Summary
Мы представляем протоколы для применения нашего целевого генетически кодированного индикатора кальция (GECI) CatchER + для мониторинга быстрых переходных процессов кальция в эндоплазматическом / саркоплазматическом ретикулуме (ER / SR) HEK293 и клетках C2C12 скелетной мышцы с использованием флуоресцентной микроскопии в режиме реального времени. Обсуждается также протокол измерения и калибровки in situ K d .
Abstract
Внутриклеточные кальциевые (Ca 2+ ) переходные процессы, вызванные внеклеточными стимулами, инициируют множество биологических процессов в живых организмах. В центре внутриклеточного высвобождения кальция находятся основные внутриклеточные органоиды хранения кальция, эндоплазматический ретикулум (ER) и более специализированный саркоплазматический ретикулум (SR) в мышечных клетках. Динамическое высвобождение кальция из этих органелл опосредуется рианодиновым рецептором (RyR) и 1,4,5-трифосфатным рецептором инозитолом (IP 3 R) с повторным наполнением через насос кальциевой АТФазы sarco / эндоплазматический ретикулум (SERCA). Был создан генетически кодированный датчик кальция (GECI) под названием CatchER для контроля быстрого высвобождения кальция из ER / SR. Здесь подробные протоколы для трансфекции и экспрессии улучшенного EREC-SR-нацеленного GecI CatchER + в клетках HEK293 и C2C12 и его применение в контроле за транзитом кальция, опосредованным насосом IP 3 R, RyR и SERCAС в клетках НЕК293 с использованием флуоресцентной микроскопии. Агонист рецептора или ингибитор выбора диспергируют в растворе в камере, и изменения интенсивности регистрируют в реальном времени. С помощью этого метода снижение ER-кальция наблюдается с активацией RyR с помощью 4-хлор-м-крезола (4 см), косвенной активацией IP 3 R с аденозинтрифосфатом (АТФ) и ингибированием насоса SERCA циклопиазоном Кислота (СРА). Мы также обсуждаем протоколы для определения in situ K d и количественного определения базального [Ca 2+ ] в клетках C2C12. Таким образом, эти протоколы, используемые в сочетании с CatchER + , могут вызывать опосредуемое рецепторами высвобождение кальция из ER с последующим применением при исследовании патологий, связанных с кальцием ER / SR.
Introduction
Пространственно-временные характеристики внутриклеточных кальциевых (Са 2+ ) переходных процессов активируют различные биологические функции 1 . Эти сигнальные события Ca 2+ запускаются внеклеточно через различные стимулы и контролируются внутриклеточно основными органоидами хранения Ca 2+ и многочисленными насосами Ca 2+ , каналами и Ca 2+ -связывающими белками. Переходные процессы Ca 2+ могут быть значительно изменены в результате дефектов с модуляцией сигнала, приводящих к различным заболеваниям 2 . Из-за скорости и сложности системы сигнализации Ca 2+ , с эндо- (ER) и саркоплазматическим ретикулумом (SR) в центре, необходимы генетически кодированные Ca 2+ -пробы, оптимизированные для экспрессии млекопитающих с быстрой кинетикой Наблюдать глобальные и локальные изменения Са 2+ в разных клетках 3 .
ER и SR, Его аналог в мышечных клетках, являются основными внутриклеточными органоидами хранения Ca 2+ и действуют как поглотители Ca 2+, которые помогают усилить сигнал Ca 2+ 4 . ER / SR является неотъемлемой частью передачи сигналов Ca 2+ с двойными функциями в качестве передатчика и приемника сигналов 5 . Рецепторы рианодина (RyR) и 1,4,5-трифосфатного рецептора инозитола (IP 3 R) являются рецепторами высвобождения Ca 2+, расположенными на мембранах ER / SR, которые регулируются Ca 2+ 6 . Другие агенты прямо или косвенно стимулируют функцию этих рецепторов. 4-хлор-м-крезол (4 см) является сильным агонистом RyR, имеющим чувствительность в 10 раз выше, чем кофеин, для индуцирования высвобождения SR Ca 2+, где оба препарата регулярно используются для изучения RyR-опосредованного выделения Ca 2+ в Здоровые и больные клетки 7 . ATP повышает степень защиты от IP 3 Ca 2+ reАренды через IP 3 R 8 . АТФ связывается с пуринергическим рецептором P2YR, рецептором, связанным с G-белком (GPCR), вызывая выработку IP 3 , который связывается с IP 3 R для высвобождения Ca 2+ из ER 9 , 10 . Насос SARCO-эндоплазматический ретикулум кальция ATPase (SERCA) представляет собой насос АТФазы Р-типа, также расположенный на мембране ER / SR, которая уменьшает цитозольный Ca 2+ и наполняет ER / SR активным насосом иона в просвет ER / SR 11 . Конкретные ингибиторы насоса SERCA включают тапсигаргин, из Thapsia garganica и циклопиазоновую кислоту (CPA), от Aspergillus и Penicillium . CPA имеет низкое сродство к насосу и обратимо блокирует точку доступа Ca 2+ 12 . Thapsigargin, с другой стороны, необратимо связывается с Ca 2+ свободным насосом на остатке F256 в спирали M3 с наномоломAr affinity 11 . Анализ и количественная оценка изменений, связанных с стимулированными Ca 2+ событиями, была и остается проблемой. Поскольку ER / SR является основным субклеточным Ca 2+ -содержащим отделением с центральной функцией в распространении сигнала Ca 2+ , большая работа была сосредоточена на понимании передачи сигналов ER / SR Ca 2+ 5 .
