Summary
Vi presenterer protokoller for bruk av vår målrettede, genetisk kodede kalsiumindikator (GECI) CatchER + for overvåkning av hurtige kalsiumtransienter i det endoplasmatiske / sarkoplasmiske retikulum (ER / SR) av HEK293 og skjelettmuskulatur C2C12-celler ved bruk av sanntids fluorescensmikroskopi. En protokoll for in situ K d måling og kalibrering diskuteres også.
Abstract
Intracellulære kalsium (Ca 2+ ) transienter fremkalt av ekstracellulære stimuli initierer en rekke biologiske prosesser i levende organismer. I midten av intracellulær kalsiumfrigivelse er de viktigste intracellulære kalsiumlagringsorganeller, endoplasmatisk retikulum (ER) og mer spesialisert sarkoplasmisk retikulum (SR) i muskelceller. Den dynamiske frigjøringen av kalsium fra disse organeller formidles av ryanodinreseptoren (RyR) og inositol 1,4,5-trifosfatreceptor (IP 3 R) med påfylling som skjer via sarco / endoplasmatisk retikulumkalsium ATPase (SERCA) -pumpen. En genetisk kodet kalsiumsensor (GECI), kalt CatchER, ble opprettet for å overvåke hurtig kalsiumfrigivelse fra ER / SR. Her er de detaljerte protokollene for transfeksjon og ekspresjon av den forbedrede, ER / SR-målrettede GECI CatchER + i HEK293- og C2C12-celler og dens anvendelse i overvåking av IP 3 R, RyR og SERCA-pumpemidlet kalsiumtransientS i HEK293-celler ved bruk av fluorescensmikroskopi er skissert. Reseptoragonisten eller inhibitoren som er valgt, dispergeres i kammerløsningen, og intensitetsendringene registreres i sanntid. Med denne metoden blir en reduksjon i ER-kalsium sett med RyR-aktivering med 4-klor-m-kresol (4 cm), den indirekte aktiveringen av IP 3 R med adenosintrifosfat (ATP) og inhibering av SERCA-pumpen med cyklopiazon Syre (CPA). Vi diskuterer også protokoller for å bestemme in situ K d og kvantifisere basal [Ca 2+ ] i C2C12-celler. I sammendraget kan disse protokollene, brukt i forbindelse med CatchER + , fremkalle reseptormediert kalsiumfrigivelse fra ER med fremtidig anvendelse ved å studere ER / SR kalsiumrelaterte patologier.
Introduction
De spatio-temporale egenskapene til intracellulære kalsium (Ca 2+ ) transienter aktiverer ulike biologiske funksjoner 1 . Disse Ca 2+ signaleringshendelsene utløses ekstracellulært gjennom forskjellige stimuli og kontrolleres intracellulært av den store Ca 2+ lagringsorganelle og ved en rekke Ca 2+ pumper, kanaler og Ca 2+ bindingsproteiner. Ca 2+ transienter kan endres vesentlig som følge av defekter med signalmodulasjon, som fører til forskjellige sykdommer 2 . På grunn av hastigheten og kompleksiteten til Ca 2+ -signaleringssystemet, med endo- (ER) og sarkoplasmisk retikulum (SR) i midten, er det nødvendig med genetisk kodede Ca 2+ -prober som er optimalisert for pattedyrsuttrykk med hurtig kinetikk. Å observere globale og lokale Ca 2+ endringer i forskjellige celler 3 .
ER og SR, Dens motstykke i muskelceller, er de viktigste intracellulære Ca 2+ lagringsorganeller og fungerer som Ca 2+ vasker som bidrar til å forsterke Ca 2+ -signalet 4 . ER / SR er en integrert del i Ca 2+ -signalering med to roller som en sender og mottaker av signaler 5 . Ryanodinreseptoren (RyR) og inositol 1,4,5-trifosfatreceptoren (IP 3 R) er Ca 2+ -frigjøringsreceptorer lokalisert på membranene i ER / SR som er regulert av Ca 2+ 6 . Andre midler stimulerer direkte eller indirekte funksjonen til disse reseptorene. 4-klor-m-kresol (4-cmc) er en kraftig agonist av RyR, som har en 10 ganger høyere følsomhet enn koffein for å indusere SR Ca 2+ -frigjøring der begge regelmessig benyttes til å studere RyR-mediert Ca 2+ -frigjøring i Friske og syke celler 7 . ATP øker IP 3- mediert Ca 2+ reLeie gjennom IP 3 R 8 . ATP binder til den purinergreceptor P2YR, en G-proteinkoblet reseptor (GPCR), som utløser produksjonen av IP 3 som binder til IP 3 R for å frigjøre Ca 2+ fra ER 9 , 10 . Seraco-endoplasmatisk retikulumkalsium ATPase (SERCA) -pumpen er en P-type ATPase-pumpe, også lokalisert på ER / SR-membranen som reduserer cytosolisk Ca 2+ og fyller ER / SR ved aktivt å pumpe ionet i ER / SR lumen 11 . Spesifikke hemmere av SERCA-pumpen inkluderer thapsigargin, fra Thapsia garganica , og cyklopiazonsyre (CPA), fra Aspergillus og Penicillium . CPA har lav affinitet for pumpen og blokkerer reversibelt Ca 2+ tilgangspunktet 12 . Thapsigargin, derimot, binder irreversibelt til Ca 2+ fri pumpe ved rest F256 i M3-helixen med nanomolAr affinitet 11 . Analysere og kvantifisere endringene som er involvert i Ca 2+ stimulerte hendelser har vært og forblir en utfordring. Siden ER / SR er det store subcellulære Ca 2+ -holdige rommet med en sentral funksjon i utbredelsen av Ca 2+ -signalet, har mye arbeid vært fokusert på å forstå ER / SR Ca 2+ -signalering 5 .
