Summary
Presentamos protocolos para la aplicación de nuestro indicador de calcio codificado genéticamente (GECI) CatchER + para el monitoreo de transitorios rápidos de calcio en el retículo endoplasmático / sarcoplasmático (ER / SR) de HEK293 y células C2C12 de músculo esquelético usando microscopía de fluorescencia en tiempo real. También se discute un protocolo para la medición y calibración in situ K d .
Abstract
Los transitorios intracelulares de calcio (Ca2 + ) evocados por estímulos extracelulares inician una multitud de procesos biológicos en organismos vivos. En el centro de la liberación de calcio intracelular se encuentran los principales organelos de almacenamiento de calcio intracelular, el retículo endoplasmático (RE) y el retículo sarcoplasmático (SR) más especializado en las células musculares. La liberación dinámica de estos orgánulos está mediada por el receptor de ryanodina (RyR) y el receptor de inositol 1,4,5-trifosfato (IP3R), con relleno que ocurre a través de la bomba sarco / retina de calcio cálcica (SERCA). Se creó un sensor de calcio codificado genéticamente (GECI) llamado CatchER para monitorizar la liberación rápida de calcio de la ER / SR. En este caso, los protocolos detallados para la transfección y expresión de la mejorada, ER / SR-GECI objetivo CatchER + en células HEK293 y C2C12 y su aplicación en la monitorización de IP3 R, RyR, y SERCA mediada por la bomba de calcio transitoriaS en células HEK293 usando microscopía de fluorescencia. El agonista o inhibidor receptor de elección se dispersa en la solución de cámara y los cambios de intensidad se registran en tiempo real. Con este método, se observa una disminución del calcio ER con activación de RyR con 4-cloro-m-cresol (4 cmc), la activación indirecta de IP3R con adenosina trifosfato (ATP) e inhibición de la bomba SERCA con ciclopiazónicos Ácido (CPA). También discutimos protocolos para determinar el K d in situ y la cuantificación basal [Ca 2 + ] en C2C12 células. En resumen, estos protocolos, utilizados junto con CatchER + , pueden provocar la liberación de calcio mediada por receptores de la ER con aplicación futura en el estudio ER / SR relacionadas con calcio patologías.
Introduction
Los atributos espacio-temporales de los transitorios intracelulares de calcio (Ca 2+ ) activan diversas funciones biológicas 1 . Estos eventos de señalización de Ca2 + son desencadenados extracelularmente a través de diferentes estímulos y controlados intracelularmente por el principal organelo de almacenamiento de Ca2 + y por numerosas bombas de Ca2 + , canales y proteínas de unión a Ca2 + . Ca 2 + transitorios pueden ser significativamente alterado como resultado de los defectos con la modulación de la señal, dando lugar a diferentes enfermedades [ 2] . Debido a la velocidad y complejidad del sistema de señalización de Ca 2 + , con el retículo endo- (ER) y sarcoplásmico (SR) en el centro, las sondas de Ca 2+ genéticamente codificadas que se han optimizado para la expresión de mamíferos con cinética rápida son necesarias Para observar global y local Ca 2 + cambios en diferentes células [ 3] .
El ER y el SR, Su contrapartida en las células musculares, son los principales organelos de almacenamiento intracelular de Ca 2+ y actúan como sumideros de Ca 2+ que ayudan a amplificar la señal de Ca 2 + 4 . El ER / SR es una parte integral de Ca 2 + señalización con funciones duales como un transmisor y receptor de señales [ 5] . El receptor de ryanodina (RyR) y el receptor de inositol 1,4,5-trifosfato (IP3R) son receptores de liberación de Ca2 + localizados en las membranas de la ER / SR reguladas por Ca2 + 6 . Otros agentes estimulan directa o indirectamente la función de estos receptores. El 4-cloro-m-cresol (4 cmc) es un potente agonista del RyR, que tiene una sensibilidad 10 veces mayor que la cafeína para inducir la liberación de SR Ca 2+ , donde ambos se emplean regularmente para estudiar la liberación de Ca 2+ mediada por RyR en Sanas y enfermas 7 . ATP aumenta el Ca 2+ mediado por IP 3Arrendamiento a través del IP 3 R 8 . El ATP se une al receptor purinérgico P2YR, un receptor acoplado a proteína G (GPCR), desencadenando la producción de IP3 que se une al IP3R para liberar Ca2 + del ER 9,10. La bomba de ATPasa de calcio reticular sarco-endoplasmático (SERCA) es una bomba ATPasa de tipo P, también localizada en la membrana ER / SR que reduce el Ca 2+ citosólico y rellena el ER / SR bombeando activamente el ion en el lumen ER / SR 11 . Los inhibidores específicos de la bomba SERCA incluyen tapsigargina, de Thapsia garganica y ácido ciclopiazónico (CPA), de Aspergillus y Penicillium . CPA tiene una afinidad baja para la bomba y bloquea de forma reversible el punto de acceso Ca 2 + 12 . La tapsigargina, por otra parte, se une irreversiblemente a la bomba libre de Ca2 + en el residuo F256 en la hélice M3 con nanomolAr afinidad 11 . El análisis y la cuantificación de los cambios implicados en los eventos estimulados con Ca 2+ ha sido y sigue siendo un desafío. Dado que la ER / SR es el principal subcelular Ca 2 + conteniendo el compartimiento con una función central en la propagación de la señal de Ca 2 + , mucho trabajo se ha centrado en la comprensión de ER / SR Ca 2 + señalización [ 5] .