Создание синтетических Ca 2+ красителей помогло продвинуть область и практику получения Ca 2+ . Хотя красители, такие как Mag-Fura-2, широко использовались для измерения компартенсированного Ca 2+ в разных клетках, 13 , 14 , 15 они имеют такие ограничения, как неравномерная погрузка красителя, фотообесцвечивание и невозможность нацеливаться на определенные органеллы , Открытие зеленого флуоресцентного белка (GFP) и продвижение флуоресцентного белка-Основанные на Ca 2+ , продвинули поле изображения Ca 2+ вперед 16 . Некоторые из существующих GECI являются парами FERT (резонансная энергия) (FRET), включающими желтый флуоресцентный белок (YFP), голубой флуоресцентный белок (CFP), кальмодулин и связывающий пептид M13 17,18 . GECI на основе тропонина C также доступны в виде FRET пар CFP и цитрина и в качестве однофлуорофорных зондов 19 , 20 , 21 . Другие, такие как GCaMP2 и R-GECO, являются одними флуорофорными сенсорами, включающими кальмодулин 22 , 23 . Чтобы преодолеть ограничения узкой настройки K d и кооперативного связывания, связанные с множеством сайтов связывания Ca 2+, обнаруженных в их связывающих доменах Ca 2+ 24 , новый класс кальциевых сенSors был создан путем создания участка связывания Ca 2+ на поверхности бета-бочки в чувствительном к хромофорам участке усиленного зеленого флуоресцентного белка (EGFP) 25 , 26 . Этот датчик с высокой разрешающей способностью, называемый CatchER, имеет K d ~ 0,18 мМ, ak - около диффузионного предела и ak off 700 с -1 . CatchER использовался для контроля рецептор-опосредованного высвобождения кальция ER / SR в различных линиях клеток млекопитающих, таких как HeLa, HEK293 и C2C12 25 . Из-за быстрой кинетики CatchER использовался в мышечных волокнах flexor digitorum brevis (FDB) молодых и старых мышей Friend Virus B NIH Jackson (FVB), чтобы показать, что большее количество Ca 2+ остается в SR после 2 сек деполяризации в FDB Волокон старых мышей по сравнению с волокнами старых мышей 27 . Для преодоления его низкой флуоресценции при 37 ° С, что затрудняет ее применение при кальциевых изображениях млекопитающихКлеток, мы разработали улучшенную версию CatchER под названием CatchER + . CatchER + обладает повышенной флуоресценцией при 37 ° C для лучшего применения в клетках млекопитающих. Дополнительные дополнительные мутации были включены в CatchER для улучшения термостабильности и флуоресценции при 37 ° С 28 , 29 , чтобы создать CatchER + . CatchER + демонстрирует шестикратное увеличение отношения сигнал / шум (SNR) по сравнению с CatchER 30 .
Здесь представлены протоколы культивирования и трансфекции клеток HEK293 и C2C12 с CatchER + и его применение для мониторинга ER / SR рецептор-опосредованных кальциевых транзиентов. Представительные результаты показаны для CatchER +, экспрессированного в клетках НЕК293, обработанных 4 см, CPA и ATP. Мы также предоставляем протокол для определения in situ K d CatchER + в клетках миобластов C2C12 и quaОпределение базального [Са 2+ ].
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка слайдов
- Поместите стеклянные микроскопы размером 22 мм х 40 мм в чашки для культивирования клеток размером 6 см, по 1 слайду на блюдо.
- Выставляйте каждую сторону каждого слайда, а также чашку 6 см до ультрафиолетового (УФ) света в течение 15-20 мин для стерилизации в стерильном вытяжном шкафу.
- Покрывают посуду предметами внутри с парафильмом и хранят при температуре 4 ° C до готовности к использованию.
2. Подготовка среды, буферов, растворов и реагентов
- Приготовьте 1 л сбалансированного солевого раствора Хенкса (HBSS) в деионизированной воде и добавьте 10 мМ HEPES, 5 мМ NaHCO 3 и 1 мМ EGTA. Доводят pH до 7,2-7,3 с помощью NaOH. Фильтрующий буфер с фильтром 0,22 мкм в автоклаве.
- Подготовьте 900 мл высокоочищенной глюкозы в модифицированной по Дульбекко среде Игла (DMEM) h в деионизированной воде. Добавить 44 мМ NaHCO 3 и довести рН до 7,2-7,3 с помощью HCl. Фильтрующий материал с фильтром 0,22 мкм в автоклаве. Добавить 100 мл плода boviNe сыворотку (FBS) к средствам для того чтобы сделать концентрацию FBS 10%. Хранить при температуре 4 ° C.
- Готовят 1 л внутриклеточного буфера (125 мМ KCl, 25 мМ NaCl, 10 мМ HEPES, 0,2 мМ CaCl 2 , 0,5 мМ EGTA, 0,2 мМ MgCl 2 ) в деионизированной воде и доводят рН до 7,25. Конечный [Ca 2+ ] будет составлять ~ 100 нМ. Перед использованием добавьте 0,5 мМ АТФ. Хранить при комнатной температуре.
- Готовят 1 л буфера Рингера (121 мМ NaCl, 2,4 мМ K 2 HPO 4 , 0,4 мМ KH 2 PO 4 , 10 мМ HEPES и 1,2 мМ MgCl 2 ) в деионизированной воде и доводят рН до 7,2. Хранить при комнатной температуре. Для использования аликвоту 50 мл в 50 мл пробирку и добавить 1,8 мМ Са 2+ и 10 мМ глюкозы.