Opprettelsen av syntetiske Ca 2+ fargestoffer bidro til å fremme feltet og praksis av Ca 2+ -bildebehandling. Selv om fargestoffer, som Mag-Fura-2, har vært mye brukt til å måle compartmentalized Ca 2+ i forskjellige celler, har 13 , 14 , 15 de begrensninger som ujevn fargestoffbelastning, fotoblekking og manglende evne til å målrettes mot bestemte organeller . Oppdagelsen av det grønne fluorescerende protein (GFP) og fremskriden av fluorescerende protein-Baserte Ca 2+ -prober har drevet feltet Ca 2+ avbildning fremover 16 . Noen av de eksisterende GECIene er Förster resonans energioverføring (FRET) par som involverer gul fluorescerende protein (YFP), cyan fluorescerende protein (CFP), calmodulin og M13 bindende peptid 17 , 18 . Troponin C-baserte GECI er også tilgjengelige som FRET-par CFP og Citrine og som enkeltfluoroforprober 19 , 20 , 21 . Andre, som GCaMP2 og R-GECO, er single fluorophore sensorer som involverer calmodulin 22 , 23 . For å overvinne begrensningene for smal innstilling av Kd 's og kooperativ binding assosiert med flere Ca2 + bindingssteder funnet i deres Ca2 + bindende domener 24 , en ny klasse av kalsium senSors ble opprettet ved å designe et Ca 2+ bindingssted på overflaten av beta-fatet i en kromofore-følsom plassering av forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP) 25 , 26 . Denne høyt opplyste sensoren, kalt CatchER, har en Kd på ~ 0,18 mM, ak på nær diffusjonsgrensen, og ak off av 700 s -1 . CatchER har blitt brukt til å overvåke reseptormediert ER / SR kalsiumfrigivelse i forskjellige pattedyrcellelinjer som HeLa, HEK293 og C2C12 25 . På grunn av sin hurtige kinetikk ble CatchER brukt i flexor digitorum brevis (FDB) muskelfibre av unge og gamle Friend Virus B NIH Jackson (FVB) mus for å avsløre at mer Ca 2+ forblir i SR etter 2 s av depolarisering i FDB Fibre av gamle mus sammenlignet med unges mus 27 . For å overvinne sin lave fluorescens ved 37 ° C, som hindrer dets anvendelser ved kalsiumbilding av pattedyrCeller, har vi utviklet en forbedret versjon av CatchER kalt CatchER + . CatchER + utviser forbedret fluorescens ved 37 ° C for bedre anvendelse i pattedyrceller. Ytterligere mutasjoner ble innlemmet i CatchER for å forbedre termostabiliteten og fluorescensen ved 37 ° C 28 , 29 , for å skape CatchER + . CatchER + utviser en seks ganger økning i signal-støy-forholdet (SNR) over CatchER 30 .
Her presenteres protokollene for kulturen og transfeksjonen av HEK293- og C2C12-celler med CatchER + og dens anvendelse for overvåking av ER / SR-reseptormedierte kalsiumtransienter. Representative resultater vises for CatchER + uttrykt i HEK293-celler behandlet med 4-cmc, CPA og ATP. Vi gir også en protokoll for å bestemme in situ K d av CatchER + i C2C12 myoblastceller og quaNtifisering av basal [Ca 2+ ].
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Skyv forberedelse
- Plasser 22 mm x 40 mm glassmikroskopriller i 6 cm cellekulturretter, 1 lysbilde per fat.
- Utsett hver side av hvert lysbilde samt 6 cm tallerken til ultrafiolett (UV) lys i 15-20 minutter for sterilisering i en steril hette.
- Tørk opp servantene med lysbilder på innsiden med parafilm og lagre ved 4 ° C til bruksklar.
2. Fremstilling av medier, buffere, løsninger og reagenser
- Forbered 1 L av Hank balansert saltløsning (HBSS) i avionisert vann og tilsett 10 mM HEPES, 5 mM NaHCO 3 og 1 mM EGTA. Juster til pH 7,2-7,3 med NaOH. Filterbuffer med et 0,22 μm filter i en autoklavert flaske.
- Forbered 900 ml høy glukose Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) h i avionisert vann. Tilsett 44 mM NaHCO3 og juster pH til 7,2-7,3 med HC1. Filter media med et 0,22 μm filter i en autoklavert flaske. Tilsett 100 ml føtalt boviNe-serum (FBS) til media for å gjøre FBS-konsentrasjonen 10%. Oppbevar ved 4 ° C.
- Tilbered 1 liter intracellulær buffer (125 mM KCl, 25 mM NaCl, 10 mM HEPES, 0,2 mM CaCl2, 0,5 mM EGTA, 0,2 mM MgCl2) i avionisert vann og juster pH til 7,25. Den endelige [Ca 2+ ] vil være ~ 100 nM. Før bruk, tilsett 0,5 mM ATP. Oppbevares ved romtemperatur.
- Fremstill 1 l Ringer buffer (121 mM NaCl, 2,4 mM K 2 HPO 4 , 0,4 mM KH 2 PO 4 , 10 mM HEPES og 1,2 mM MgCl 2 ) i avionisert vann og juster pH til 7.2. Oppbevares ved romtemperatur. Til bruk, alikvot 50 ml i et 50 ml rør og tilsett 1,8 mM Ca 2+ og 10 mM glukose.