La creación de colorantes sintéticos de Ca 2 + ayudó a avanzar el campo y la práctica de la formación de imágenes de Ca 2+ . Aunque los colorantes, como Mag-Fura-2, han sido ampliamente utilizados para medir Ca 2 + compartimentado en diferentes células, 13 , 14 , 15 tienen limitaciones tales como carga de colorante desigual, fotoblanqueo y la incapacidad para ser dirigidos a organelos específicos . El descubrimiento de la proteína verde fluorescente (GFP) y el avance de la proteína fluorescente-Basado Ca 2 + sondas ha propulsado el campo de Ca 2 + imágenes hacia adelante 16 . Algunos de los GECI existentes son los pares de transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) que implican la proteína fluorescente amarilla (YFP), la proteína fluorescente cian (CFP), la calmodulina y el péptido de unión a M13 17 , 18 . Los GECI basados en la troponina C también están disponibles como pares FRET de CFP y citrina y como sondas únicas de fluoróforo 19 , 20 , 21 . Otros, como GCaMP2 y R-GECO son sensores de fluoróforos individuales que implican calmodulina 22 , 23 . Para superar las limitaciones de la afinación estrecha de K d 's y la unión cooperativa asociada con múltiples Ca 2 + vinculante sitios encontrados en su Ca 2 + vinculante dominios [ 24] , una nueva clase de calcio senSors se creó mediante el diseño de un sitio de unión Ca 2 + en la superficie del barril beta en un cromóforo sensible ubicación de la proteína verde fluorescente mejorada (EGFP) [ 25 , 26] . Este sensor altamente aclamado, llamado CatchER, tiene un Kd de ~ 0.18 mM, ak en cerca del límite de difusión, y ak off de 700 s -1 . CatchER se ha utilizado para monitorear receptor mediada ER / SR liberación de calcio en diferentes líneas de células de mamíferos como HeLa, HEK293 y C2C12 [ 25] . Debido a su rápida cinética, CatchER se utilizó en flexor digitorum brevis (FDB) las fibras musculares de los jóvenes y los viejos amigos Virus B NIH Jackson (FVB) ratones para revelar que más Ca 2 + permanece en el SR después de 2 s de despolarización en el FDB Fibras de los ratones de edad en comparación con la de los ratones jóvenes [ 27] . Para superar su baja fluorescencia a 37 ° C, lo que dificulta sus aplicaciones en imágenes de calcio de mamíferos, Hemos desarrollado una versión mejorada de CatchER llamada CatchER + . CatchER + muestra una fluorescencia mejorada a 37ºC para una mejor aplicación en células de mamífero. Se incorporaron mutaciones adicionales en CatchER para mejorar la termoestabilidad y la fluorescencia a 37 ° C 28 , 29 , para crear CatchER + . CatchER + exhibe un aumento de seis veces en su relación señal / ruido (SNR) sobre CatchER 30 .
Aquí se presentan los protocolos para el cultivo y transfección de células HEK293 y C2C12 con CatchER + y su aplicación para la monitorización de transitorios mediados por receptores ER / SR. Se muestran resultados representativos para CatchER + expresado en células HEK293 tratadas con 4 cmc, CPA y ATP. También proporcionamos un protocolo para determinar el K d in situ de CatchER + en células de mioblastos C2C12 y quaNación de [Ca 2+ ] basal.
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Protocol
1. Preparación de la diapositiva
- Coloque láminas de microscopio de vidrio de 22 mm x 40 mm en placas de cultivo celular de 6 cm, 1 diapositiva por plato.
- Exponga cada lado de cada diapositiva, así como el plato de 6 cm a la luz ultravioleta (UV) durante 15-20 minutos para esterilizar en una campana estéril.