- Готовят 1 л промывочного раствора KCl (125 мМ KCl, 25 мМ NaCl, 10 мМ HEPES, 0,2 мМ MgCl 2 ) в деионизированной воде и доводят рН до 7,25.
- Растворяют 5 мг иономицина в 1 мл диметилсульфоксида (ДМСО). Алиготе 30 мкл в микропробирки и хранить при -206; С.
- Приготовьте запас циклопиазоновой кислоты (CPA), растворяя CPA в ДМСО. Убедитесь, что конечный процент DMSO составляет ≤ 1% для CPA, добавленного в клетки для предотвращения апоптоза. Готовят 20 мМ 4-хлор-м-крезол (4 см), растворяя в отфильтрованном H 2 O и оставляя его растворяться в течение ночи при встряхивании при 37 ° С. Подготовьте запас АТФ, растворяя в отфильтрованной H 2 O до 100 мМ.
- Для определения in situ K d готовят по 15 мл каждого из 1 мМ EGTA, 0,2 мМ, 0,6 мМ, 2 мМ, 5 мМ, 10 мМ, 20 мМ, 50 мМ и 100 мМ Ca 2+ в буфере KCl, используя 100 ММ EGTA и 1 М раствора CaCl 2, растворенного в деионизированной воде.
3. Клеточная культура
- Культура клеток C2C12 myoblast и HEK293 в соответствии с протоколами ATCC для каждого, использующего 10 см клеточные культуральные чашки в стерильном ультрафиолетовом капюшоне.
ПРИМЕЧАНИЕ: клеткам C2C12 не должно быть позволено расти более чем на 70% слияния, так как миобласты начнут дифференцироватьсяТе в миотубы. Как клетки HEK293, так и клетки C2C12 легко растут, и им не следует позволять расти через 100% слияния, чтобы сохранить целостность клеток. Кроме того, клетки не должны пассировать более 10 раз, прежде чем использовать их для эксперимента, чтобы сохранить здоровье клеток.
4. Трансфекция клеток НЕК293
- Семена HEK293 клеток на стерилизованные 22 мм х 40 мм стеклянные микроскопы слайды в 6 см блюда, так что они ~ 70% конфлюэнт в день трансфекции.
- На следующий день следуйте протоколу производителя трансфекционного реагента для трансфекции клеток, используя 2 мкг CatchER + кДНК и соотношение реагентов ДНК: трансфекция 1: 3 (вес / объем) в среде с пониженной сывороткой ( например, Opti-MEM).
- Опорожните среду DMEM с чашки и добавьте 3 мл уменьшенной сыворотки. Добавить ДНК: смесь реактивов трансфекции к чашке и инкубировать в течение 4-6 ч при 37 ° С.
- После инкубации промойте клетки 5-6 мл HBSS. Отбросить HBSS fВзбить блюдо и заменить 3 мл свежего DMEM и инкубировать их при 37 ° C в течение 48 часов, чтобы позволить выражение GECI.
- Трансфекция клеток миобластов C2C12
- Для клеток миобласта C2C12 трипсинизируют клетки, добавляя достаточное количество трипсина, чтобы покрыть основание чашки (1-2 мл). Поместите блюдо в инкубатор с температурой 37 ° C в течение 2-6 минут, чтобы трипсин смог ослабить клетки со дна чашки.
- Как только инкубация завершена, удалите трипсин и аспирируйте клетки в 8 мл DMEM. Пипетируйте клетки тщательно с DMEM, чтобы равномерно диспергировать и повторно суспендировать те клетки и высевать их на стерильные покровные стекла в чашках для культивирования клеток 6 см, содержащих 3 мл DMEM, так чтобы конечная конфлюэнтность составляла 60%.
- Трансформируйте клетки в тот же день, как описано на этапе 4.2-4.3. Инкубируйте в течение 24 ч при 37 ° C.
- Повторите шаг 4.4.
5. Подготовка слайдов и флуоресцентного микроскопа
- Включить mИкроскоп и источник света, затем откройте простую программу PCI. Подождите, пока микроскоп прогреется в течение 15-20 минут или пока камера с зарядовой связью (CCD) не охладится до -65 ° C. Подготовьте камеру и скользите клетками во время ожидания.
- Обложка нижней части низкопрофильной камеры для визуализации с открытой алмазной ванной тонким слоем герметика, используя ватный тампон.
- Возьмите предметное стекло, содержащее трансфицированные клетки, из инкубатора и аккуратно три раза промойте 1 мл буфера Рингера 10 мМ глюкозы и 1,8 мМ Ca 2+, предварительно нагретого до 37 ° C.
- Оставьте 1 мл буфера Рингера в чашке, чтобы клетки не высыхали, и используйте щипцы, чтобы вынуть предмет из чашки. Позвольте избыточному раствору впитаться в лабораторную ткань, коснувшись края слайда лабораторной тканью. Затем поместите на сторону камеры, содержащей смазку, ячейки, обращенные вверх к смазке, и закрепите камеру на держателе сцены с помощью отвертки.
- Добавить 1Мл буфера Рингера в камеру, чтобы предотвратить высыхание клеток при установке камеры на сцену и завершении остальной установки микроскопа. Как только вакуумный всасывающий шланг присоединяется к камере, конечный объем, который занимает камера, составляет ~ 450 мкл.
- Переключите объектив микроскопа в объектив 40X.
- Для чистки и сушки объектива используйте бумагу для линз и чистящий раствор для линз. Не тереть цель. Аккуратно промокните, пока поверхность не станет чистой.
- Добавьте одну каплю иммерсионного масла к объективу.
