Summary
Presentiamo protocolli per l'applicazione del nostro indicatore di calcio (GECI) CatchER + per il monitoraggio dei rapidi transitori di calcio nel reticolo endoplasmatico / sarcoplasmatico (ER / SR) di HEK293 e delle cellule del muscolo scheletrico C2C12 utilizzando microscopia a fluorescenza in tempo reale. Viene inoltre discusso un protocollo per la misura e la calibrazione in K d in situ .
Abstract
I transitori intracellulari di calcio (Ca 2+ ) evocati da stimoli extracellulari iniziano una moltitudine di processi biologici negli organismi viventi. Al centro del rilascio di calcio intracellulare sono i principali organici intracellulari di stoccaggio del calcio, il reticolo endoplasmatico (ER) e il reticolo sarcoplasmatico più specializzato (SR) nelle cellule muscolari. La liberazione dinamica del calcio da questi organelli è mediata dal recettore del ryanodine (RyR) e dall'inositolo 1,4,5-trifosfato (IP 3 R) con ricarico che si verificano attraverso la pompa sarco / endoplasmatica calcio ATPase (SERCA). Un sensore di calcio geneticamente codificato (GECI) chiamato CatchER è stato creato per monitorare il rilascio rapido del calcio dalla ER / SR. Ecco i protocolli dettagliati per la trasfezione e l'espressione del migliorato GECI CatchER + targeting ER / SR nelle cellule HEK293 e C2C12 e la sua applicazione nel monitoraggio del transitorio di calcio mediato dalla pompa IP 3 R, RyR e SERCAIn cellule HEK293 utilizzando microscopia a fluorescenza è descritto. L'agonista del recettore o l'inibitore della scelta è disperso nella soluzione della camera e i cambiamenti di intensità sono registrati in tempo reale. Con questo metodo si osserva una diminuzione del calcio ER con attivazione di RyR con 4-cloro-m-cresolo (4-cmc), l'attivazione indiretta di IP 3 R con adenosina trifosfato (ATP) e l'inibizione della pompa SERCA con ciclopiazonico Acido (CPA). Discutiamo anche i protocolli per la determinazione del K d in situ e la quantificazione basale [Ca 2+ ] nelle cellule C2C12. In sintesi, questi protocolli, usati in combinazione con CatchER + , possono elicitare il rilascio di calcio mediato dal recettore dalla ER con applicazione futura nello studio delle patologie correlate al calcio ER / SR.
Introduction
Gli attributi spazio-temporali dei transitori intracellulari del calcio (Ca 2+ ) attivano varie funzioni biologiche 1 . Questi eventi di segnalazione Ca 2+ vengono scatenati extracellulari attraverso diversi stimoli e controllati intracellulariamente dalle principali organelle di stoccaggio Ca 2+ e da numerose Ca 2+ pompe, canali e proteine leganti Ca 2+ . I transitori Ca 2+ possono essere alterati in modo significativo a causa di difetti con la modulazione del segnale, portando a diverse malattie 2 . A causa della velocità e dell'intricacy del sistema di segnalazione Ca 2+ , con il reticolo endo- (ER) e sarcoplasmatico (SR) al centro, sono necessarie sonde Ca 2+ geneticamente codificate che sono state ottimizzate per l'espressione dei mammiferi con una rapida cinetica Per osservare i cambiamenti globali e locali di Ca 2+ in cellule diverse 3 .
L'ER e la SR, La sua controparte nelle cellule muscolari, sono i principali organoli di storage Ca 2+ intracellulari e fungono da pozzetti Ca 2+ che aiutano ad amplificare il segnale Ca 2+ 4 . L'ER / SR è parte integrante della segnalazione Ca 2+ con doppio ruolo come trasmettitore e ricevitore di segnali 5 . Il recettore del ryanodine (RyR) e il recettore inositolo 1,4,5-trifosfato (IP 3 R) sono recettori di rilascio Ca 2+ situati sulle membrane del ER / SR regolate da Ca 2+ 6 . Altri agenti stimolano direttamente o indirettamente la funzione di questi recettori. 4-cloro-m-cresolo (4-cmc) è un potente agonista della RyR, con una sensibilità più alta di 10 volte rispetto alla caffeina per indurre la liberazione di SR Ca 2+, dove entrambi sono regolarmente impiegati per studiare la rilascio Ca 2+ mediata da RyR Cellule sane e malate 7 . ATP aumenta il Ca 2+ re mediato da IP 3Leasing attraverso il IP 3 R 8 . ATP si lega al recettore purinergico P2YR, un recettore accoppiato a proteine G (GPCR), innescando la produzione di IP 3 che si lega all'IP 3 R per rilasciare Ca 2+ dalla ER 9 , 10 . La pompa di calcio ATPase (SERCA) di tipo reticolare sarco-endoplasmatico è una pompa ATPasi tipo P, situata anche sulla membrana ER / SR che riduce la Ca 2+ citosolica e ricarica l'ER / SR attivamente pompando lo ione nel lumen ER / SR 11 . Gli inibitori specifici della pompa SERCA includono thapsigargin, da Thapsia garganica e acido ciclopiazonico (CPA), da Aspergillus e Penicillium . La CPA ha una bassa affinità per la pompa e reversibilmente blocca il punto di accesso Ca 2+ 12 . Thapsigargin, d'altro canto, si lega irreversibilmente alla pompa libera Ca 2+ al residuo F256 nell'elica M3 con nanomoloAffinità 11 . Analizzare e quantificare i cambiamenti coinvolti negli eventi stimolati da Ca 2+ è stato e rimane una sfida. Dal momento che l'ER / SR è il principale contenitore subcellulare Ca 2+ contenente una funzione centrale nella propagazione del segnale Ca 2+ , molti lavori sono stati focalizzati sulla comprensione del segnale ER / SR Ca 2+ 5 .