- Tilbered 1 liter KCl skylløsning (125 mM KCl, 25 mM NaCl, 10 mM HEPES, 0,2 mM MgCl2) i avionisert vann og juster pH til 7,25.
- Oppløs 5 mg ionomycin i 1 ml dimetylsulfoksid (DMSO). Aliquot 30 μL i mikrotubes og lagre ved -206; C.
- Klargjør syklopiazonsyre (CPA) lager ved å oppløse CPA i DMSO. Pass på at den endelige prosenten av DMSO er ≤ 1% for CPA tilsatt til cellene for å forhindre apoptose. Tilbered 20 mM 4-klor-m-kresol (4 cm) ved å oppløse i filtrert H20 og la det oppløse seg over natten ved risting ved 37 ° C. Forbered ATP-stammen ved å oppløse i filtrert H20 til 100 mM.
- For å bestemme in situ Kd, lag 15 ml hver av 1 mM EGTA, 0,2 mM, 0,6 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM, 50 mM og 100 mM Ca 2+ i KCl-buffer ved bruk av en 100 MM EGTA-lager og en 1 M CaCl 2- stamme oppløst i avionisert vann.
3. Cellekultur
- Kultur C2C12 myoblast- og HEK293-celler i henhold til ATCC-protokollene for hver ved bruk av 10 cm cellekulturretter i en steril UV-hette.
MERK: C2C12-celler bør ikke få lov til å vokse høyere enn ~ 70% sammenløp siden myoblastene vil begynne å differensiereTe i myotubes. Både HEK293 og C2C12 celler vokser lett og bør ikke få lov til å vokse forbi 100% konfluens for å opprettholde celleintegriteten. I tillegg bør cellene ikke passeres mer enn 10 ganger før de brukes til et forsøk for å bevare cellehelsen.
4. Transfeksjon av HEK293-celler
- Plasser HEK293-celler på steriliserte 22 mm x 40 mm glassmikroskopriller i 6 cm-retter slik at de er ~ 70% sammenføyende transfeksjonsdagen.
- Neste dag følger produsentens protokoll for transfeksjonsreagenset for å transfektere celler ved bruk av 2 μg CatchER + cDNA og et 1: 3 (vekt / volum) DNA-transfeksjonsreagensforhold i reduserte serummedier ( f.eks. Opti-MEM).
- Tøm DMEM-mediet fra parabolen, og legg til 3 ml redusert serummedium. Tilsett DNA: transfeksjonsreagensblanding i parabolen og inkuber i 4-6 timer ved 37 ° C.
- Etter inkubering vaskes cellene med 5-6 ml HBSS. Kast HBSS fRett opp retten og erstatt med 3 ml frisk DMEM og inkuber dem ved 37 ° C i 48 timer for å tillate ekspresjon av GECI.
- Transfeksjon av C2C12 myoblastceller
- For C2C12 myoblastceller trypsiniserer celler ved å legge til nok trypsin til å dekke bunnen av parabolen (1-2 ml). Plasser fatet i en 37 ° C inkubator i 2-6 minutter for å la trypsinet løsne cellene fra bunnen av fatet.
- Når inkubasjonen er fullført, fjern trypsinet og aspirer cellene i 8 ml DMEM. Pipetter cellene grundig med DMEM for å jevnere dispergere og re-suspendere teceller og frø dem på sterile dekselglass i 6 cm cellekulturretter som inneholder 3 ml DMEM slik at sluttkonfluensen er 60%.
- Transfekter cellene samme dag som skissert i trinn 4.2-4.3. Inkuber i 24 timer ved 37 ° C.
- Gjenta trinn 4.4.
5. Fremstilling av slide og fluorescensmikroskop
- Slå på mMikroskop og lyskilde, og åpne deretter det enkle PCI-programmet. La mikroskopet varme opp i 15-20 minutter eller til kameraet til ladetilkoblet (CCD) kjøler til -65 ° C. Klargjør kammeret og skyv med celler mens du venter.
- Dekk bunnen av lavprofilen med åpent diamantbad med et tynt lag av tetningsmasse, med en bomullspinne.
- Ta lysbildet som inneholder transfekterte celler ut av inkubatoren og skyll forsiktig tre ganger med 1 ml Ringer-buffer med 10 mM glukose og 1,8 mM Ca 2+ forvarmet til 37 ° C.
- La 1 ml Ringer-buffer i oppvasken, for å hindre at celler tørker, og bruk tanger for å ta lysbildet ut av parabolen. La overflødig løsning absorbere på et laboratorievev ved å berøre kanten av lysbildet til et laboratorievev. Deretter legger du på kammerets side som inneholder fettet, med celler som vender opp mot fett og sikker kammer på scenemonteringen med en skrutrekker.
- Legg til 1ML av Ringers buffer til kammeret for å hindre at celler tørker mens kammeret monteres på scenen og fullfører resten av mikroskopoppsettet. Når vakuumsugeslangen er festet til kammeret, er det endelige volumet i kammeret ~ 450 μL.
- Bytt mikroskop objektivet til 40X olje nedsenkingsmål.
- Bruk linsepapir og rengjøringsmiddel for linser til å rengjøre og tørke objektivet. Ikke gni målet. Dekk forsiktig til overflaten er ren.
- Legg til en dråpe av nedsenkningsoljen til målet.
- Plasser fjellet på mikroskopetrinnet og legg vakuumspissen til kammeret. Når vakuumsugeslangen er festet til kammeret og slått på, er det endelige volumet som kammeret holder, ~ 450 μL. Dette siste volumet er nivå med kammerets sider. Det er viktig at kammeløsningen er nivå under forsøket for å forhindre at løsningen sprer seg ned i målet på grunn av overfylling.