- Поместите держатель на ступицу микроскопа и добавьте вакуумный наконечник в камеру. Как только вакуумный всасывающий шланг присоединяется к камере и включается, конечный объем, который занимает камера, составляет ~ 450 мкл. Этот конечный объем выровнен по сторонам камеры. Во время эксперимента необходимо, чтобы решение камеры было ровным, чтобы предотвратить попадание раствора в цель из-за переполнения.
- Используя режим яркого поля, отрегулируйте коэффициент усиления до 175 и время экспозиции до 0,03 с, чтобы сфокусировать ячейки.
- Когда клетки сосредоточены, переключитесь в режим флуоресценции, используя возбуждение 488 нм. Измените время экспозиции на 0,07 с. Найдите поле зрения, в котором достаточно клеток, которые здоровы с адекватной флуоресценцией для изображения.
- После того, как поле зрения выбрано, сделайте снимки в режиме флуоресценции и яркого поля.
- Обведите область интереса (ROI) в ячейках или обведите вокруг всей ячейки, чтобы записать интенсивность из выбранной области.
6. Визуализация индуцированных лекарственными средствами переходов Ca 2+ и in situ. Калибровка Kd
- Запуск измерения интенсивности с частотой кадров, установленной на каждые 5 с.
- Разрешить базовую интенсивность стабилизироваться на 20-30 кадров (100-150 с). Если необходимо, уменьшите frAmes / s во время этого шага, чтобы предотвратить фотообесцвечивание.
- Вычислите необходимое количество 4 смц из 20 мМ массы на основании конечного объема камеры ~ 450 мкл, чтобы получить конечную концентрацию 200 мкМ. При необходимости развести запасы.
- Аккуратно берут 60 мкл буфера Рингера из камеры и помещают в микроцентрифужную пробирку. Развести рассчитанное количество 4 см с этим раствором и добавить обратно в камеру, чтобы вызвать намеченный ответ от клеток, которые были отображены.
- Добавьте вычисленное количество 4 см к микроцентрифужной пробирке и смешайте с помощью пипетки.
- Аккуратно добавьте решение по полю зрения, одновременно добавляя маркер события в измерение интенсивности.
- Дайте время для связывания лекарственного средства с рецептором и последующего снижения сигнала, затем промойте 3-6 мл буфера Рингера с помощью 1,8 мМ Са 2+ и 10 мМ глюкозы, одновременно добавляя маркер события. Поскольку объем камеры равен 450 &L и соединен с вакуумом, добавление 3-6 мл буфера гарантирует, что прежний раствор, содержащий лекарство, был вымыт и заменен новым добавленным раствором.
- Повторите 6.1-6.7 для 100 мкМ АТФ и 15 мкМ CPA, используя новый слайд трансфицированных клеток для каждого анализа.
- По завершении измерения завершите сбор данных в окне измерения интенсивности в программе Simple PCI.
- Возьмите флуоресценцию и яркие изображения клеток.
- Откройте файл данных для эксперимента. Здесь, при необходимости, обведите кружочком ячейки или области, представляющие интерес, чтобы пересчитать значения интенсивности.
- Чтобы определить in situ K d в клетках миобласта C2C12, следуйте протоколу, как описано в разделе 4.2 и разделе 5, и поместите 1 мл 0 мМ Ca 2+ буфера Рингера в камеру.
- Пермеабилизировать клетки с 0,002-0,005% сапонином во внутриклеточном буфере в течение 15-30 с для опорожнения клеток любогоCatchER +, который может находиться в цитозоле. Промойте клетки 3-6 мл 1 мл EGTA в буфере KCl с 10 мкМ иономицина. Позвольте интенсивности уменьшаться, пока плато не будет достигнуто.
- Промывают 3-6 мл буфера KCl с 10 мкМ иономицина и позволяют стабилизировать интенсивность, затем добавляют каждый раствор Ca 2+, подробно описанный на этапе 2.7. Позвольте интенсивности достигать плато между каждым добавлением.
- Чтобы откалибровать датчик для количественной количественной оценки [Ca 2+ ], выполните шаг 6.12. Используйте EGTA и буфер 100 мМ Ca 2+ со стадии 2.7, чтобы получить минимальную и максимальную интенсивность флуоресценции.
7. Обработка данных
- Загрузите файл электронной таблицы данных измерения интенсивности.
- Нормализовать данные для каждой ячейки до базовой интенсивности (F / F 0 ). Постройте нормализованные данные в зависимости от времени в любой графической программе.
- Чтобы вычислить изменение%, вычтите нормированное пиковое значениеUe от 1 и умножьте на 100. Вычислите среднее и стандартное отклонение, если были отображены несколько ячеек.
- Чтобы вычислить отношение сигнал / шум, SNR, откройте файл изображения, сохраненный в эксперименте, в ПО для обработки изображений, например ImageJ, а затем измерьте сигнал, трансфицированные клетки и шум, фон. Вычислите SNR, используя уравнение SNR = сигнал / шум.
- Чтобы вычислить in situ K d из собранных данных визуализации флуоресценции, усредненные данные интенсивности, содержащие плато, после добавления каждой концентрации Ca 2+ и EGTA (0 мМ Ca 2+ ). Рассчитайте фракционную насыщенность (относительную интенсивность) с использованием θ = (F - F min ) / (F max - F min ), где θ - относительная интенсивность, F - флуоресценция в любой точке, F min - минимальная интенсивность флуоресценции и F max - максимальная интенсивность флуоресценции, чтобы увидеть изменение интенсивности tОн зондирует с добавлением Са 2+ по сравнению с минимальной интенсивностью. Постройте данные относительной интенсивности относительно [Ca 2+ ] в любой графической и криволинейной программе. Используйте уравнение связывания 1: 1 θ = [M T ] / (K d + [M T ]), переведенное для любой программы построения графиков и подгонки кривых для вычисления K d . M T - общая концентрация металла.