La creazione di coloranti sintetici Ca 2+ ha contribuito a promuovere il campo e la pratica dell'immagine Ca 2+ . Anche se i coloranti, come Mag-Fura-2, sono stati ampiamente utilizzati per misurare Ca 2+ compartimentalizzati in diverse cellule, 13 , 14 , 15 hanno limitazioni quali il caricamento di tinte non uniformi, la fotolibrazione e l'incapacità di essere destinati a specifici organelli . La scoperta della proteina fluorescente verde (GFP) e l'avanzamento delle proteine fluorescenti-Sonde Ca 2+ ha spinto il campo di Ca 2+ in avanti 16 . Alcuni dei GECI esistenti sono coppie di trasferimento di energia di risonanza Förster (FRET) che coinvolgono la proteina fluorescente gialla (YFP), la proteina fluorescente cianica (CFP), il calmodulina e il peptide legante M13 17 , 18 . I GECI a base di Troponin C sono disponibili anche come coppia FRET di CFP e Citrine e come singole sonde di fluoroforo 19 , 20 , 21 . Altri, come GCaMP2 e R-GECO, sono singoli sensori fluorofori coinvolgenti la calmodulina 22 , 23 . Per superare le limitazioni della sintonizzazione stretta di K d e di legame cooperativo associato a più siti di legame Ca 2+ trovati nei loro domini 24 legati alla Ca 2+ , una nuova classe di calcio senI disordini sono stati creati progettando un sito di legame Ca 2+ sulla superficie del barile beta in una posizione sensibile al cromoforo di proteine fluorescenti verde avanzate (EGFP) 25 , 26 . Questo sensore altamente protetto, chiamato CatchER, ha un K d di ~ 0,18 mM, ak vicino al limite di diffusione e ak off di 700 s -1 . CatchER è stato usato per monitorare il rilascio di calcio ER / SR mediato dal recettore in diverse linee cellulari di mammiferi come HeLa, HEK293 e C2C12 25 . A causa della sua rapida cinetica, CatchER è stato utilizzato in fibre muscolari flexor digitorum brevis (FDB) di topi giovani e vecchi Friend Virus B NIH Jackson (FVB) per rivelare che più Ca 2+ rimane nella SR dopo 2 s di depolarizzazione nella FDB Fibre di vecchi topi rispetto a quelli dei giovani topi 27 . Per superare la sua bassa fluorescenza a 37 ° C, che ostacola le sue applicazioni nell'immagine del calcio di mammiferiAbbiamo sviluppato una versione migliorata di CatchER chiamata CatchER + . CatchER + mostra una migliore fluorescenza a 37 ° C per una migliore applicazione nelle cellule dei mammiferi. Ulteriori mutazioni sono state incorporate in CatchER per migliorare la termostabilità e la fluorescenza a 37 ° C 28 , 29 , per creare CatchER + . CatchER + mostra un aumento del suo rapporto segnale / rumore (SNR) di sei volte rispetto a CatchER 30 .
Qui vengono presentati i protocolli per la cultura e la trasfezione delle cellule HEK293 e C2C12 con CatchER + e la sua applicazione per il monitoraggio dei transienti di calcio mediati dal recettore ER / SR. I risultati rappresentativi sono mostrati per CatchER + espresso in cellule HEK293 trattate con 4-cmc, CPA e ATP. Inoltre forniamo un protocollo per la determinazione del in situ K d di CatchER + in cellule miooblasto C2C12 e quaDi basale [Ca 2+ ].
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Protocol
1. Preparazione delle diapositive
- Porre vetrini da microscopio da 22 mm x 40 mm in piatti da coltura a cellule da 6 cm, 1 vetrino per piatto.
- Esporre ogni lato di ciascuna diapositiva come pure il piatto da 6 cm a luce ultravioletta (UV) per 15-20 minuti per sterilizzare in un cappuccio sterile.
- Coprire i piatti con diapositive all'interno con parafilm e conservare a 4 ° C fino a quando non sarà pronto per l'uso.
2. Preparazione di supporti, buffers, soluzioni e reagenti
- Preparare 1 L di soluzione salina bilanciata Hank (HBSS) in acqua deionizzata e aggiungere 10 mM HEPES, 5 mM NaHCO3 e 1 mM EGTA. Regolare a pH 7,2-7,3 con NaOH. Tampone filtrante con filtro da 0,22 μm in una bottiglia autoclavata.
