या को दर्शाया गया है। औसत संकेत घटा 12.0 ± 2.2% था। घंटी के बफर में 1.8 मिमी सीए 2 + की मौजूदगी ने ईआर को फिर से भरने में मदद की, आधार रेखा के लिए तीव्रता वसूली में परिलक्षित। इनसेट के चित्र 4 सेमी सीसी के उपचार से पहले और बाद में कोशिकाओं को दिखाते हैं। एसएनआर की गणना 4.3 ± 0.8 थी। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2
चित्रा 2: रिवर्सिबल SERCA पी का उपयोग करके [Ca 2+ ] ईआर में कमी करेंHEK293 कोशिकाओं में एम्प इनहिबिटर सीपीए ( ए ) सीपीए द्वारा एसईआरसीए पंप का निषेध ( बी ) हेके 293 कोशिकाओं के लाइव इमेजिंग, कैचर + के साथ ट्रांसफ़ेक्ट, ईआर में स्थानीयकृत, 15 माइक्रोन सीपीए के साथ इलाज किया गया। क्योंकि सीए 2+ अभी भी आईपी 3 आर और आरएआर के माध्यम से प्रवाह कर सकता है, सीपीए के साथ एसईआरसीए पंप को अवरुद्ध करता है सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति तीव्रता में कमी का कारण बनता है जो [सीए 2 + ] ईआर में कमी के साथ सीधे संबंध रखता है। N छवियों की संख्या को दर्शाया गया है। इनसेट चित्र हैं HEK293 कोशिकाओं को कैचर + पहले और उपचार के बाद ट्रांसफ़ेक्ट किया गया। औसत संकेत कमी 21.0 ± 0.3% थी। घंटी के बफर में 1.8 मिमी सीए 2 + की मौजूदगी ने ईआर को फिर से भरने में मदद की, आधार रेखा के लिए तीव्रता वसूली में परिलक्षित। एसएनआर की गणना 5.5 ± 0.8 थी। का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंइस चित्र।

चित्र तीन
चित्रा 3: एएचपी एचई 2 99 3 कोशिकाओं में [सीए 2 + ] ईआर घट जाती है। ( ए ) पीपीआईआईआर के जरिए एटीपी के साथ आईपी 3 आर के अप्रत्यक्ष सक्रियण की योजनाबद्ध प्यूरिनर्जिक रिसेप्टर P2YR पी 2 वाईआर एक GPCR है जो एटीपी बाध्यकारी पर आईपी 3 उत्पन्न करता है। आईपी 3 आईपी 3 आर को सक्रिय करता है, ईआर से कैल्शियम रिलीज को उत्तेजित करता है ( B ) CCHER + के साथ ट्रांसफ़ेक्ट HEK293 कोशिकाओं का वास्तविक समय इमेजिंग, ईआर में स्थानीयकृत, 200 माइक्रोन एटीपी के साथ इलाज किया गया। एटीपी के साथ P2Y रिसेप्टर के द्वारा आईपी 3 आर परोक्ष उत्तेजना सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति तीव्रता में कमी का कारण बनती है जो [Ca 2+ ] ईआर में कमी के लिए सीधे संबंध रखती है। N छवियों की संख्या को दर्शाया गया है। औसत संकेत घटा 6.0 ± 3.0% था एसएनआर सी था6.7 ± 2.7 होने का अंदाजा इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 4
चित्रा 4: सी 2 सी 2 सी 12 12 मेयब्लास्ट कोशिकाओं में सीचर के सी के डी में। सामान्यीकृत तीव्रता के लिए प्रतिनिधि का पता लगाने के लिए सीएसी -212 माइोबलास्ट कोशिकाओं से एकत्रित किया गया जो कि कैचर + के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था। कोशिकाओं को 15-30 एस के लिए इंट्रासेल्यूलर बफर में 0.005% सैपोनिन के साथ परिमेय किया गया था। ईजीटीए और सीए 2 + समाधान केएल बफर में तैयार किए गए थे, एन इमेजेट की गई कोशिकाओं की संख्या को संदर्भित करता है। ( ए ) इनसेट प्रतिदीप्ति छवियों उपचार से पहले और बाद में कोशिकाओं के प्रतिनिधि हैं। 0.3, 0.6, 2, 5, 10, 20, 50 और 100 मिमी सीए 2 + 10 माइक्रोन की उपस्थिति में सीसीबी 122 मेबब्लास्ट कोशिकाओं को परिमाणीकृत करने के लिए जोड़ा गया थाIonomycin 3.1 ± 1.4 मिमी के एक के घ प्राप्त करने के लिए। ( बी ) इनसेट प्रतिदीप्ति छवियों को क्रमशः प्रत्येक 10 माइक्रोन ionomycin के साथ 1 एमएम ईजीटीए और 100 एमएम सीए 2 + के अलावा, न्यूनतम और अधिकतम मूल्य पर कोशिकाओं के प्रतिनिधि हैं। मूल सीए 2 + 0 की गणना 0.4 ± 0.2 मिमी थी। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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Discussion