- Cubra los platos con los portaobjetos dentro con parafilm y guarde a 4 ° C hasta que esté listo para usar.
2. Preparación de medios, tampones, soluciones y reactivos
- Preparar 1 L de solución salina equilibrada de Hank (HBSS) en agua desionizada y añadir HEPES 10 mM, NaHCO3 5 mM y EGTA 1 mM. Ajustar a pH 7,2-7,3 con NaOH. Filtrar el tampón con un filtro de 0,22 μm en una botella esterilizada en autoclave.
- Prepare 900 ml de medio de Eagle modificado por Dulbecco de alta glucosa (DMEM) h en agua desionizada. Se añadió NaHCO _ { 3 } 44 mM y se ajustó el pH a 7,2 - 7,3 con HCl. Filtrar el medio con un filtro de 0,22 μm en una botella esterilizada en autoclave. Añadir 100 ml de bovino fetal(FBS) al medio para hacer la concentración de FBS al 10%. Almacenar a 4 ° C.
- Preparar 1 l de tampón intracelular (KCl 125 mM, NaCl 25 mM, HEPES 10 mM, CaCl2 0,2 mM, EGTA 0,5 mM, MgCl2 0,2 mM) en agua desionizada y ajustar el pH a 7,25. El [Ca 2+ ] final será ~ 100 nM. Antes del uso, añadir ATP 0,5 mM. Almacenar a temperatura ambiente.
- Preparar 1 l de tampón Ringer (NaCl 121 mM, K2HPO4 2,4 mM, KH2PO4 0,4 mM, HEPES 10 mM y MgCl2 1,2 mM) en agua desionizada y ajustar el pH a 7,2. Almacenar a temperatura ambiente. Para usar, alícute 50 ml en un tubo de 50 ml y añade Ca 2+ 1,8 mM y glucosa 10 mM.
- Preparar 1 L de solución de enjuague de KCl (KCl 125 mM, NaCl 25 mM, HEPES 10 mM, MgCl2 0,2 mM) en agua desionizada y ajustar el pH a 7,25.
- Disolver 5 mg de ionomicina en 1 ml de dimetilsulfóxido (DMSO). Alícuota de 30 μL en microtubos y almacenar a -20ºC.6; C.
- Preparar el stock de ácido ciclopiazónico (CPA) disolviendo CPA en DMSO. Asegúrese de que el porcentaje final de DMSO es ≤ 1% para el CPA añadido a las células para prevenir la apoptosis. Preparar 4-cloro-m-cresol 20 mM (4 cmc) disolviéndose en H 2 O filtrado y dejar que se disuelva durante la noche agitando a 37 ° C. Preparar el stock de ATP disolviéndose en H 2 O filtrado a 100 mM.
- Para determinar el K d in situ , preparar 15 ml de cada uno de EGTA 1 mM, 0,2 mM, 0,6 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM, 50 mM y 100 mM de Ca $ ₂ $ + en tampón KCl usando un 100 MM de EGTA y una reserva de CaCl2 1 M disuelta en agua desionizada.
3. Cultivo celular
- Cultivo de células C2C12 de mioblasto y HEK293 de acuerdo con los protocolos ATCC para cada una utilizando platos de cultivo celular de 10 cm en una cubierta UV estéril.
NOTA: No se debe permitir que las células C2C12 crezcan más de ~ 70% de confluencia ya que los mioblastos comenzarán a diferenciarseTe en myotubes. Las células HEK293 y C2C12 crecen fácilmente y no se debe permitir que crezcan más allá del 100% de confluencia para mantener la integridad celular. Además, las células no deben pasarse más de 10 veces antes de usarlas para un experimento para preservar la salud celular.
4. Transfección de células HEK293
- Sequen las células HEK293 en portaobjetos de vidrio esterilizados de 22 mm x 40 mm en placas de 6 cm para que sean confluentes al 70% el día de la transfección.
- Al día siguiente, siga el protocolo del fabricante para el reactivo de transfección para transfectar las células utilizando 2 μg de ADNc de CatchER + y una proporción de reactivo de transfección de 1: 3 (peso / volumen) en el medio de suero reducido ( por ejemplo, Opti-MEM).
- Vacíe el medio DMEM del plato y agregue 3 mL de medio de suero reducido. Añadir ADN: mezcla de reactivo de transfección a la cápsula e incubar durante 4-6 h a 37ºC.
- Después de la incubación, lavar las células con 5-6 ml de HBSS. Deseche el HBSS fRom el plato y reemplazar con 3 mL de DMEM fresco e incubar a 37 ° C durante 48 h para permitir la expresión de la GECI.