- Preparare 900 ml di alghe di glucosio elevato Dulbecco's Medium (DMEM) modificato in acqua deionizzata. Aggiungere 44 mM NaHCO 3 e regolare il pH a 7,2-7,3 con HC1. Filtrare i supporti con un filtro da 0,22 μm in una bottiglia autoclavata. Aggiungere 100 ml di bovi fetaliNe serum (FBS) ai media per ottenere la concentrazione di FBS del 10%. Conservare a 4 ° C.
- Preparare 1 L di tampone intracellulare (125 mM KCl, 25 mM NaCl, 10 mM HEPES, 0,2 mM CaCl2, 0,5 mM EGTA, 0,2 mM MgCl2) in acqua deionizzata e regolare il pH a 7,25. Il finale [Ca 2+ ] sarà ~ 100 nM. Prima dell'uso, aggiungere 0.5 mM ATP. Conservare a temperatura ambiente.
- Preparare 1 l di tampone Ringer (121 mM NaCl, 2,4 mM K 2 HPO 4 , 0,4 mM KH 2 PO 4 , 10 mM HEPES e 1,2 mM MgCl2) in acqua deionizzata e regolare il pH a 7,2. Conservare a temperatura ambiente. Per l'uso, aliquota 50 mL in un tubo da 50 mL e aggiungere 1.8 mM Ca 2+ e 10 mM glucosio.
- Preparare 1 L di soluzione di risciacquo KCl (125 mM KCl, 25 mM NaCl, 10 mM HEPES, 0,2 mM MgCl2) in acqua deionizzata e regolare il pH a 7,25.
- Sciogliere 5 mg di ionomicina in 1 mL di dimetilsolfossido (DMSO). Aliquota 30 μL in microtubi e conservare a -206; C.
- Preparare l'acido ciclopiazonico (CPA) dissolvendo CPA in DMSO. Assicurarsi che il percentuale finale di DMSO sia ≤ 1% per il CPA aggiunto alle cellule per prevenire l'apoptosi. Preparare 20 mM di 4-cloro-m-cresolo (4-cmc) sciogliendo in H 2 O filtrato e lasciandolo sciogliere a notte agitando a 37 ° C. Preparare lo stock di ATP sciogliendo in H 2 O filtrato fino a 100 mM.
- Per determinare la K d in situ, preparare 15 ml di 1 mM EGTA, 0,2 mM, 0,6 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM, 50 mM e 100 mM Ca 2+ in tampone KCl utilizzando un 100 MM EGTA e uno stock di 1 M CaCl2 disciolti in acqua deionizzata.
3. Cultura cellulare
- Culture C2C12 myoblast e HEK293 cellule secondo protocolli ATCC per ciascuno utilizzando piatti di coltura cellulare da 10 cm in una cappa UV sterile.
NOTA: Le cellule C2C12 non dovrebbero essere consentite di crescere al di sopra della confluenza del ~ 70% poiché i mioblasti inizieranno a differenziazioneTe in miotubi. Entrambe le cellule HEK293 e C2C12 crescono prontamente e non dovrebbero essere permesse di crescere oltre confluenza del 100% per mantenere l'integrità cellulare. Inoltre, le cellule non devono essere passate più di 10 volte prima di usarle per un esperimento per preservare la salute delle cellule.
4. Trasfezione delle cellule HEK293
- Le cellule HEK293 di seme su microscopio di vetro sterilizzato da 22 mm x 40 mm scivolarono in piatti da 6 cm in modo che siano ~ 70% confluenti il giorno della trasfezione.
- Il giorno dopo, seguire il protocollo del produttore per il reagente di transfezione per trasfettare le cellule usando 2 μg di CatchER + cDNA e un DNA di 1: 3 (peso / volume): rapporto di reagente di transfezione nei mezzi di siero ridotti ( ad esempio, Opti-MEM).
- Svuotare il supporto DMEM dal piatto e aggiungere 3 ml di media sierica ridotta. Aggiungere il DNA: la miscela di reagente di transfezione al piatto e incubare per 4-6 h a 37 ° C.
- Dopo l'incubazione, lavare le cellule con 5-6 ml di HBSS. Scartare l'HBSS fIl piatto e sostituire con 3 ml di DMEM fresco e incubarli a 37 ° C per 48 ore per consentire l'espressione del GECI.
- Trasfezione di cellule miooblasto C2C12
- Per le cellule miooblasto C2C12, trypsinizzare le cellule aggiungendo trypsina sufficiente per coprire il fondo del piatto (1-2 mL). Mettere il piatto in un incubatore a 37 ° C per 2-6 minuti per consentire alla tripsina di allentare le celle dal fondo del piatto.
- Una volta completata l'incubazione, togliere la tripsina e aspirare le cellule in 8 ml di DMEM. Pipettate le cellule con il DMEM per disperdere e ri-sospendere uniformemente le cellule te e seminarle su coperchi sterili in piatti da 6 cm di coltura cellulare contenenti 3 ml di DMEM in modo che la confluenza finale sia del 60%.
- Trasfettare le cellule lo stesso giorno come descritto nel passaggio 4.2-4.3. Incubare per 24 h a 37 ° C.