रिसीप्टर एगोनिस्ट या प्रतिपक्षियों के जवाब में प्रत्येक सेल में जटिल ईआर / एसआर सीए 2 + सिग्नलिंग प्रक्रियाओं का विश्लेषण करने के लिए कैसर + जैसे फ्लोरोसेंट जांचों के एकल एकल इमेजिंग लाइव एक प्रभावी तकनीक है। यह तकनीक इमेजिंग के लिए एक साथ कई तरंगदैर्य का उपयोग कर उपयोगी है, जैसे क्रमशः फुरा -2 या इमेज कोचर और Rhod-2 को क्रमशः दोनों ईआर और साइटोसोलिक कैल्शियम परिवर्तनों पर नजर रखने के लिए। इस प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम हैं; सेल अभिकर्मक इमेजिंग की व्यवहार्यता पर एक महान प्रभाव हो सकता है कम अभिकर्मक दर के परिणामस्वरूप कैल्शियम प्रतिक्रियाओं की निगरानी के लिए जीईसीआई की अपर्याप्त अभिव्यक्ति हो सकती है। दूसरी तरफ, कैचर + के अत्यधिक विषमता + ईआर / ईआर सीए 2+ पर एक बफरिंग प्रभाव नहीं होगा, सिंथेटिक कैल्शियम डाईज से जुड़ी समस्या। सीए 2+ जांच के बफ़रिंग प्रभावों को [सीए 2 + ] ऑर्गेन में प्रभावित होता है, पी के डी डीवस्त्र और माप की आवश्यकता के लिए जांच की एकाग्रता। साइटोसॉलिक [सीए 2 + ] आमतौर पर निम्न नैनोमोलर रेंज में है, हालांकि, आवश्यक जांच एकाग्रता एक तुलनीय रेंज में है। इस मामले में, साइटोसोलिक कैल्शियम बफर करने में डाई एकाग्रता की मात्रा और इसकी क्षमता सेलुलर इमेजिंग के लिए एक प्रमुख चिंता थी। इसके विपरीत, ईआर / एसआर [सीए 2+ ] 100 सेंमी माइक्रोलोल्डर में मिलीमिलाओर रेंज 31 में है क्योंकि हम विभिन्न स्तनधारी सेल लाइनों के लिए निर्धारित 25 हैं । चूंकि कैचर + की 0.1-1 माइक्रोन अभिव्यक्ति + ईआर कैल्शियम का पता लगाने के लिए पर्याप्त है, कैचर का बफ़रिंग प्रभाव नगण्य है। इस प्रकार, कैचर + ल्यूमिनियल ईआर / एसआर सीए 2 + 32 पर बफरींग प्रभाव के बिना सीए 2+ प्रवाह में सीए 2 + प्रवाह की निगरानी कर सकता है।

कई कारक जीईसीआई के अभिकर्मक दक्षता जैसे कि ऊष्मायन समय, वें को प्रभावित कर सकते हैंई अभिकर्मक अभिकर्मक, ऊष्मायन का तापमान, और सेल का संगम। सेल परफ़्लुएंसी, जब स्लाइड पर कोशिकाओं के बीज लगाते हैं, तो इमेजिंग गुणवत्ता को काफी प्रभावित कर सकते हैं। कम संगम के परिणामस्वरूप कोशिकाओं (एन) और कम सांख्यिकीय सटीकता की संख्या कम हो सकती है, जबकि उच्च स्तर के संगम के कारण इमेजिंग में बड़े चर वाले कोशिकाओं के अतिव्यापी परतों को जन्म मिलता है। अभिकर्मक के लिए समय और तापमान को सेल प्रकार के आधार पर अनुकूलित किया जाना चाहिए। इसके अतिरिक्त, एपीप्टीसिस को रोकने के लिए कम सीरम मीडिया के साथ डीएमईएम जोड़कर लंबे समय तक अभिकर्मक समय के लिए उपयुक्त है। स्तनधारी कोशिकाओं में मूल GECI कैचर प्रतिदीप्ति, जब सुसंस्कृत और ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था, तो केवल 30 डिग्री सेल्सियस कैचर का प्रतिदीप्ति 37 डिग्री सेल्सियस पर अभिव्यक्ति के लिए सफलतापूर्वक अनुकूलित और बेहतर हुआ, जिसके परिणाम स्वरूप नए, बेहतर संस्करण कैचर + सीए 2+ जांच की अभिव्यक्ति की पुष्टि के लिए ईजीएफपी के खिलाफ एक एंटीबॉडी का उपयोग करके एक पश्चिमी धब्बा किया जा सकता है