- Bruk lysfeltmodusen, juster forsterkningen til 175 og eksponeringstiden til 0,03 s for å fokusere cellene.
- Når celler er fokusert, bytt til fluorescensmodus ved hjelp av 488 nm excitasjon. Endre eksponeringstiden til 0,07 s. Finn et synsfelt som har nok celler som er sunne med tilstrekkelig fluorescens til bildet.
- Når et synsfelt er valgt, ta bilder i fluorescens og lyse feltmodus.
- Sirkle en region av interesse (ROI) i cellene eller sirkel hele cellen for å registrere intensiteten fra det valgte området.
6. Imaging Drug-induced Ca 2+ Transients and In Situ K d Kalibrering
- Start intensitetsmåling med bildefrekvens satt til en hver 5. s.
- Tillat at baselineintensiteten stabiliseres for 20-30 rammer (100-150 s). Om nødvendig, senk frAmes / s under dette trinnet for å forhindre photobleaching.
- Beregn mengden 4 cmc som trengs fra en 20 mM stamme basert på sluttkammervolumet på ~ 450 μL for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 200 μM. Lag fortynninger av lageret etter behov.
- Ta forsiktig 60 μL Ringers buffer fra kammeret og sett i et mikrocentrifugerør. Fortynn den beregnede mengden 4 cm med denne løsningen og legg tilbake til kammeret for å fremkalle ønsket intensjon fra cellene som blir avbildet.
- Tilsett beregnet mengde 4 cm til mikrocentrifugerøret og bland ved pipettering.
- Legg forsiktig løsningen over synsfeltet samtidig som du legger til hendelsesmarkøren i intensitetsmåling.
- Tillat tid for medikamentet å binde til reseptoren og påfølgende signalreduksjon, vask deretter med 3-6 ml Ringers buffer med 1,8 mM Ca 2+ og 10 mM glukose samtidig som man tilføyer hendelsesmarkøren. Siden kammervolumet er 450 &# 181; L og er koblet til et vakuum, og tilsetting av 3-6 ml buffer sikrer at den tidligere oppløsningen som inneholder medikamentet er blitt vasket bort og erstattet med den nylig tilsatte løsningen.
- Gjenta 6,1-6,7 for 100 μM ATP og 15 μM CPA, ved bruk av et nytt lysbilde av transfekterte celler for hvert assay.
- Når målingen er fullført, avslutt datainnsamlingen i intensitetsmålingvinduet i Simple PCI-programmet.
- Ta fluorescens og lysfeltbilder av cellene.
- Åpne datafilen for eksperimentet. Her omkirkulerer du cellene eller områdene av interesse for å regne ut intensitetsverdiene, om nødvendig.
- For å bestemme in situ K d i C2C12 myoblastceller, følg protokollen som angitt i avsnitt 4.2 og avsnitt 5 og sett 1 ml 0 mM Ca 2+ Ringers buffer i kammeret.
- Permeabiliser cellene med 0,002-0,005% saponin i intracellulær buffer i 15-30 s for å tømme cellene av noeCatchER + som kan være i cytosol. Vask cellene med 3-6 ml 1 ml EGTA i KCl buffer med 10 μM ionomycin. La intensiteten minke til et platå er nådd.
- Skyll med 3-6 ml KCl-buffer med 10 μM ionomycin og la intensiteten stabilisere seg, og tilsett deretter hver Ca 2+ -løsning som er detaljert i trinn 2.7. Tillat intensiteten å nå et platå mellom hver tillegg.
- For å kalibrere sensoren for basal [Ca 2+ ] kvantifisering, følg trinn 6.12. Bruk EGTA og 100 mM Ca 2+ -bufferen fra trinn 2.7 for å oppnå minimum og maksimum fluorescensintensitet.
7. Databehandling
- Last ned regnearkfilen til intensitetsmålingsdataene.
- Normaliser dataene for hver celle til baseline intensiteten (F / F 0 ). Plot de normaliserte dataene mot tiden i et hvilket som helst grafikkprogram.
- For å beregne% endringen trekker du den normaliserte toppvalenUe fra 1 og multiplisere med 100. Beregn gjennomsnittlig og standardavvik dersom flere celler ble avbildet.
- For å beregne signalet til støyforholdet, åpner SNR den bildefilen som er lagret fra eksperimentet i en bildebehandlingsprogramvare, for eksempel ImageJ, og måler signalet, transfekterte celler og støy, bakgrunn. Beregn SNR ved hjelp av ligningen SNR = signal / støy.
- For å beregne in situ Kd fra de samlede fluorescensbildningsdataene, gjennomsnittlig intensitetsdataene, omfattende platåene, etter tilsetningen av hver Ca 2+ konsentrasjon og EGTA (0 mM Ca 2+ ). Beregn brøkmetningen (relativ intensitet) ved hjelp av θ = (F - F min ) / (F max - F min ), hvor θ er den relative intensiteten, F er fluorescensen på et hvilket som helst punkt, F min er den minste fluorescensintensiteten, og F max er maksimal fluorescensintensitet, for å se endringen i intensiteten til tHan probe med tilsetning av Ca 2+ i forhold til minimum intensiteten. Plot de relative intensitetsdataene mot [Ca 2+ ] i et hvilket som helst grafikk- og kurvepasseprogram. Bruk 1: 1 bindingsligningen θ = [M T ] / (K d + [M T ]) oversatt for et hvilket som helst grafikk og kurvepassingsprogram for å beregne K d . M T er den totale metallkoncentrasjonen.