- Ripetere la fase 4.4.
5. Preparazione del microscopio a scorrimento e fluorescenza
- Accendere mIcroscopio e sorgente luminosa, quindi aprire il programma Simple PCI. Lasciare che il microscopio si riscaldi per 15-20 min o fino a quando la fotocamera del dispositivo accoppiato a carica (CCD) si raffredda a -65 ° C. Preparare la camera e scivolare con le celle in attesa.
- Coprire la parte inferiore della camera di imaging con vasca diamantata a basso profilo con un sottile strato di sigillante, utilizzando un tampone di cotone.
- Prendere la diapositiva contenente le cellule trasfettate dall'incubatore e sciacquare delicatamente tre volte con 1 ml di tampone di Ringer con 10 mM di glucosio e 1,8 mM di Ca 2+ preriscaldati a 37 ° C.
- Lasciare 1 ml di tampone Ringer nel piatto, per impedire le cellule di essiccazione e utilizzare pinze per togliere la scivola dal piatto. Lasciare che la soluzione in eccesso si assorba a un tessuto di laboratorio toccando il bordo della slitta ad un tessuto di laboratorio. Quindi posizionare sul lato della camera contenente il grasso con le celle rivolte verso l'alto verso il grasso e fissare la camera sul supporto a palo con un cacciavite.
- Aggiungi 1Ml del tampone di Ringer alla camera per impedire alle cellule di essiccare durante il montaggio della camera sul palco e completare il resto della configurazione del microscopio. Una volta che il tubo di aspirazione del vuoto è fissato alla camera, il volume finale della camera è di ~ 450 μL.
- Passare l'obiettivo del microscopio all'obiettivo di immersione a olio 40X.
- Utilizzare la soluzione di pulizia dell'obiettivo e della carta per pulire e asciugare l'obiettivo. Non strofinare l'obiettivo. Colare dolcemente finché la superficie non sia pulita.
- Aggiungere una goccia dell'olio di immersione all'obiettivo.
- Mettere il supporto sullo stadio del microscopio e aggiungere la punta del vuoto alla camera. Una volta che il tubo di aspirazione del vuoto è fissato alla camera e acceso, il volume finale della camera è di ~ 450 μL. Questo volume finale è a livello dei lati della camera. È indispensabile che la soluzione della camera sia, durante l'esperimento, a livello, per impedire che la soluzione venga sparsa verso l'obiettivo a causa del sovraffollamento.
- Utilizzando la modalità campo luminoso, regolare il guadagno a 175 e il tempo di esposizione a 0,03 s per mettere a fuoco le celle.
- Una volta che le cellule sono focalizzate, passare alla modalità di fluorescenza utilizzando l'eccitazione di 488 nm. Cambiare il tempo di esposizione a 0,07 s. Individuare un campo di visualizzazione che dispone di cellule sufficienti che sono sane con una fluorescenza adeguata all'immagine.
- Una volta scelto un campo visivo, scattare foto in modalità fluorescenza e campo luminoso.
- Cerchi una regione di interesse (ROI) nelle cellule o cerchi la cella intera per registrare l'intensità dell'area scelta.
6. Imaging dei transitori Ca 2+ indotti da farmaci e di calibrazione in situ
- Avviare la misurazione dell'intensità con il frame rate impostato a ogni 5 s.
- Lasciare che l'intensità di base si stabilizzi per 20-30 fotogrammi (100-150 s). Se necessario, diminuisci il frDurante questa fase per prevenire la fotolibrazione.
- Calcolare la quantità di 4 cm c necessaria da uno stock di 20 mM in base al volume della camera finale di ~ 450 μL per ottenere una concentrazione finale di 200 μM. Fare diluizioni dello stock se necessario.
- Prendete con attenzione 60 μL di buffer di Ringer dalla camera e posizionati in un tubo di microcentrifuga. Diluire la quantità calcolata di 4 cmq con questa soluzione e riportare nuovamente alla camera per evocare la risposta prevista dalle cellule in scansione.
- Aggiungere la quantità calcolata di 4 cm al tubo di microcentrifuga e mescolare pipettando.
- Aggiungete delicatamente la soluzione sul campo visivo contemporaneamente aggiungendo l'indicatore di eventi nella misura dell'intensità.
- Lasciare tempo affinché il farmaco si leghi al recettore e successivamente diminuisca il segnale, quindi lavati con 3-6 ml di tampone Ringer con 1.8 mM Ca 2+ e 10 mM glucosio, contemporaneamente aggiungendo il marker di eventi. Poiché il volume della camera è di 450 &# 181; L ed è collegato ad un vuoto, aggiungendo 3-6 ml di tampone assicura che l'ex soluzione contenente il farmaco sia stata lavata via e sostituita con la nuova soluzione aggiunta.
- Ripetere 6.1-6.7 per 100 μM ATP e 15 μM CPA, utilizzando una nuova diapositiva di cellule trasfettate per ogni assaggio.
- Una volta completata la misurazione, terminare la raccolta dati nella finestra di misurazione dell'intensità nel programma Simple PCI.