- Transfección de células mioblásticas C2C12
- Para las células de mioblasto C2C12, trypsinize células por la adición de suficiente tripsina para cubrir el fondo del plato (1-2 mL). Coloque el plato en una incubadora a 37 ° C durante 2-6 minutos para permitir que la tripsina para aflojar las células de la parte inferior de la fuente.
- Una vez finalizada la incubación, retirar la tripsina y aspirar las células en 8 ml de DMEM. Pipetear bien las células con el DMEM para dispersar uniformemente y volver a suspender las células y sembrarlas en cubreobjetos estériles en placas de cultivo celular de 6 cm que contengan 3 mL de DMEM de manera que la confluencia final sea del 60%.
- Transfectar las células el mismo día que se describe en el paso 4.2-4.3. Incubar durante 24 h a 37 ° C.
- Repita el paso 4.4.
5. Preparación del microscopio de diapositivas y fluorescencia
- Encender mIcroscopio y fuente de luz, abra el programa Simple PCI. Deje que el microscopio se caliente durante 15-20 minutos o hasta que la cámara del dispositivo de carga acoplada (CCD) se enfríe a -65 ° C. Prepare la cámara y deslice con las células mientras espera.
- Cubra la parte inferior de la cámara de imagen de baño de diamante abierto de perfil bajo con una fina capa de sellador, usando un hisopo de algodón.
- Tome la diapositiva que contiene las células transfectadas de la incubadora y enjuague suavemente tres veces con 1 mL de tampón de Ringer con glucosa 10 mM y Ca2 + 1,8 mM precalentado a 37 ° C.
- Deje 1 mL de tampón de Ringer en el plato, para evitar que las células se sequen, y use una pinza para sacar el portaobjetos del plato. Permita que el exceso de solución se absorba en un tejido de laboratorio tocando el borde de la diapositiva a un tejido de laboratorio. A continuación, coloque en el lado de la cámara que contiene la grasa con las células hacia arriba hacia la grasa y asegurar la cámara en el montaje de la etapa con un destornillador.
- Añadir 1Ml de tampón de Ringer a la cámara para evitar que las células se sequen mientras se monta la cámara en el escenario y se completa el resto de la configuración del microscopio. Una vez que la manguera de aspiración de vacío está unida a la cámara, el volumen final de la cámara se mantiene es ~ 450 μL.
- Cambie el objetivo del microscopio al objetivo de inmersión de aceite 40X.
- Utilice papel de lentes y solución de limpieza de lentes para limpiar y secar el objetivo. No frotar el objetivo. Aplique suavemente hasta que la superficie esté limpia.
- Añadir una gota del aceite de inmersión al objetivo.
- Coloque la montura en la platina del microscopio y agregue la punta de vacío a la cámara. Una vez que la manguera de aspiración de vacío está unida a la cámara y encendida, el volumen final de la cámara es de ~ 450 μL. Este volumen final está nivelado con los lados de la cámara. Es imperativo que la solución de cámara esté nivelada, durante el experimento, para evitar que la solución se derrame hacia abajo en el objetivo debido al sobrellenado.
- Usando el modo de campo brillante, ajuste la ganancia a 175 y el tiempo de exposición a 0,03 s para enfocar las celdas.
- Una vez que las células están enfocadas, cambie al modo de fluorescencia usando excitación de 488 nm. Cambie el tiempo de exposición a 0.07 s. Localizar un campo de visión que tiene suficientes células que son saludables con fluorescencia adecuada a la imagen.
- Una vez que se ha elegido un campo de visión, tome imágenes en fluorescencia y modo de campo brillante.
- Encierre en un círculo una región de interés (ROI) en las celdas o rodee la celda entera para registrar la intensidad del área elegida.
6. Transitorios de Ca 2+ inducidos por imágenes y Calibración In Situ K d
- Inicie la medición de intensidad con la velocidad de fotogramas ajustada en una cada 5 s.
- Deje que la intensidad de la línea base se estabilice durante 20-30 fotogramas (100-150 s). Si es necesario, disminuya el frAmes / s durante este paso para evitar el fotoblanqueo.
- Calcular la cantidad de 4 cmc necesaria de una reserva de 20 mM basada en el volumen final de la cámara de ~ 450 μL para obtener una concentración final de 200 μM. Realizar las diluciones del material según sea necesario.
- Tomar cuidadosamente 60 μl de tampón Ringer de la cámara y colocarlo en un tubo de microcentrífuga. Diluir la cantidad calculada de 4 cmc con esta solución y agregar de nuevo a la cámara para evocar la respuesta deseada de las células que se están formando imágenes.