- For å kvantifisere det basale kalsiumet fra kalibreringen beskrevet i 6.13, gjennomsnittlig intensitetsdataene, omfattende platåene, etter tilsetning av 1 mM EGTA (Fmin) og 100 mM Ca 2+ ( Fmax ). Bruk kalibreringsligningen [Ca 2+ ] = K d ([F - F min ) / (F max - F)] for å beregne basalt kalsium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne delen vil illustrere resultatene som ble oppnådd ved hjelp av de tidligere beskrevne metodene ved å bruke den optimaliserte ER / SR-målrettede GECI CatchER + for å overvåke endringer i ER / SR Ca 2+ gjennom forskjellige reseptormedierte veier.
Figur 1 illustrerer ER tømming gjennom RyR stimulert med 200 μM 4 cmc. 4-cmc er en agonist av RyR. Tilsetning av medikamentet induserer en reduksjon i ER kalsium målt ved reduksjonen i CatchER + fluorescensintensiteten. Som markert tillater protokollen som er skissert her, visualisering og måling av reseptormedierte Ca 2+ transienter ved bruk av CatchER + som gir informasjon om endringene i ER Ca 2+ .
Som vist i figur 2 , er tilsetningen av 15 μM CPA, for å reversibelt blokkere SERCA-pumpen, gir en stor reduksjon i fluorescensintensiteten som danner et platå. Da funksjonen til SERCA-pumpen er inhibert, frigjør ER Ca 2 + -utgivelseskanalerne aktivt Ca 2+ i cytosolen og forårsaker at fluorescensintensiteten reduseres. Cellene gjenvinnes etter vasking av CPA vekk med Ringers buffer inneholdende 1,8 mM Ca 2+ og 10 mM glukose. Disse resultatene bekrefter CatchER + evne til å overvåke Ca 2+ transienter som er spesifikke for SERCA-pumpe.
Figur 3 viser representative data for den indirekte aktiveringen av IP 3 R med 200 μM ATP i HEK293-celler transfektert med CatchER + . ATP binder til P2Y-reseptoren, en G-proteinkoblet reseptor, som genererer IP 3 som aktiverer Ca 2+ -frigjøring gjennom IP 3 R. Selv om endringenEr liten, gir tilsetningen av 200 μM ATP en synlig reduksjon i signalintensitet. Vasking av cellene med Ringers buffer inneholdende 1,8 mM Ca 2+ og 10 mM glukose gjør at ER kan refillere og signalet går tilbake til baseline. Disse resultatene markerer evnen til CatchER + til å overvåke IP 3 R-mediert kalsiumfrigivelse gjennom indirekte stimulering.
I figur 4 ble CatchER + transfektert inn i C2C12 myoblastceller for å bestemme in situ Kd. Dataene ble samlet inn som beskrevet i protokollen. C2C12 myoblastceller ble permeabilisert med 0,005% saponin i 15-30 s, deretter vasket med 1 mM EGTA i KCl-buffer inneholdende 10 μM ionomycin. De forskjellige Ca 2+ konsentrasjonene ble fremstilt i KCl buffer inneholdende 10 uM ionomycin og ble tilsatt på en trinnvis måte. Dataene ble normalisert og montert ved bruk av 1: 1 bindingenIng ligningen. Gjennomsnittlig Kd var 3,1 ± 1,4 mM for 7 celler. Den svake affiniteten til CatchER + tillater det å påvise Ca 2+ i høy Ca 2+ organeller som ER eller SR. For å bestemme den basale [Ca 2+ ] i SR ble C2C12-celler permeabilisert med 0,005% saponin i 15-30 s, vasket med KCl buffer og deretter vasket med 1 mM EGTA i KCl buffer inneholdende 10 uM ionomycin for å oppnå F min . Etter vasking av EGTA vekk med KCl buffer ble maksimal Fmax , 100 mM Ca 2+ med 10 μM ionomycin tilsatt. Basal Ca 2+ ble beregnet til å være 0,4 ± 0,2 mM.
Figur 1: Stimulering av RyR ved bruk av 4 cmc i HEK293 celler. ( A ) Avbildning av aktiveringen av RyR med 4 cm. ( B ) Intensitetsopptak av HEK293-cellerTransfektert med CatchER + , lokalisert i ER, behandlet med 200 μM 4 cmc. Stimulering av RyR med 4 cmc forårsaker en reduksjon i normalisert fluorescensintensitet som direkte korrelerer til en reduksjon i [Ca 2+ ] ER . N refererer til antall celler som er avbildet. Den gjennomsnittlige signalreduksjonen var 12,0 ± 2,2%. Tilstedeværelsen av 1,8 mM Ca 2+ i Ringers buffer sørget for påfylling av ER reflektert i intensitetsutvinningen til baseline. Insette bilder viser cellene før og etter behandling med 4 cm. SNR ble beregnet til å være 4,3 ± 0,8. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Reduser i [Ca 2+ ] ER ved hjelp av den reversible SERCA pUmp-inhibitor CPA i HEK293-celler. ( A ) Inhiberingen av SERCA-pumpen ved CPA. ( B ) Levende avbildning av HEK293-celler transfektert med CatchER + , lokalisert i ER, behandlet med 15 μM CPA. Fordi Ca 2+ fortsatt kan strømme gjennom IP 3 R og RyR, fører blokkering av SERCA-pumpen med CPA til en reduksjon i normalisert fluorescensintensitet som direkte korrelerer til en reduksjon i [Ca 2+ ] ER . N refererer til antall celler som er avbildet. Insetbilder er HEK293-celler transfektert med CatchER + før og etter behandling. Den gjennomsnittlige signalreduksjonen var 21,0 ± 0,3%. Tilstedeværelsen av 1,8 mM Ca 2+ i Ringers buffer sørget for påfylling av ER reflektert i intensitetsutvinningen til baseline. SNR ble beregnet til å være 5,5 ± 0,8. Vennligst klikk her for å se en større versjon avDenne figuren.