- Для количественного определения базального кальция из калибровки, описанной в 6.13, средние данные интенсивности, содержащие плато, после добавления 1 мМ EGTA (F min ) и 100 мМ Ca 2+ (F max ). Используйте калибровочное уравнение [Ca 2+ ] = K d ([F - F min ) / (F max - F)] для расчета базального кальция.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этом разделе будут проиллюстрированы результаты, которые были достигнуты с использованием ранее описанных методов с использованием оптимизированного ER / SR-ориентированного GECI CatchER + для мониторинга изменений ER / SR Ca 2+ с помощью различных рецепторно-опосредованных путей.
На рисунке 1 показано опорожнение ER через RyR, стимулированное 200 мкМ 4 см. 4-см является агонистом RyR. Добавление препарата вызывает снижение ER-кальция, измеряемое снижением интенсивности флуоресценции CatchER + . Как отмечено, протокол, описанный здесь, позволяет визуализировать и измерять рецептор-опосредованные переходные процессы Ca 2+ с использованием CatchER +, который предоставляет информацию об изменениях в ER Ca 2+ .
Как показано на фиг. 2 , добавление 15 мкМ СРА, чтобы реверсивно блокировать насос SERCA, вызывает значительное снижение интенсивности флуоресценции, которая образует плато. Поскольку функция насоса SERCA ингибируется, каналы высвобождения ER Ca 2+ по-прежнему активно высвобождают Ca 2+ в цитозоль, что приводит к снижению интенсивности флуоресценции. Клетки восстанавливают после отмывания СРА от буфера Рингера, содержащего 1,8 мМ Ca 2+ и 10 мМ глюкозы. Эти результаты подтверждают способность CatchER + контролировать переходные процессы Ca 2+, характерные для насоса SERCA.
3 представлены репрезентативные данные для косвенной активации IP 3 R с 200 мкМ АТФ в клетках HEK293, трансфецированных CatchER + . АТФ связывается с рецептором P2Y, рецептором, связанным с G-белком, который генерирует IP 3, который активирует высвобождение Ca 2+ через IP 3 R. Хотя изменениеЯвляется небольшим, добавление 200 мкМ АТФ вызывает заметное снижение интенсивности сигнала. Промывание клеток буфером Рингера, содержащим 1,8 мМ Ca 2+ и 10 мМ глюкозы, позволяет пополнить ER и сигнал вернуться к исходному уровню. Эти результаты подчеркивают способность CatchER + отслеживать высвобождение кальция под действием IP 3 R через косвенную стимуляцию.
На рисунке 4 CatchER + трансфицировали в клетки миобласта C2C12 для определения in situ K d . Данные были собраны в соответствии с протоколом. Клетки миобластов С2С12 проницали- ли с сапонином 0,005% в течение 15-30 с, затем промывали 1 мМ ЭГТА в буфере KCl, содержащем 10 мкМ иономицина. Различные концентрации Ca 2+ получали в буфере KCl, содержащем 10 мкМ иономицина, и добавляли поэтапно. Данные были нормализованы и подобраны с использованием связывания 1: 1. Среднее значение K d составляло 3,1 ± 1,4 мМ для 7 клеток. Слабое сродство CatchER + позволяет ощущать Ca 2+ в органеллах с высоким содержанием Ca 2+, таких как ER или SR. Для определения базального [Ca 2+ ] в SR клетки C2C12 проницали- ли с сапонином 0,005% в течение 15-30 с, промывали буфером KCl и затем промывали 1 мМ EGTA в буфере KCl, содержащем 10 мкМ иономицина, с получением F min , После промывки EGTA с буфером KCl добавляли максимум Fmax 100 мМ Ca 2+ с 10 мкМ иономицина. Было подсчитано, что базальный Ca 2+ составляет 0,4 ± 0,2 мМ.
Рисунок 1: Стимулирование RyR с использованием 4 см в клетках НЕК293. ( A ) Изображение активации RyR с 4 см. ( B ) Запись интенсивности клеток HEK293Трансфецированную CatchER + , локализованную в ER, обработанную 200 мкМ 4 см. Стимуляция RyR с помощью 4 см приводит к снижению нормированной интенсивности флуоресценции, которая непосредственно коррелирует с уменьшением [Ca 2+ ] ER . N - количество отображаемых ячеек. Среднее снижение сигнала составило 12,0 ± 2,2%. Присутствие 1,8 мМ Ca 2+ в буфере Рингера способствовало наполнению ER, отраженным в восстановлении интенсивности до исходного уровня. На вставных изображениях показаны клетки до и после лечения с помощью 4 см. Расчет SNR составил 4,3 ± 0,8. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Уменьшение [Ca 2+ ] ER с использованием обратимого SERCA pИнгибитор АПФ в клетках НЕК293. ( A ) Торможение насоса SERCA с помощью CPA. ( B ) Живое изображение клеток НЕК293, трансфицированных CatchER + , локализованных в ER, обработанных 15 мкМ CPA. Поскольку Ca 2+ все еще может протекать через IP 3 R и RyR, блокирование насоса SERCA с помощью CPA вызывает снижение нормированной интенсивности флуоресценции, что непосредственно коррелирует с уменьшением [Ca 2+ ] ER . N - количество отображаемых ячеек. Вкладывающиеся изображения представляют собой клетки НЕК293, трансфицированные CatchER + до и после лечения. Среднее снижение сигнала составило 21,0 ± 0,3%. Присутствие 1,8 мМ Ca 2+ в буфере Рингера способствовало наполнению ER, отраженным в восстановлении интенсивности до исходного уровня. Расчет SNR составил 5,5 ± 0,8. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версиюэта фигура.