इसके अलावा, मुझेथॉड और अभिकर्मक वितरण की स्थिरता महत्वपूर्ण है। अभिकर्मकों को छिड़काव, छोटे मात्रा प्रसार, या यांत्रिक पंपों द्वारा कक्ष में जोड़ा जा सकता है, जिनमें से सभी अलग-अलग प्रतिक्रियाएं प्राप्त कर सकते हैं। यह जरूरी है कि कक्ष के नीचे स्थित सीलेंट ग्रीस की एक परत को लागू करके समाधान कक्ष को ठीक से सील कर दिया गया है जो स्लाइड पर रखा जाएगा। जांच के लिए सही तरंग दैर्ध्य का चयन होना चाहिए। कैचर + के लिए उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य क्रमशः 395/488 एनएम और 510 एनएम हैं। कोशिका इमेजिंग के लिए, कोशिकाओं पर यूवी प्रकाश के हानिकारक प्रभाव से बचने के लिए उत्तेजना के लिए केवल 488 एनएम का उपयोग किया जाता है। इसलिए, किसी भी ऑप्टिकल फिल्टर का उपयोग करते हुए जो 488 एनएम पर उत्तेजित करते हैं और 510 एनएम पर उत्सर्जन इकट्ठा करते हैं, को कैचर + के साथ चित्र में उपयोग करने के लिए स्वीकार्य होगा। फोटोबलीचिंग को रोकने के लिए, फ़्रेम / एस 33 जैसी हल्की तीव्रता और हल्के प्रदर्शन को अनुकूलित करने के प्रयासों पर ध्यान केंद्रित किया जा सकता है

जबकि इस प्रोटोकॉल को एफईएफ का विश्लेषण करने के लिए आदर्श हैईएआर / एसआर का एक्ट कैचर + सीए 2 + ईआर / एसआर फ्लोरोसेंट जांच का उपयोग करते हुए, किसी भी प्रयोग में अपेक्षित सीमाएं हैं चूंकि सिंगल सेल लाइव इमेजिंग केवल कोशिकाओं की एक छोटी सी फ्रेम का विश्लेषण करती है, कोशिकाओं की संख्या (एन) 1-100 कोशिकाओं से औसत पर भिन्न हो सकती है, लेकिन बड़ी सेल लाइनों के लिए कम हो सकती है इससे कई परीक्षणों के बिना सेल संख्याएं और सांख्यिकीय रूप से भिन्न परिणाम निकल जाते हैं। सांख्यिकीय सटीकता के लिए एक n> 6 आवश्यक है। एक बड़ा एन प्राप्त करने के लिए, कई व्यंजनों को इमेजेट किया जाना चाहिए या अन्य तकनीकों का उपयोग किया जाना चाहिए, समवर्ती रूप से। इसके अतिरिक्त, कैचर + एक एकल तरंगदैर्ध्य ईआर / एसआर सीए 2+ जांच है, यह अन्य एकल तरंगदैर्ध्य जांच और रंगों के मुद्दों की ओर जाता है, सिग्नल को मापने में सक्षम नहीं होने के कारण, अगर यह संकेत नहीं है कि कोशिकाओं के विघटन के विपरीत संकेत सत्य है आर्टिफैक्ट, और रेतीओमेट्रिक सिस्टम 34 की तुलना में बड़ा शोर है।

यह काम बताता है कि ये अनुकूलित Ca 2+ जांच कर सकते हैंरिसेप्टर-मध्यस्थता ईआर / एसआर सीए 2 + रिलीज की निगरानी के लिए विभिन्न सेल प्रकार या ऊतक प्रकारों में लागू किया जा सकता है। कैचर + एक तरंग दैर्ध्य ईआर / एसआर सीए 2+ जांच है। इसलिए, यह महत्वपूर्ण है कि प्रायोगिक पैरामीटर और सेटिंग्स मात्रात्मक माप के लिए संगत हैं। सेल लाइनों में कैल्शियम एकाग्रता और कैल्शियम सेंसर के के डी का एक विस्तृत अंशांकन मात्रात्मक विश्लेषण के लिए अतिरिक्त महत्वपूर्ण माप है।