- Prendi fluorescenza e immagini luminose delle cellule.
- Apri il file di dati per l'esperimento. Qui, ricircolare le cellule o regioni di interesse per ricalcolare i valori di intensità, se necessario.
- Per determinare la K d in situ nelle cellule miooblastiche C2C12, seguire il protocollo come descritto nella sezione 4.2 e sezione 5 e mettere 1 ml di 0 mM Ca 2+ Ringer's buffer nella camera.
- Permeabilizzare le cellule con 0,002-0,005% di saponina nel buffer intracellulare per 15-30 s per svuotare le cellule di qualsiasiCatchER + che può essere nel citosol. Lavare le cellule con 3-6 mL di 1 mL EGTA in buffer KCl con 10 μM ionomicina. Lasciare diminuire l'intensità fino a raggiungere un plateau.
- Sciacquare con 3-6 mL di buffer KCl con 10 μM di ionomicina e lasciare stabilizzare l'intensità, quindi aggiungere ogni soluzione Ca 2+ dettagliata nel punto 2.7. Consentire l'intensità di raggiungere un plateau tra ogni aggiunta.
- Per calibrare il sensore per la quantificazione basale [Ca 2+ ], seguire la fase 6.12. Utilizzare l'EGTA e il tampone Ca 2+ di 100 mM dalla fase 2.7 per ottenere l'intensità di fluorescenza minima e massima.
7. Elaborazione dei dati
- Scaricare il file del foglio di calcolo dei dati di misurazione dell'intensità.
- Normalizzare i dati per ogni cella all'intensità di base (F / F 0 ). Tracciare i dati normalizzati rispetto al tempo in qualsiasi programma di grafica.
- Per calcolare la variazione%, sottrarre la val di picco normalizzataUe da 1 e moltiplicare per 100. Calcolare la deviazione media e standard se sono state immagazzinate più celle.
- Per calcolare il rapporto segnale / rumore, SNR, aprire il file immagine salvato dall'esperimento in un software di elaborazione immagini, ad esempio ImageJ, e quindi misurare il segnale, le cellule trasfuse e il rumore, lo sfondo. Calcolare l'SNR utilizzando l'equazione SNR = segnale / rumore.
- Per calcolare l' in situ K d dai dati raccolti di dati di fluorescenza raccolti, mediate i dati di intensità, che comprendono gli altipiani, dopo l'aggiunta di ciascuna concentrazione di Ca 2+ e di EGTA (0 mM Ca 2+ ). Calcolare la saturazione frazionaria (intensità relativa) utilizzando θ = (F - F min ) / (F max - F min ) dove θ è l'intensità relativa, F è la fluorescenza in qualsiasi punto, F min è l'intensità minima di fluorescenza e F max è l'intensità massima di fluorescenza, per vedere la variazione dell'intensità di tSonda con l'aggiunta di Ca 2+ rispetto all'intensità minima. Tracciare i relativi dati di intensità nei confronti del [Ca 2+ ] in qualsiasi programma di montaggio curva e grafica. Utilizzare l'equazione di legame 1: 1 θ = [M T ] / (K d + [M T ]) tradotto per qualsiasi programma di grafica e curva per calcolare il K d . M T è la concentrazione totale del metallo.
- Per quantificare il calcio basale dalla calibrazione descritta al punto 6.13, mediare i dati di intensità, compresa gli altipiani, dopo l'aggiunta di 1 mM EGTA (F min ) e 100 mM Ca 2+ (Fmax). Utilizzare l'equazione di calibrazione [Ca 2+ ] = K d ([F - F min ] / (F max - F)] per calcolare il calcio basale.
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Representative Results
Questa sezione illustrerà i risultati ottenuti utilizzando i metodi precedentemente descritti usando il GECI CatchER + mirato ER / SR mirato per monitorare i cambiamenti in ER / SR Ca 2+ attraverso diversi percorsi mediati dal recettore.
La figura 1 illustra lo svuotamento ER attraverso il RyR stimolato con 200 μM di 4 cm. 4-cmc è un agonista del RyR. L'aggiunta del farmaco induce una diminuzione del calcio ER come misurato dalla diminuzione dell'intensità di fluorescenza di CatchER + . Come indicato, il protocollo qui descritto consente di visualizzare e misurare i transitori Ca 2+ mediati dal recettore utilizzando CatchER + che fornisce informazioni sulle modifiche di ER Ca 2+ .
Come illustrato nella figura 2 , l'aggiunta di 15 μM CPA, per bloccare reversibilmente la pompa SERCA, produce una notevole diminuzione dell'intensità di fluorescenza che forma un plateau. Poiché la funzione della pompa SERCA è inibita, i canali di rilascio ER Ca 2+ stanno ancora liberando attivamente Ca 2+ nel citosolo causando una diminuzione dell'intensità di fluorescenza. Le cellule recuperano dopo la lavaggio del CPA con il buffer di Ringer contenente 1,8 mM Ca 2+ e 10 mM di glucosio. Questi risultati confermano la capacità di CatchER + di monitorare i transitori Ca 2+ specifici della pompa SERCA.