Рисунок 3: АТФ снижает [Ca 2+ ] ER в клетках HEK293. ( A ) Схема косвенной активации IP 3 R с помощью АТФ через пуринергический рецептор P2YR. P2YR представляет собой GPCR, который генерирует IP 3 при связывании АТФ. IP 3 активирует IP 3 R, стимулируя высвобождение кальция из ER. ( B ) Отображение в реальном времени клеток НЕК293, трансфицированных CatchER + , локализованных в ER, обработанных 200 мкМ АТФ. Косвенная стимуляция IP 3 R через рецептор P2Y с помощью АТФ вызывает снижение нормированной интенсивности флуоресценции, что непосредственно коррелирует с уменьшением [Ca 2+ ] ER . N - количество отображаемых ячеек. Среднее снижение сигнала составило 6,0 ± 3,0%. SNR был cСоставляет 6,7 ± 2,7. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: In situ K d CatchER + в клетках миобластов C2C12. Репрезентативный след для нормализованной интенсивности, собранный из пермеабилизированных клеток миобластов C2C12, трансфицированных CatchER + . Клетки подвергали пермеабилизации с 0,005% сапонином во внутриклеточном буфере в течение 15-30 с. EGTA и Ca 2+ растворы готовили в буфере KCl, n относили к числу клеток, которые были отображены. ( A ) Вкладывающиеся флюоресцентные изображения являются репрезентативными для клеток до и после лечения. 0,3, 0,6, 2, 5, 10, 20, 50 и 100 мМ Ca 2+ добавляли к пермеабилизированным клеткам миобласта С2-12 в присутствии 10 мкМИономицином, чтобы получить K d 3,1 ± 1,4 мМ. ( B ) Вставные флуоресцентные изображения представляют клетки по минимальным и максимальным значениям после добавления 1 мМ EGTA и 100 мМ Ca 2+ с 10 мкМ иономицина каждый, соответственно. Было подсчитано, что базальный Ca 2+ составляет 0,4 ± 0,2 мМ. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Живая одноячеечная визуализация флуоресцентных зондов, таких как CatchER + , является эффективным методом анализа сложных сигнальных процессов ER / SR Ca 2+ в каждой клетке в ответ на агонисты или антагонисты рецепторов. Этот метод также полезен для визуализации одновременно с использованием нескольких длин волн, например, необходимых для Fura-2 или для изображения CatchER + и Rhod-2 вместе, чтобы контролировать как ER, так и цитозольные изменения кальция, соответственно. В этом протоколе несколько критических шагов; Клеточная трансфекция может иметь большое влияние на жизнеспособность изображений. Низкие уровни трансфекции могут приводить к недостаточной экспрессии GECI для мониторинга реакции кальция. С другой стороны, сверхэкспрессия CatchER + не будет иметь буферного эффекта для ER / ER Ca 2+ , проблемы, связанной с синтетическими кальциевыми красителями. На буферные эффекты зондов Ca 2+ влияет [Ca 2+ ] в органелле, K d pХалат и концентрацию зонда, необходимого для измерения. Цитозольный [Ca 2+ ], как правило, находится в низком наномолярном диапазоне, однако требуемая концентрация зонда находится в сравнимом диапазоне. В этом случае количество концентрации красителя и его способность к буферизации цитозольного кальция были и остаются главной проблемой для сотовой визуализации. Напротив, ER / SR [Ca 2+ ] находится в 100-м от микромолярного до миллимолярного диапазона 31, как мы определили для разных клеточных линий млекопитающих 25 . Поскольку 0,1-1 мкМ экспрессии CatchER + является достаточным для выявления кальция ER, эффект буферизации CatchER является незначительным. Таким образом, CatchER + может контролировать поток Ca 2+ в условиях высокой [Ca 2+ ] без какого-либо буферирующего эффекта на просвет ER / SR Ca 2+ 32 .
Несколько факторов могут повлиять на эффективность трансфекции GECI, такую как время инкубации, thТрансфекционного реагента, температуры инкубации и слияния клеток. При слиянии ячеек на слайде слияние элементов может существенно повлиять на качество изображения. Низкое сближение может привести к небольшому числу ячеек (n) и меньшей статистической точности, в то время как высокие уровни слияния приводят к перекрытию слоев клеток, создающих большие переменные в изображении. Время и температура для трансфекции должны быть оптимизированы на основе типа клеток. Кроме того, добавление DMEM с уменьшенной средой для сыворотки является оптимальным для увеличения времени трансфекции для предотвращения апоптоза. Исходная флуоресценция GECI CatchER в клетках млекопитающих, когда они культивировались и трансфицировались, составляла всего 30 ° C. Флуоресценция CatchER была успешно оптимизирована и улучшена для экспрессии при 37 ° C, в результате чего появился новый улучшенный вариант CatchER + . Вестерн-блоттинг с использованием антитела против EGFP может быть выполнен для подтверждения экспрессии зонда Ca 2+ .