- Añadir la cantidad calculada de 4 cmc al tubo de microcentrífuga y mezclar por pipeteo.
- Añada suavemente la solución en el campo de visión mientras agrega simultáneamente el marcador de evento en la medición de intensidad.
- Dejar tiempo para que el fármaco se una al receptor y disminuir la señal subsiguiente, a continuación, lavar con 3-6 ml de tampón de Ringer con Ca 2+ 1,8 mM y glucosa 10 mM mientras se añade simultáneamente el marcador de evento. Puesto que el volumen de la cámara es 450 &# 181; L y está conectado a un vacío, la adición de 3-6 ml de tampón asegura que la primera solución que contiene el fármaco se haya eliminado por lavado y se haya reemplazado con la solución recién añadida.
- Repetir 6.1-6.7 para ATP 100 μM y CPA 15 μM, usando una nueva diapositiva de células transfectadas para cada ensayo.
- Una vez finalizada la medición, finalizar la recolección de datos en la ventana de medición de intensidad en el programa Simple PCI.
- Tome imágenes fluorescentes y de campo claro de las células.
- Abra el archivo de datos para el experimento. Aquí, vuelva a circular las células o regiones de interés para volver a calcular los valores de intensidad, si es necesario.
- Para determinar el K d in situ en las células de mioblastos C2C12, siga el protocolo descrito en la sección 4.2 y la sección 5 y coloque 1 mL de tampón Ca 2+ Ringer 0 mM en la cámara.
- Permeabilizar las células con 0,002-0,005% de saponina en tampón intracelular durante 15-30 s para vaciar las células de cualquierCatchER + que puede estar en el citosol. Lavar las células con 3-6 mL de 1 mL de EGTA en tampón KCl con 10 μM de ionomicina. Deje que la intensidad disminuya hasta alcanzar una meseta.
- Enjuague con 3-6 ml de tampón KCl con ionomicina 10 μM y permita que la intensidad se estabilice, luego añada cada solución de Ca 2 + detallada en el paso 2.7. Permita que la intensidad alcance una meseta entre cada adición.
- Para calibrar el sensor para la cuantificación basal [Ca2 + ], siga el paso 6.12. Utilice el EGTA y el tampón Ca2 + 100 mM de la etapa 2.7 para obtener la intensidad de fluorescencia mínima y máxima.
7. Procesamiento de datos
- Descargue el archivo de la hoja de cálculo de los datos de medición de intensidad.
- Normalizar los datos para cada celda a la intensidad de línea de base (F / F 0 ). Trace los datos normalizados en función del tiempo en cualquier programa gráfico.
- Para calcular el% de cambio, restar el pico normalizado valUe de 1 y multiplicar por 100. Calcular el promedio y la desviación estándar si se visualizaron múltiples células.
- Para calcular la relación señal / ruido, SNR, abra el archivo de imagen guardado desde el experimento en un software de procesamiento de imágenes, como ImageJ, y luego mida la señal, las células transfectadas y el ruido, fondo. Calcule la SNR usando la ecuación SNR = señal / ruido.
- Para calcular el K d in situ a partir de los datos de imagen de fluorescencia recogidos, se miden los datos de intensidad, que comprenden las mesetas, después de la adición de cada concentración de Ca2 + y EGTA (Ca2 + 0 mM). Calcular la saturación fraccional (intensidad relativa) usando θ = (F - F min ) / (Fmax - F min ), donde θ es la intensidad relativa, F es la fluorescencia en cualquier punto, F min es la intensidad de fluorescencia mínima y F max es la máxima intensidad de fluorescencia, para ver el cambio en la intensidad de tSonda con la adición de Ca 2 + en comparación con la intensidad mínima. Trazar los datos de intensidad relativa contra el [Ca 2 + ] en cualquier gráfico y programa de ajuste de curvas. Utilice la ecuación de unión de 1: 1 θ = [M T ] / (K d + [M T ]) traducida para cualquier programa gráfico y de ajuste de curva para calcular la K d . M T es la concentración total de metal.
- Para cuantificar el calcio basal de la calibración delineada en 6.13, promediar los datos de intensidad, que comprenden las mesetas, después de la adición de EGTA 1 mM (F min ) y 100 mM Ca 2+ (F max ). Utilice la ecuación de calibración [Ca 2 + ] = K d ([F - F min ) / (F max - F)] para calcular el calcio basal.
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Representative Results
Esta sección ilustrará los resultados que se lograron usando los métodos previamente descritos usando el GECI CatchER + optimizado para monitorizar los cambios en ER / SR Ca 2 + a través de diferentes vías mediadas por receptores.