La Figura 3 mostra dati rappresentativi per l'attivazione indiretta del IP 3 R con 200 μM ATP nelle cellule HEK293 trasfettate con CatchER + . L'ATP si lega al recettore P2Y, un recettore accoppiato a G-proteina, che genera IP 3 che attiva la rilascio di Ca 2+ attraverso l'IP 3 R. Anche se la modificaÈ piccolo, l'aggiunta di 200 μM ATP produce una diminuzione visibile dell'intensità del segnale. Il lavaggio delle cellule con il buffer di Ringer contenente 1,8 mM di Ca 2+ e 10 mM di glucosio consente all'ER di ricaricare e il segnale per tornare alla linea di base. Questi risultati evidenziano la capacità di CatchER + di monitorare il rilascio di calcio mediato da IP 3 R tramite stimolazione indiretta.
Nella figura 4 , CatchER + è stato trasfuso in cellule miooblasto C2C12 per determinare l' in situ K d . I dati sono stati raccolti come descritto nel protocollo. Le cellule miooblasto C2C12 sono state permeabilizzate con 0,005% di saponina per 15-30 s poi lavate con 1 mM EGTA in buffer KCl contenente 10 μM ionomicina. Le varie concentrazioni di Ca 2+ sono state preparate in tampone KCl contenente 10 μM ionomicina e sono state aggiunte in modo graduale. I dati sono stati normalizzati e montati utilizzando il legame 1: 1L'equazione. La media K d era di 3,1 ± 1,4 mM per 7 cellule. L'affinità debole di CatchER + permette di sentire Ca 2+ in organi Ca 2+ elevati come ER o SR. Per determinare il basale [Ca 2+ ] nelle SR, le cellule C2C12 sono state permeabilizzate con 0,005% di saponin per 15-30 s, lavate con tampone KCl e poi lavate con 1 mM EGTA in tampone KCl contenente 10 μM ionomicina per ottenere F min . Dopo aver lavato l'EGTA con un buffer KCl, è stato aggiunto un massimo di Fmax di 100 mM Ca 2+ con 10 μM ionomicina. Il basale Ca 2+ è stato calcolato per essere 0.4 ± 0.2 mM.
Figura 1: Stimolazione di RyR utilizzando 4-cmc nelle cellule HEK293. ( A ) Rappresentazione dell'attivazione di RyR con 4 cm. ( B ) Registrazione di intensità delle cellule HEK293Trasfettata con CatchER + , localizzata nell'ER, trattata con 200 μM di 4 cm. La stimolazione del RyR con 4 cmc provoca una diminuzione dell'intensità di fluorescenza normalizzata che direttamente correlata a una diminuzione di [Ca 2+ ] ER . N si riferisce al numero di celle immagazzinate. La diminuzione media del segnale è stata di 12,0 ± 2,2%. La presenza di 1,8 mM Ca 2+ nel tampone di Ringer ha facilitato il riempimento della ER riflessa nel recupero di intensità alla linea di base. Le immagini insetiche mostrano le cellule prima e dopo il trattamento con 4 cm. La SNR è stata calcolata per essere 4.3 ± 0.8. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Diminuzione di [Ca 2+ ] ER utilizzando il SERCA p. ReversibileInibitore CPA in cellule HEK293. ( A ) L'inibizione della pompa SERCA da CPA. ( B ) L'imaging in diretta di cellule HEK293 trasfettate con CatchER + , localizzate nell'ER, trattate con 15 μM CPA. Poiché Ca 2+ può ancora fluire attraverso l'IP 3 R e RyR, bloccando la pompa SERCA con CPA provoca una diminuzione dell'intensità di fluorescenza normalizzata che direttamente correlata a una diminuzione di [Ca 2+ ] ER . N si riferisce al numero di celle immagazzinate. Le immagini insetti sono le cellule HEK293 trasfettate con CatchER + prima e dopo il trattamento. La diminuzione media del segnale è stata di 21,0 ± 0,3%. La presenza di 1,8 mM Ca 2+ nel tampone di Ringer ha facilitato il riempimento della ER riflessa nel recupero di intensità alla linea di base. La SNR è stata calcolata per essere di 5,5 ± 0,8. Clicca qui per visualizzare una versione più grande diquesta figura.