Более того, яРешающим фактором является постоянство и согласованность доставки реагентов. Реагенты могут быть добавлены в камеру путем перфузии, диффузии небольших объемов или механическими насосами, все из которых могут вызывать различные реакции. Крайне важно, чтобы камера раствора была надлежащим образом герметизирована, нанеся слой смазывающей смазки на дно камеры, которая будет помещена на предметное стекло. Для зонда должны быть выбраны правильные длины волн. Длина волны возбуждения и излучения для CatchER + составляет 395/488 нм и 510 нм соответственно. Для визуализации клеток для возбуждения используют только 488 нм, чтобы избежать вредного воздействия ультрафиолетового света на клетки. Поэтому использование любых оптических фильтров, которые возбуждают на длине волны 488 нм и собирают излучение на длине волны 510 нм, было бы приемлемым для использования с изображением с CatchER + . Чтобы предотвратить фотообесцвечивание, усилия могут быть сфокусированы на оптимизации интенсивности света и освещенности, таких как кадры / с 33 .
Хотя этот протокол идеально подходит для анализа эффИзменения ER / SR с использованием флуоресцентного зонда CatchER + Ca 2+ ER / SR, как и ожидалось в любом эксперименте, имеют ограничения. Поскольку одноячеечная «живая» визуализация только анализирует небольшой кадр клеток, количество клеток (n) может варьироваться в среднем от 1 до 100 клеток, но может быть ниже для больших клеточных линий. Это приводит к снижению числа клеток и статистически различающихся результатов без множественных испытаний. Для статистической точности требуется n> 6. Чтобы получить большее значение n, необходимо отобразить много блюд или одновременно использовать другие методы. Кроме того, CatchER + является одноволновым зондом ER / SR Ca 2+ , это приводит к проблемам других одноволновых зондов и красителей, не позволяя количественно оценить сигнал, не зная, является ли сигнал истинным, в отличие от разрушения клеток Артефактов и имеющих больший шум по сравнению с рациометрическими системами 34 .
Эта работа показывает, что эти оптимизированные зонды Ca 2+ могутПрименять в различных типах клеток или тканях для мониторинга рецептор-опосредованного высвобождения ER / SR Ca 2+ . CatchER + представляет собой одноволновый зонд ER / SR Ca 2+ . Поэтому важно, чтобы параметры и параметры эксперимента соответствовали количественному измерению. Детальная калибровка концентрации кальция и K d кальциевого сенсора в клеточных линиях являются дополнительными важными измерениями для количественного анализа.
Эти разработанные кальциевые сенсоры также могут быть нацелены на конкретные места в ER / SR для мониторинга значительно отличающихся переходных процессов Ca 2+, которые существуют по сравнению с глобальными изменениями Ca 2+ в различных биологических и патологических состояниях. Эти результаты будут продолжать продвигать вперед области разработки изображений Ca 2+ и зонда, чтобы предоставить будущие инструменты для диагностики заболеваний, связанных с Ca 2+ . Сообщаемые протоколы и разработанный датчик также могут быть адаптированы для лекарственного средства dРаскрытие информации о заболеваниях, связанных с передачей сигналов кальция.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась NIH GM62999, NIH EB007268, NIH AG15820, B & B Seed Grant и дополнительным грантом NIH для FR, стипендиями BB для CM, стипендиями CDT для RG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-Chloro-3-methylphenol (4-CmC) | Sigma-Aldrich | C55402 | |
| 515DCXR dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | NC338059 | |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| Calcium chloride dihydrate | EMD Millipore | 102382 | |
| Corning tissue-culture treated culture dishes (100 mm) | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
| Corning tissue-culture treated culture dishes (60 mm) | Sigma-Aldrich | CLS430166 | |
| Cyclopiazonic Acid (CPA) | EMD Millipore | 239805 | |
| D(+)-Glucose | ACROS Organics | 41095-0010 | |
| Dow Corning 111 Valve Lubricant & Sealant | Warner Instruments | 64-0275 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D7777 | |
| Ethylenebis(oxyethylenenitrilo) tetraacetic Acid (EGTA) |
ACROS Organics | 409911000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher | 26140087 | |
| Fisherbrand Cover Glasses 22x40 mm | Fisher Scientific | 12-544B | |
| Hanks’ Balanced Salts (HBSS) | Sigma-Aldrich | H4891 | |
| HEPES, Free Acid, Molecular Biology Grade | EMD Millipore | 391340 | |
| Immersion Oil without autofluorescence | Leica | 11513859 | |
| Ionomycin, Free Acid | Fisher Scientific | 50-230-5804 | |
| Leica DM6100B inverted microscope with a cooled EM-CCD camera | Hamamatsu | C9100-13 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher | 11668019 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | ThermoFisher | L3000015 | |
| Low Profile Open Diamond Bath Imaging Chamber | Warner Instruments | RC-26GLP | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Fisher Scientific | M33-500 | |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 51985034 | |
| Potassium Chloride | EMD Millipore | PX1405 | |
| Potassium Phosphate, Dibasic | EMD Millipore | PX1570 | |
| Potassium Phosphate, Monobasic | EMD Millipore | PX1565 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| SimplePCI Image Analysis Software | Hamamatsu | N/A | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-3 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sterivex-GV 0.22 µm filter | EMD Millipore | SVGVB1010 | |
| Till Polychrome V Xenon lamp | Till Photonics | N/A | |
| Trypsin (2.5%), no phenol red (10x) | ThermoFisher | 15090046 |
References
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).
- Berridge, M. J. Calcium signalling remodelling and disease. Biochem. Soc. Trans. 40, 297-309 (2012).
- Tang, S., Reddish, F., Zhuo, Y., Yang, J. J. Fast kinetics of calcium signaling and sensor. Curr. Opin. Chem. Biol. 27, 90-97 (2015).