Figur 3: ATP reduserer [Ca 2+ ] ER i HEK293 celler. ( A ) Skjematisk av indirekte aktivering av IP 3 R med ATP gjennom purinergreceptor P2YR. P2YR er en GPCR som genererer IP 3 ved ATP-binding. IP 3 aktiverer IP 3 R, stimulerende kalsiumfrigivelse fra ER. ( B ) Real-time avbildning av HEK293-celler transfektert med CatchER + , lokalisert i ER, behandlet med 200 μM ATP. Indirekte stimulering av IP 3 R via P2Y-reseptoren med ATP forårsaker en reduksjon i normalisert fluorescensintensitet som direkte korrelerer til en reduksjon i [Ca 2+ ] ER . N refererer til antall celler som er avbildet. Gjennomsnittlig signalreduksjon var 6,0 ± 3,0%. SNR var cBeregnet til å være 6,7 ± 2,7. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: In situ Kd av CatchER + i C2C12 myoblastceller. Representativt spor for normalisert intensitet samlet fra permeabiliserte C2C12 myoblastceller transfektert med CatchER + . Celler ble permeabilisert med 0,005% saponin i intracellulær buffer i 15-30 s. EGTA- og Ca2 + -oppløsninger ble fremstilt i KCl-buffer, n refererer til antall celler som ble avbildet. ( A ) Inset-fluorescensbilder er representative for celler før og etter behandling. 0,3, 0,6, 2, 5, 10, 20, 50 og 100 mM Ca2 + ble tilsatt til permeabiliserte C2C12 myoblastceller i nærvær av 10 uMIonomycin for å få en Kd på 3,1 ± 1,4 mM. ( B ) Inset-fluorescensbilder er representative for celler ved minimums- og maksimumsverdier, etter tilsetning av 1 mM EGTA og 100 mM Ca 2+ med henholdsvis 10 μM ionomycin. Basal Ca 2+ ble beregnet til å være 0,4 ± 0,2 mM. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Levende enkeltcellet bildebehandling av fluorescerende prober, som CatchER + , er en effektiv teknikk for å analysere intrikate ER / SR Ca 2+ signalprosesser i hver celle som respons på reseptoragonister eller antagonister. Denne teknikken er også nyttig for avbildning ved bruk av flere bølgelengder samtidig, slik som nødvendig for Fura-2 eller til bilde CatchER + og Rhod-2 sammen for å overvåke henholdsvis henholdsvis ER- og cytosolisk kalsiumforandringer. Det er flere kritiske skritt i denne protokollen; Celle transfeksjon kan ha en stor effekt på livskraften av avbildning. Lavtransfeksjonshastigheter kan resultere i utilstrekkelig ekspresjon av GECI for overvåking av kalsiumrespons. På den annen side vil overekspresjon av CatchER + ikke ha en buffringseffekt på ER / ER Ca 2+ , et problem forbundet med syntetiske kalsiumfarger. Buffereffekter av Ca 2+ prober påvirkes av [Ca 2+ ] i organellen, K d av pKappe og konsentrasjonen av sonden som er nødvendig for måling. Cytosolisk [Ca 2+ ] er typisk i det lave nanomolære området, men den nødvendige sondekonsentrasjon er i et sammenlignbart område. I dette tilfellet var mengden av fargestoffkonsentrasjon og dens evne til buffring av cytosolisk kalsium, og er en stor bekymring for cellulær avbildning. I kontrast er ER / SR [Ca 2+ ] i 100'ene av mikromolar til millimolarområdet 31 som vi bestemt for forskjellige pattedyrcellelinjer 25 . Siden 0,1-1 uM ekspresjon av CatchER + er tilstrekkelig til å muliggjøre deteksjon av ER kalsium, er buffereffekten av CatchER ubetydelig. Dermed kan CatchER + overvåke Ca 2+ flux i høye [Ca 2+ ] miljøer uten buffering på luminal ER / SR Ca 2+ 32 .
Flere faktorer kan påvirke transfeksjonseffektiviteten til GECI, slik som inkubasjonstiden, thE-transfeksjonsreagens, inkubasjonstemperaturen og cellekonfluensen. Cellekonfluensen, når du sager cellene på lysbildet, kan påvirke bildekvaliteten betydelig. Lav konfluens kan resultere i et lavt antall celler (n) og mindre statistisk nøyaktighet, mens høye konfluensnivåer fører til overlappende lag av celler som produserer store variabler i bildebehandling. Tiden og temperaturen for transfeksjon bør optimaliseres basert på celletypen. I tillegg er tilsetning av DMEM med redusert serummedium optimal for lengre transfeksjonstider for å forhindre apoptose. Den opprinnelige GECI CatchER-fluorescensen i pattedyrceller, når den dyrkes og transfekteres, var bare 30 ° C. Fluorescensen av CatchER ble vellykket optimalisert og forbedret for ekspresjon ved 37 ° C, hvilket resulterte i den nye, forbedrede varianten CatchER + . En western blotting ved hjelp av et antistoff mot EGFP kan utføres for å bekrefte ekspresjonen av Ca2 + -proben.