La Figura 1 ilustra el vaciado de ER a través del RyR estimulado con 200 μM de 4 cmc. 4-cmc es un agonista del RyR. La adición del fármaco induce una disminución en el calcio de ER medida por la disminución de la intensidad de fluorescencia CatchER + . Como se señala, el protocolo esbozado aquí permite la visualización y medición de receptores mediados Ca 2 + transitorios utilizando CatchER + que proporciona información sobre los cambios en ER Ca 2 + .
Como se representa en la Figura 2 , la adición de 15 μ M CPA, para bloquear la bomba de SERCA reversiblemente, produce una gran disminución de la intensidad de fluorescencia que forma una meseta. A medida que se inhibe la función de la bomba SERCA, los canales de liberación de ER Ca2 + liberan todavía activamente Ca2 + en el citosol haciendo que disminuya la intensidad de fluorescencia. Las células se recuperan después de lavar el CPA con tampón de Ringer que contiene 1,8 mM de Ca 2+ y 10 mM de glucosa. Estos resultados confirman la capacidad de CatchER + para monitorizar los transitorios de Ca2 + específicos de la bomba SERCA.
La Figura 3 muestra datos representativos para la activación indirecta del IP 3 R con ATP 200 μM en células HEK293 transfectadas con CatchER + . ATP se une al receptor P2Y, un receptor acoplado a la proteína G, que genera IP3 que activa la liberación de Ca 2+ a través del IP 3 R. Aunque el cambioEs pequeña, la adición de 200 μM de ATP produce una disminución visible de la intensidad de la señal. El lavado de las células con tampón de Ringer que contiene 1,8 mM de Ca2 + y 10 mM de glucosa permite que la ER se rellene y la señal vuelva a la línea de base. Estos resultados ponen de relieve la capacidad de CatchER + para monitorizar la liberación de calcio mediada por IP3R mediante estimulación indirecta.
En la Figura 4 , CatchER + se transfectó en células de mioblasto C2C12 para determinar el K d in situ . Los datos se recogieron como se indica en el protocolo. Las células de mioblasto C2C12 se permeabilizaron con saponina al 0,005% durante 15-30 s, después se lavaron con EGTA 1 mM en tampón KCl que contenía ionomicina 10 μM. Las diversas concentraciones de Ca $ ₂ $ + se prepararon en tampón de KCl que contenía ionomicina 10 μM y se añadieron de forma escalonada. Los datos se normalizaron y ajustaron usando el enlace 1: 1Ecuación. El promedio de K _ { d} fue de 3,1 pm 1,4 mM para 7 células. La afinidad débil de CatchER + le permite detectar Ca 2 + en organelos de alto Ca 2 + como el ER o SR. Para determinar el Ca2 + basal en la SR, las células C2C12 se permeabilizaron con saponina al 0,005% durante 15-30 s, se lavaron con tampón KCl y después se lavaron con EGTA 1 mM en tampón KCl que contenía ionomicina 10 μM para obtener Fmin . Después de lavar el EGTA con tampón KCl, se añadió un máximo de F _ { max } 100 mM de Ca _ { 2+} con 10 mu M de ionomicina. El Ca2 + basal se calculó que era 0,4 pm 0,2 mM.
Figura 1: Estimulación de RyR utilizando 4 cmc en células HEK293. ( A ) Representación de la activación de RyR con 4 cmc. ( B ) Registro de intensidad de células HEK293Transfectadas con CatchER + , localizadas en el ER, tratadas con 200 μM de 4 cmc. La estimulación de la RyR con 4 cmc provoca una disminución en la intensidad de fluorescencia normalizada que se correlaciona directamente con una disminución de [Ca2 + ] ER . N se refiere al número de células visualizadas. La disminución media de la señal fue de 12,0 ± 2,2%. La presencia de 1,8 mM Ca 2 + en el Ringer de amortiguación facilitó el relleno de la ER se refleja en la intensidad de recuperación a la línea de base. Los cuadros de inserción muestran las células antes y después del tratamiento con 4 cmc. SNR se calculó que era 4,3 ± 0,8. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Disminución de [Ca 2 + ] ER utilizando el reversible SERCA pUmp inhibidor CPA en células HEK293. ( A ) La inhibición de la bomba SERCA por CPA. ( B ) Imágenes en vivo de células HEK293 transfectadas con CatchER + , localizadas en el ER, tratadas con CPA 15 μM. Debido a Ca 2 + todavía puede fluir a través de la IP 3 R y RyR, el bloqueo de la bomba SERCA con CPA provoca una disminución de la intensidad de fluorescencia normalizada que se correlaciona directamente con una disminución de [Ca 2 + ] ER . N se refiere al número de células visualizadas. Las imágenes de inserción son células HEK293 transfectadas con CatchER + antes y después del tratamiento. La disminución media de la señal fue de 21,0 ± 0,3%. La presencia de 1,8 mM Ca 2 + en el Ringer de amortiguación facilitó el relleno de la ER se refleja en la intensidad de recuperación a la línea de base. La SNR se calculó en 5,5 ± 0,8. Haga clic aquí para ver una versión más grande deesta figura.