- Rizzuto, R., Pozzan, T. Microdomains of intracellular Ca2+: Molecular determinants and functional consequences. Physiol. Rev. 86 (1), 369-408 (2006).
- Berridge, M. J. The endoplasmic reticulum: a multifunctional signaling organelle. Cell Calcium. 32 (5-6), 235-249 (2002).
- Clapham, D. E. Calcium Signaling. Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).
- HerrmannFrank, A., Richter, M., Sarkozi, S., Mohr, U., LehmannHorn, F. 4-chloro-m-cresol, a potent and specific activator of the skeletal muscle ryanodine receptor. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1289 (1), 31-40 (1996).
- Ferris, C. D., Huganir, R. L., Bredt, D. S., Cameron, A. M., Snyder, S. H. Inositol trisphosphate receptor: phosphorylation by protein kinase C and calcium calmodulin-dependent protein kinases in reconstituted lipid vesicles. Proc. Natl. Acad. Sci. 88 (6), 2232-2235 (1991).
- Dubyak, G. R., el-Moatassim, C. Signal transduction via P2-purinergic receptors for extracellular ATP and other nucleotides. Am. J. Physiol., Cell Physiol. 265 (3 Pt 1), C577-C606 (1993).
- Song, Z., Vijayaraghavan, S., Sladek, C. D. ATP increases intracellular calcium in supraoptic neurons by activation of both P2X and P2Y purinergic receptors. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 292 (1), R423-R431 (2007).
- Brini, M., Carafoli, E. Calcium Pumps in Health and Disease. Physiol. Rev. 89 (4), 1341-1378 (2009).
- Michelangeli, F., East, J. M. A diversity of SERCA Ca2+ pump inhibitors. Biochem. Soc. Trans. 39 (3), 789-797 (2011).
- Hofer, A. M., Landolfi, B., Debellis, L., Pozzan, T., Free Curci, S. Ca2+ dynamics measured in agonist-sensitive stores of single living intact cells: a new look at the refilling process. Embo J. 17 (7), 1986-1995 (1998).
- Hofer, A. M., Machen, T. E. Technique For InSitu Measurement of Calcium in Intracellular Inositol 1,4,5-Trisphosphate-Sensitive Stores Using The Fluorescent Indicator Mag-Fura-2. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90 (7), 2598-2602 (1993).
- Raju, B., Murphy, E., Levy, L. A., Hall, R. D., London, R. E. A fluorescent indicator for measuring cytosolic free magnesium. Am J Physiol. 256, (1989).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).
- Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. Y. Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (50), 17404-17409 (2004).
- Heim, N., Griesbeck, O. Genetically Encoded Indicators of Cellular Calcium Dynamics Based on Troponin C and Green Fluorescent Protein. J. Biol. Chem. 279 (14), 14280-14286 (2004).
- Mank, M., et al. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophys. J. 90 (5), 1790-1796 (2006).
- Garaschuk, O., Griesbeck, O., Konnerth, A. Troponin C-based biosensors: A new family of genetically encoded indicators for in vivo calcium imaging in the nervous system. Cell Calcium. 42 (4-5), 351-361 (2007).
- Carlson, H. J., Campbell, R. E. Mutational Analysis of a Red Fluorescent Protein-Based Calcium Ion Indicator. Sensors. 13 (9), 11507-11521 (2013).
- Wang, Q., Shui, B., Kotlikoff, M. I., Sondermann, H. Structural Basis for Calcium Sensing by GCaMP2. Structure. 16 (12), 1817-1827 (2008).
- Koldenkova, V. P., Nagai, T. Genetically encoded Ca2+ indicators: Properties and evaluation. Biochim. Biophys. Acta-Mol. Cell Res. 1833 (7), 1787-1797 (2013).
- Tang, S., et al. Design and application of a class of sensors to monitor Ca2+ dynamics in high Ca2+ concentration cellular compartments. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (39), 16265-16270 (2011).
- Zou, J., et al. Developing sensors for real-time measurement of high Ca2+ concentrations. Biochemistry. 46 (43), 12275-12288 (2007).
- Wang, Z. -M., Tang, S., Messi, M. L., Yang, J. J., Delbono, O. Residual sarcoplasmic reticulum Ca2+ concentration after Ca2+ release in skeletal myofibers from young adult and old mice. Pflugers Arch., EJP. 463 (4), 615-624 (2012).
- Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 24 (1), 79-88 (2006).
- Siemering, K. R., Golbik, R., Sever, R., Haseloff, J. Mutations that suppress the thermosensitivity of green fluorescent protein. Current Biology. 6 (12), 1653-1663 (1996).
- Reddish, F. N. Design Of Genetically-Encoded Ca2+ Probes With Rapid Kinetics for Sub-Cellular Application [dissertation]. , Georgia State University. (2016).
- Seo, M. D., Enomoto, M., Ishiyama, N., Stathopulos, P. B., Ikura, M. Structural insights into endoplasmic reticulum stored calcium regulation by inositol 1,4,5-trisphosphate and ryanodine receptors. Biochim. Biophys. Acta-Mol. Cell Res. 1853 (9), 1980-1991 (2015).
- Lambert, D. G. Calcium signaling protocols. , Humana Press. (1999).
- Stephens, D. J., Allan, V. J. Light microscopy techniques for live cell imaging. Science. 300 (5616), 82-86 (2003).
- Bootman, M. D., Rietdorf, K., Collins, T., Walker, S., Sanderson, M. Ca2+-sensitive fluorescent dyes and intracellular Ca2+ imaging. Cold Spring Harb. 2013 (2), Cold Spring. 83-99 (2013).