Videre, megThod og konsistens av reagenslevering er kritisk. Reagenser kan legges til kammeret ved perfusjon, liten volumdiffusjon, eller med mekaniske pumper, som alle kan fremkalle forskjellige responser. Det er viktig at løsningskammeret er riktig forseglet ved å påføre et lag av fugemasse på bunnen av kammeret som skal plasseres på lysbildet. De riktige bølgelengder må velges for sonden. Excitasjons- og utslippsbølgelengder for CatchER + er henholdsvis 395/488 nm og 510 nm. For celledannelse brukes kun 488 nm for eksitering for å unngå skadelig effekt av UV-lys på celler. Derfor, ved bruk av eventuelle optiske filtre som exciterer ved 488 nm og samler opp utslipp ved 510 nm, ville det være akseptabelt å bruke til bilde med CatchER + . For å forhindre fotoblekking kan innsatsen være fokusert for å optimalisere lysintensitet og lyseksponering, for eksempel rammer / s 33 .
Mens denne protokollen er ideell til å analysere effEct av ER / SR endringer ved bruk av CatchER + Ca 2+ ER / SR fluorescerende probe, er det begrensninger som forventet i hvilket som helst eksperiment. Siden single cell live imaging bare analyserer en liten ramme av celler, kan antall celler (n) variere fra 1-100 celler i gjennomsnitt, men kan være lavere for større cellelinjer. Dette fører til lavere celle tall og statistisk varierte resultater uten flere forsøk. En n> 6 er nødvendig for statistisk nøyaktighet. For å få en større n, må mange retter avbildes eller andre teknikker må brukes samtidig. I tillegg er CatchER + en ER / SR Ca 2+ -probe, som fører til problemer med andre enkeltbølgelengdeprober og fargestoffer ved ikke å kunne kvantifisere signalet, uten å vite om signalet er sant i motsetning til forstyrrelser av cellene Artefakt og har større støy sammenlignet med ratiometriske systemer 34 .
Dette arbeidet viser at disse optimaliserte Ca 2+ prober kanPåføres i forskjellige celletyper eller vevstyper for å overvåke reseptormediert ER / SR Ca 2+ frigjøring. CatchER + er en enkelt bølgelengde ER / SR Ca 2+ probe. Derfor er det viktig at de eksperimentelle parametrene og innstillingene er konsistente for kvantitativ måling. En detaljert kalibrering av kalsiumkonsentrasjon og Kd av kalsiumføler i cellelinjene er ytterligere viktige målinger for kvantitativ analyse.
Disse utviklede kalsium sensorer kan også målrettes til bestemte steder innenfor ER / SR for å overvåke de svært forskjellige Ca 2+ transientene som eksisterer i forhold til globale Ca 2+ endringer i ulike biologiske og patologiske forhold. Disse funnene vil fortsette å presse feltene Ca 2+ bildebehandling og sonde design fremover for å gi fremtidige verktøy for å diagnostisere Ca 2+ -relaterte sykdommer. De rapporterte protokollene og den utviklede sensoren kan også tilpasses for legemiddel dCoveringer mot sykdommer assosiert med kalsium signalering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av NIH GM62999, NIH EB007268, NIH AG15820, B & B Seed Grant, og en NIH Supplementary Grant til FR, BB fellesskap til CM, CDT fellesskap til RG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-Chloro-3-methylphenol (4-CmC) | Sigma-Aldrich | C55402 | |
| 515DCXR dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | NC338059 | |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| Calcium chloride dihydrate | EMD Millipore | 102382 | |
| Corning tissue-culture treated culture dishes (100 mm) | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
| Corning tissue-culture treated culture dishes (60 mm) | Sigma-Aldrich | CLS430166 | |
| Cyclopiazonic Acid (CPA) | EMD Millipore | 239805 | |
| D(+)-Glucose | ACROS Organics | 41095-0010 | |
| Dow Corning 111 Valve Lubricant & Sealant | Warner Instruments | 64-0275 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D7777 | |
| Ethylenebis(oxyethylenenitrilo) tetraacetic Acid (EGTA) |
ACROS Organics | 409911000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher | 26140087 | |
| Fisherbrand Cover Glasses 22x40 mm | Fisher Scientific | 12-544B | |
| Hanks’ Balanced Salts (HBSS) | Sigma-Aldrich | H4891 | |
| HEPES, Free Acid, Molecular Biology Grade | EMD Millipore | 391340 | |
| Immersion Oil without autofluorescence | Leica | 11513859 | |
| Ionomycin, Free Acid | Fisher Scientific | 50-230-5804 | |
| Leica DM6100B inverted microscope with a cooled EM-CCD camera | Hamamatsu | C9100-13 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher | 11668019 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | ThermoFisher | L3000015 | |
| Low Profile Open Diamond Bath Imaging Chamber | Warner Instruments | RC-26GLP | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Fisher Scientific | M33-500 | |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 51985034 | |
| Potassium Chloride | EMD Millipore | PX1405 | |
| Potassium Phosphate, Dibasic | EMD Millipore | PX1570 | |
| Potassium Phosphate, Monobasic | EMD Millipore | PX1565 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| SimplePCI Image Analysis Software | Hamamatsu | N/A | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-3 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sterivex-GV 0.22 µm filter | EMD Millipore | SVGVB1010 | |
| Till Polychrome V Xenon lamp | Till Photonics | N/A | |
| Trypsin (2.5%), no phenol red (10x) | ThermoFisher | 15090046 |
References
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).
- Berridge, M. J. Calcium signalling remodelling and disease. Biochem. Soc. Trans. 40, 297-309 (2012).
- Tang, S., Reddish, F., Zhuo, Y., Yang, J. J. Fast kinetics of calcium signaling and sensor. Curr. Opin. Chem. Biol. 27, 90-97 (2015).