Figura 3: ATP disminuye [Ca 2 + ] ER en HEK293 células. ( A ) Esquema de la activación indirecta de IP3R con ATP a través del receptor purinérgico P2YR. P2YR es un GPCR que genera IP 3 sobre ATP vinculante. El IP 3 activa el IP 3 R, estimulando la liberación de calcio de la ER. ( B ) Imagen en tiempo real de células HEK293 transfectadas con CatchER + , localizadas en el ER, tratadas con ATP 200 μM. La estimulación indirecta de la IP 3 R a través del receptor P2Y con ATP provoca una disminución en la intensidad de fluorescencia normalizada que se correlaciona directamente con una disminución de [Ca2 + ] ER . N se refiere al número de células visualizadas. La disminución media de la señal fue de 6,0 ± 3,0%. SNR fue cSe calculó que era de 6,7 ± 2,7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: K d in situ de CatchER + en células mioblásticas C2C12. Traza representativa para intensidad normalizada recogida de células de mioblasto C2C12 permeabilizadas transfectadas con CatchER + . Las células se permeabilizaron con 0,005% de saponina en tampón intracelular durante 15-30 s. Las soluciones de EGTA y Ca2 + se prepararon en tampón de KCl, n se refiere al número de células visualizadas. ( A ) Las imágenes de fluorescencia de inserción son representativas de las células antes y después del tratamiento. 0,3, 0,6, 2, 5, 10, 20, 50 y 100 mM de Ca 2+ a células de mioblasto C2C12 permeabilizadas en presencia de 10 μMIonomicina para obtener una Kd de 3,1 ± 1,4 mM. ( B ) Las imágenes de fluorescencia de inserción son representativas de células en valores mínimos y máximos, después de la adición de 1 mM de EGTA y 100 mM de Ca 2+ con 10 μM de ionomicina cada uno, respectivamente. El Ca2 + basal se calculó que era 0,4 pm 0,2 mM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Vivir de una sola célula de imágenes de sondas fluorescentes, como CatchER + , es una técnica eficaz para analizar intrincados ER / SR Ca 2 + procesos de señalización en cada célula en respuesta a los receptores agonistas o antagonistas. Esta técnica también es útil para la obtención de imágenes utilizando múltiples longitudes de onda simultáneamente, como las necesarias para Fura-2 o para capturar imágenes de CatchER + y Rhod-2 conjuntamente para monitorear tanto los cambios de ER como los cambios citosólicos de calcio, respectivamente. Hay varios pasos críticos en este protocolo; La transfección celular puede tener un gran efecto sobre la viabilidad de la formación de imágenes. Bajas tasas de transfección pueden resultar en la expresión insuficiente de la GECI para el control de las respuestas de calcio. Por otro lado, la sobreexpresión de CatchER + no tendrá un efecto tampón sobre ER / ER Ca 2+ , un problema asociado con los tintes sintéticos de calcio. Los efectos tamponadores de las sondas de Ca 2+ están influenciados por el [Ca 2 + ] en el organelo, el K d del pTúnica y la concentración de la sonda requerida para la medición. Cytosolic [Ca 2 + ] es típicamente en el rango nanomolar bajo, sin embargo, la concentración de la sonda requerida está en un rango comparable. En este caso, la cantidad de concentración de colorante y su capacidad para amortiguar el calcio citosólico fue, y es, una preocupación importante para la formación de imágenes celulares. En contraste, ER / SR [Ca 2 + ] está en el 100s de micromolar a millimolar rango 31 como se determinó para diferentes líneas de células de mamíferos [ 25] . Dado que la expresión de 0,1-1 μM de CatchER + es suficiente para permitir la detección de ER de calcio, el efecto de amortiguación de CatchER es insignificante. Así, CatchER + puede monitorizar Ca 2 + flujo en alta [Ca 2 + ] ambientes sin ningún efecto de amortiguación en luminal ER / SR Ca 2 + [ 32] .