Figura 3: ATP diminuisce [Ca 2+ ] ER nelle cellule HEK293. ( A ) Schema dell'attivazione indiretta di IP 3 R con ATP attraverso il recettore purinergico P2YR. P2YR è un GPCR che genera IP 3 quando si lega ATP. L'IP 3 attiva l'IP 3 R, stimolando il rilascio del calcio dalla ER. ( B ) Imaging in tempo reale di cellule HEK293 trasfettate con CatchER + , localizzate nell'ER, trattate con 200 μM ATP. La stimolazione indiretta dell'IP 3 R attraverso il recettore P2Y con ATP provoca una diminuzione dell'intensità di fluorescenza normalizzata che direttamente correlata a una diminuzione di [Ca 2+ ] ER . N si riferisce al numero di celle immagazzinate. La diminuzione media del segnale è stata di 6,0 ± 3,0%. SNR era cAlcullato per essere 6.7 ± 2.7. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: In situ K d di CatchER + in cellule miooblasto C2C12. Traccia rappresentativa per l'intensità normalizzata raccolta da cellule miooblasto C2C12 permeabilizzate trasfettate con CatchER + . Le cellule sono state permeabilizzate con saponina 0,005% in tampone intracellulare per 15-30 s. Le soluzioni EGTA e Ca 2+ sono state preparate in tampone KCl, n si riferisce al numero di cellule immagazzinate. ( A ) Le immagini di fluorescenza insetiche rappresentano le cellule prima e dopo il trattamento. 0,3, 0,6, 2, 5, 10, 20, 50 e 100 mM Ca 2+ è stato aggiunto alle cellule miooblasto C2C12 permeabilizzate in presenza di 10 μMIonomicina per ottenere un K d di 3,1 ± 1,4 mM. ( B ) Le immagini di fluorescenza in insetto rappresentano le cellule a valori minimi e massimi, dopo l'aggiunta di 1 mM EGTA e 100 mM Ca 2+ rispettivamente con 10 μM ionomicina. Il basale Ca 2+ è stato calcolato per essere 0.4 ± 0.2 mM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
L'imaging a cellule singole di sonde fluorescenti, come CatchER + , è una tecnica efficace per analizzare i processi di segnalazione intrinsecamente ER / SR Ca 2+ in ogni cellula in risposta a agonisti o antagonisti del recettore. Questa tecnica è utile anche per l'imaging utilizzando più lunghezze d'onda contemporaneamente, come è necessario per Fura-2 o per l'immagine CatchER + e Rhod-2 insieme per monitorare rispettivamente i cambiamenti di calcio ER e citosolici. Ci sono diversi passi critici in questo protocollo; La transfezione cellulare può avere un grande effetto sulla vitalità dell'immagine. I bassi tassi di trasfezione possono portare ad un'espressione insufficiente del GECI per il monitoraggio delle risposte al calcio. D'altra parte, l'eccessiva espressione di CatchER + non avrà un effetto bufferizzante su ER / ER Ca 2+ , un problema associato a coloranti sintetici di calcio. Gli effetti di tampone delle sonde Ca 2+ sono influenzati dal [Ca 2+ ] nell'organelle, il K d del pAbbigliamento e la concentrazione della sonda richiesta per la misurazione. Citocholic [Ca 2+ ] è tipicamente nella gamma bassa nanomolar, tuttavia, la concentrazione necessaria della sonda è in una gamma comparabile. In questo caso, la quantità di concentrazione di tinture e la sua capacità di tamponare il calcio citosolico era e rappresenta una preoccupazione importante per l'imaging cellulare. Al contrario, ER / SR [Ca 2+ ] si trova nel 100s di gamma micromolare a millimola 31 come abbiamo determinato per diverse linee di cellule mammiferi 25 . Poiché l'espressione di CatchER + da 0,1-1 μM è sufficiente per consentire la rilevazione del calcio ER, l'effetto di bufferizzazione di CatchER è trascurabile. Così, CatchER + può monitorare il flusso di Ca 2+ in ambienti ad alta [Ca 2+ ] senza alcun effetto di buffering sulla luminal ER / SR Ca 2+ 32 .
Diversi fattori possono influenzare l'efficienza di transfection del GECI come il tempo di incubazione, thIl reagente di transfection, la temperatura di incubazione e la confluenza cellulare. La confluenza delle cellule, quando seminano le cellule sulla diapositiva, possono influenzare in modo significativo la qualità dell'immagine. La bassa confluenza può portare a un numero minore di cellule (n) e meno accuratezza statistica, mentre elevati livelli di confluenza portano a strati sovrapposti di cellule che producono variabili di grandi dimensioni nell'immagine. L'ora e la temperatura per la trasfezione devono essere ottimizzati in base al tipo di cellula. Inoltre, l'aggiunta di DMEM con supporti serici ridotti è ottimale per tempi di transfezione più lunghi per prevenire l'apoptosi. La fluorescenza originale di GECI CatchER nelle cellule di mammiferi, quando è stata colta e transfettata, era solo 30 ° C. La fluorescenza di CatchER è stata ottimizzata e migliorata con successo per l'espressione a 37 ° C, con conseguente nuova, migliorata variante CatchER + . È possibile eseguire una macchia Western utilizzando un anticorpo contro EGFP per confermare l'espressione della sonda Ca 2+ .
Inoltre, ioLa consistenza e la consistenza della fornitura del reagente è fondamentale. I reagenti possono essere aggiunti alla camera da perfusione, da piccole diffusioni di volume o da pompe meccaniche, che possono provocare risposte diverse. È indispensabile che la camera di soluzione sia correttamente sigillata applicando uno strato di grasso sigillante sul fondo della camera che sarà posizionato sullo scivolo. Per la sonda devono essere selezionate le lunghezze d'onda corrette. Le lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione per CatchER + sono rispettivamente 395/488 nm e 510 nm. Per l'imaging delle cellule, solo 488 nm viene utilizzato per l'eccitazione per evitare l'effetto dannoso della luce UV sulle cellule. Pertanto, utilizzare tutti i filtri ottici che eccitano a 488 nm e raccogliere l'emissione a 510 nm sarebbe accettabile per l'utilizzo con l'immagine con CatchER + . Per prevenire la fotolibrazione, gli sforzi possono essere focalizzati per ottimizzare l'intensità della luce e l'esposizione della luce, ad esempio i fotogrammi 33 .