- Rizzuto, R., Pozzan, T. Microdomains of intracellular Ca2+: Molecular determinants and functional consequences. Physiol. Rev. 86 (1), 369-408 (2006).
- Berridge, M. J. The endoplasmic reticulum: a multifunctional signaling organelle. Cell Calcium. 32 (5-6), 235-249 (2002).
- Clapham, D. E. Calcium Signaling. Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).
- HerrmannFrank, A., Richter, M., Sarkozi, S., Mohr, U., LehmannHorn, F. 4-chloro-m-cresol, a potent and specific activator of the skeletal muscle ryanodine receptor. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1289 (1), 31-40 (1996).
- Ferris, C. D., Huganir, R. L., Bredt, D. S., Cameron, A. M., Snyder, S. H. Inositol trisphosphate receptor: phosphorylation by protein kinase C and calcium calmodulin-dependent protein kinases in reconstituted lipid vesicles. Proc. Natl. Acad. Sci. 88 (6), 2232-2235 (1991).
- Dubyak, G. R., el-Moatassim, C. Signal transduction via P2-purinergic receptors for extracellular ATP and other nucleotides. Am. J. Physiol., Cell Physiol. 265 (3 Pt 1), C577-C606 (1993).
- Song, Z., Vijayaraghavan, S., Sladek, C. D. ATP increases intracellular calcium in supraoptic neurons by activation of both P2X and P2Y purinergic receptors. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 292 (1), R423-R431 (2007).
- Brini, M., Carafoli, E. Calcium Pumps in Health and Disease. Physiol. Rev. 89 (4), 1341-1378 (2009).
- Michelangeli, F., East, J. M. A diversity of SERCA Ca2+ pump inhibitors. Biochem. Soc. Trans. 39 (3), 789-797 (2011).
- Hofer, A. M., Landolfi, B., Debellis, L., Pozzan, T., Free Curci, S. Ca2+ dynamics measured in agonist-sensitive stores of single living intact cells: a new look at the refilling process. Embo J. 17 (7), 1986-1995 (1998).
- Hofer, A. M., Machen, T. E. Technique For InSitu Measurement of Calcium in Intracellular Inositol 1,4,5-Trisphosphate-Sensitive Stores Using The Fluorescent Indicator Mag-Fura-2. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90 (7), 2598-2602 (1993).
- Raju, B., Murphy, E., Levy, L. A., Hall, R. D., London, R. E. A fluorescent indicator for measuring cytosolic free magnesium. Am J Physiol. 256, (1989).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).
- Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. Y. Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (50), 17404-17409 (2004).
- Heim, N., Griesbeck, O. Genetically Encoded Indicators of Cellular Calcium Dynamics Based on Troponin C and Green Fluorescent Protein. J. Biol. Chem. 279 (14), 14280-14286 (2004).
- Mank, M., et al. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophys. J. 90 (5), 1790-1796 (2006).
- Garaschuk, O., Griesbeck, O., Konnerth, A. Troponin C-based biosensors: A new family of genetically encoded indicators for in vivo calcium imaging in the nervous system. Cell Calcium. 42 (4-5), 351-361 (2007).
- Carlson, H. J., Campbell, R. E. Mutational Analysis of a Red Fluorescent Protein-Based Calcium Ion Indicator. Sensors. 13 (9), 11507-11521 (2013).
- Wang, Q., Shui, B., Kotlikoff, M. I., Sondermann, H. Structural Basis for Calcium Sensing by GCaMP2. Structure. 16 (12), 1817-1827 (2008).
- Koldenkova, V. P., Nagai, T. Genetically encoded Ca2+ indicators: Properties and evaluation. Biochim. Biophys. Acta-Mol. Cell Res. 1833 (7), 1787-1797 (2013).
- Tang, S., et al. Design and application of a class of sensors to monitor Ca2+ dynamics in high Ca2+ concentration cellular compartments. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (39), 16265-16270 (2011).
- Zou, J., et al. Developing sensors for real-time measurement of high Ca2+ concentrations. Biochemistry. 46 (43), 12275-12288 (2007).
- Wang, Z. -M., Tang, S., Messi, M. L., Yang, J. J., Delbono, O. Residual sarcoplasmic reticulum Ca2+ concentration after Ca2+ release in skeletal myofibers from young adult and old mice. Pflugers Arch., EJP. 463 (4), 615-624 (2012).
- Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 24 (1), 79-88 (2006).
- Siemering, K. R., Golbik, R., Sever, R., Haseloff, J. Mutations that suppress the thermosensitivity of green fluorescent protein. Current Biology. 6 (12), 1653-1663 (1996).
- Reddish, F. N. Design Of Genetically-Encoded Ca2+ Probes With Rapid Kinetics for Sub-Cellular Application [dissertation]. , Georgia State University. (2016).
- Seo, M. D., Enomoto, M., Ishiyama, N., Stathopulos, P. B., Ikura, M. Structural insights into endoplasmic reticulum stored calcium regulation by inositol 1,4,5-trisphosphate and ryanodine receptors. Biochim. Biophys. Acta-Mol. Cell Res. 1853 (9), 1980-1991 (2015).
- Lambert, D. G. Calcium signaling protocols. , Humana Press. (1999).
- Stephens, D. J., Allan, V. J. Light microscopy techniques for live cell imaging. Science. 300 (5616), 82-86 (2003).
- Bootman, M. D., Rietdorf, K., Collins, T., Walker, S., Sanderson, M. Ca2+-sensitive fluorescent dyes and intracellular Ca2+ imaging. Cold Spring Harb. 2013 (2), Cold Spring. 83-99 (2013).