इन विकसित कैल्शियम सेंसर को ईआर / एसआर के भीतर विशिष्ट स्थानों पर लक्षित किया जा सकता है जो विभिन्न जैव और रोग संबंधी परिस्थितियों में वैश्विक सीए 2+ परिवर्तन की तुलना में मौजूद विभिन्न सीए 2+ ट्रैटरों की निगरानी कर सकते हैं। सीए 2 + -संबंधित रोगों के निदान के लिए भविष्य के औजार प्रदान करने के लिए ये निष्कर्ष सीए 2 + इमेजिंग और जांच डिजाइन के क्षेत्र को आगे बढ़ाते रहेंगे। रिपोर्ट किए गए प्रोटोकॉल और विकसित सेंसर को भी ड्रग डी के लिए अनुकूलित किया जा सकता हैकैल्शियम सिग्नलिंग से संबंधित बीमारियों के खिलाफ आईस्कॉरीज

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

यह काम एनआईएच जीएम 629 99, एनआईएच ईबी 2007268, एनआईएएच एजी 15820, बीएंडबी बीज ग्रांट, और एनआईएच पूरक अनुदान को एफआर, बी बी फेलोशिप को सीएम, सीडीटी फेलोशिप आरजी को प्रदान किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-Chloro-3-methylphenol (4-CmC) Sigma-Aldrich C55402
515DCXR dichroic mirror Chroma Technology Corp. NC338059
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate Sigma-Aldrich A26209
Calcium chloride dihydrate EMD Millipore 102382
Corning tissue-culture treated culture dishes (100 mm) Sigma-Aldrich CLS430167
Corning tissue-culture treated culture dishes (60 mm) Sigma-Aldrich CLS430166
Cyclopiazonic Acid (CPA) EMD Millipore 239805
D(+)-Glucose ACROS Organics 41095-0010
Dow Corning 111 Valve Lubricant & Sealant Warner Instruments 64-0275
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) Sigma-Aldrich D7777
Ethylenebis(oxyethylenenitrilo)
tetraacetic Acid (EGTA)		 ACROS Organics 409911000 
Fetal Bovine Serum (FBS) ThermoFisher 26140087
Fisherbrand Cover Glasses 22x40 mm Fisher Scientific  12-544B
Hanks’ Balanced Salts (HBSS) Sigma-Aldrich H4891
HEPES, Free Acid, Molecular Biology Grade EMD Millipore 391340
Immersion Oil without autofluorescence Leica 11513859
Ionomycin, Free Acid Fisher Scientific 50-230-5804
Leica DM6100B inverted microscope with a cooled EM-CCD camera Hamamatsu C9100-13
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent ThermoFisher 11668019
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent ThermoFisher L3000015
Low Profile Open Diamond Bath Imaging Chamber Warner Instruments RC-26GLP
Magnesium Chloride Hexahydrate Fisher Scientific M33-500
Opti-MEM ThermoFisher 51985034
Potassium Chloride EMD Millipore PX1405
Potassium Phosphate, Dibasic EMD Millipore PX1570
Potassium Phosphate, Monobasic EMD Millipore PX1565
Saponin Sigma-Aldrich 47036
SimplePCI Image Analysis Software Hamamatsu N/A
Sodium Bicarbonate Fisher Scientific S233-3
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-500
Sterivex-GV 0.22 µm filter EMD Millipore SVGVB1010
Till Polychrome V Xenon lamp Till Photonics N/A
Trypsin (2.5%), no phenol red (10x) ThermoFisher 15090046

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जैव रसायन अंक 123 कैल्शियम इमेजिंग सरको एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम सूचक कैल्शियम सिग्नलिंग कैचर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी
लक्षित सीए के साथ ईआर / एसआर कैल्शियम रिलीज की निगरानी<sup&gt; 2 +</sup&gt; सेंसर कैचर<sup&gt; +</sup
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Reddish, F. N., Miller, C. L.,… More

Reddish, F. N., Miller, C. L., Gorkhali, R., Yang, J. J. Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+. J. Vis. Exp. (123), e55822, doi:10.3791/55822 (2017).

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