Mentre questo protocollo è l'ideale per analizzare l'effEct delle modifiche ER / SR utilizzando la sonda fluorescente CatchER + Ca 2+ ER / SR, ci sono limitazioni come previsto in ogni esperimento. Poiché l'imaging live in una sola cellula analizza solo un piccolo fotogramma delle cellule, il numero di cellule (n) può variare da 1 a 100 celle in media, ma può essere inferiore per le più grandi linee cellulari. Ciò porta a numeri di celle inferiori e risultati statisticamente variabili senza prove multiple. Un n> 6 è richiesto per l'accuratezza statistica. Per ottenere una maggiore n, molti piatti devono essere imaged o altre tecniche devono essere utilizzati, contemporaneamente. Inoltre, CatchER + è una singola sonda di lunghezza d'onda ER / SR Ca 2+ , questo porta alle emissioni di altre sonde e tinte di lunghezza d'onda singola, non essendo in grado di quantificare il segnale, non sapendo se il segnale è vero, opposto alla rottura delle cellule Artefatto e con rumore maggiore rispetto ai sistemi ratiometrici 34 .
Questo lavoro mostra che queste sonde ottimizzate Ca 2+ possonoEssere applicato in diversi tipi di cellule o tipi di tessuto per monitorare il recettore mediato ER / SR Ca 2+ rilascio. CatchER + è una singola sonda di lunghezza d'onda ER / SR Ca 2+ . Pertanto, è importante che i parametri e le impostazioni sperimentali siano coerenti per la misurazione quantitativa. Una calibrazione dettagliata della concentrazione di calcio e K d del sensore di calcio nelle linee cellulari sono ulteriori misurazioni importanti per l'analisi quantitativa.
Questi sviluppati sensori di calcio possono anche essere mirati a posizioni specifiche all'interno dell'ER / SR per monitorare i transienti Ca 2+ molto diversi rispetto ai cambiamenti Ca 2+ globali in varie condizioni biologiche e patologiche. Questi risultati continueranno a spingere i campi della progettazione di immagini e di sonde Ca 2+ in avanti per fornire strumenti futuri per la diagnosi di malattie legate alla Ca 2+ . I protocolli riportati e il sensore sviluppato possono anche essere adattati per la droga dDisturbi contro le malattie associate alla segnalazione di calcio.
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Disclosures
Gli autori non hanno niente da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato da NIH GM62999, NIH EB007268, NIH AG15820, B & B Seed Grant e un Supplemental Grant NIH a FR, borsa di BB a CM, borsa CDT a RG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-Chloro-3-methylphenol (4-CmC) | Sigma-Aldrich | C55402 | |
| 515DCXR dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | NC338059 | |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| Calcium chloride dihydrate | EMD Millipore | 102382 | |
| Corning tissue-culture treated culture dishes (100 mm) | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
| Corning tissue-culture treated culture dishes (60 mm) | Sigma-Aldrich | CLS430166 | |
| Cyclopiazonic Acid (CPA) | EMD Millipore | 239805 | |
| D(+)-Glucose | ACROS Organics | 41095-0010 | |
| Dow Corning 111 Valve Lubricant & Sealant | Warner Instruments | 64-0275 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D7777 | |
| Ethylenebis(oxyethylenenitrilo) tetraacetic Acid (EGTA) |
ACROS Organics | 409911000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher | 26140087 | |
| Fisherbrand Cover Glasses 22x40 mm | Fisher Scientific | 12-544B | |
| Hanks’ Balanced Salts (HBSS) | Sigma-Aldrich | H4891 | |
| HEPES, Free Acid, Molecular Biology Grade | EMD Millipore | 391340 | |
| Immersion Oil without autofluorescence | Leica | 11513859 | |
| Ionomycin, Free Acid | Fisher Scientific | 50-230-5804 | |
| Leica DM6100B inverted microscope with a cooled EM-CCD camera | Hamamatsu | C9100-13 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher | 11668019 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | ThermoFisher | L3000015 | |
| Low Profile Open Diamond Bath Imaging Chamber | Warner Instruments | RC-26GLP | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Fisher Scientific | M33-500 | |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 51985034 | |
| Potassium Chloride | EMD Millipore | PX1405 | |
| Potassium Phosphate, Dibasic | EMD Millipore | PX1570 | |
| Potassium Phosphate, Monobasic | EMD Millipore | PX1565 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| SimplePCI Image Analysis Software | Hamamatsu | N/A | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-3 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sterivex-GV 0.22 µm filter | EMD Millipore | SVGVB1010 | |
| Till Polychrome V Xenon lamp | Till Photonics | N/A | |
| Trypsin (2.5%), no phenol red (10x) | ThermoFisher | 15090046 |
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