Varios factores pueden afectar la eficiencia de la transfección del GECI, tales como el tiempo de incubación,E reactivo de transfección, la temperatura de incubación y la confluencia celular. La confluencia celular, al sembrar las células en la diapositiva, puede afectar significativamente la calidad de la imagen. Una confluencia baja puede resultar en un número bajo de células (n) y una menor precisión estadística, mientras que altos niveles de confluencia conducen a capas superpuestas de células que producen grandes variables en la formación de imágenes. El tiempo y la temperatura para la transfección deben ser optimizados en función del tipo de célula. Además, la adición de DMEM con medios de suero reducido es óptima para tiempos de transfección más largos para prevenir la apoptosis. La fluorescencia GECI CatchER original en células de mamífero, cuando se cultivó y transfectó, era solamente de 30ºC. La fluorescencia de CatchER se optimizó con éxito y mejoró para la expresión a 37 ° C resultando en la nueva variante mejorada CatchER + . Se puede realizar una transferencia Western usando un anticuerpo contra EGFP para confirmar la expresión de la sonda Ca2 + .
Además, el yoY la consistencia de la administración del reactivo es crítica. Los reactivos se pueden añadir a la cámara por perfusión, difusión de pequeño volumen o por bombas mecánicas, lo que puede provocar respuestas diferentes. Es imperativo que la cámara de disolución esté sellada adecuadamente aplicando una capa de grasa selladora en el fondo de la cámara que se colocará sobre la corredera. Se deben seleccionar las longitudes de onda correctas para la sonda. Las longitudes de onda de excitación y emisión para CatchER + son 395/488 nm y 510 nm, respectivamente. Para la obtención de imágenes de células, sólo 488 nm se utiliza para la excitación para evitar el efecto perjudicial de la luz UV en las células. Por lo tanto, usar cualquier filtro óptico que excita a 488 nm y recoger la emisión a 510 nm sería aceptable para usar con la imagen con CatchER + . Para evitar el fotoblanqueo, los esfuerzos pueden enfocarse para optimizar la intensidad de la luz y la exposición a la luz, como los fotogramas / s 33 .
Si bien este protocolo es ideal para analizar el effDe los cambios de ER / SR usando la sonda fluorescente CatchER + Ca 2+ ER / SR, existen limitaciones como se esperaba en cualquier experimento. Dado que una sola célula de imágenes en vivo sólo analiza un pequeño marco de células, el número de células (n) puede variar de 1 a 100 células, en promedio, pero puede ser menor para líneas celulares más grandes. Esto conduce a números de células más bajos y resultados estadísticamente variados sin múltiples ensayos. Un n> 6 es necesario para la precisión estadística. Para obtener un n más grande, muchos platos deben ser fotografiados u otras técnicas deben ser utilizadas, simultáneamente. Además, CatchER + es una sola sonda de longitud de onda ER / SR Ca 2+ , esto conduce a los problemas de otras sondas de longitud de onda única y colorantes con no ser capaz de cuantificar la señal, no saber si la señal es verdad en oposición a la interrupción de las células Artefacto, y con mayor ruido en comparación con los sistemas ratiométricos [ 34] .
Este trabajo demuestra que estas sondas optimizadas de Ca 2+ puedenSe pueden aplicar en diferentes tipos de células o tipos de tejidos para monitorear la liberación mediada por receptor ER / SR Ca 2+ . CatchER + es una sonda de longitud de onda única ER / SR Ca 2+ . Por lo tanto, es importante que los parámetros experimentales y los ajustes sean coherentes para la medición cuantitativa. Una calibración detallada de la concentración de calcio y K d del sensor de calcio en las líneas celulares son medidas adicionales importantes para el análisis cuantitativo.
Estos sensores de calcio desarrollados también pueden ser dirigidos a lugares específicos dentro de la ER / SR para monitorear los diferentes transitorios de Ca 2+ que existen comparados con los cambios globales de Ca 2+ en diversas condiciones biológicas y patológicas. Estos hallazgos seguirán empujando los campos de Ca 2 + imágenes y diseño de sonda adelante para proporcionar herramientas futuras para diagnosticar Ca 2 + -related enfermedades. Los protocolos reportados y el sensor desarrollado también pueden ser adaptados para fármacos dSe encuentra frente a enfermedades asociadas con la señalización del calcio.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por NIH GM62999, NIH EB007268, NIH AG15820, B & B Seed Grant, y una subvención suplementaria NIH FR, BB beca a CM, CDT beca a RG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-Chloro-3-methylphenol (4-CmC) | Sigma-Aldrich | C55402 | |
| 515DCXR dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | NC338059 | |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| Calcium chloride dihydrate | EMD Millipore | 102382 | |
| Corning tissue-culture treated culture dishes (100 mm) | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
| Corning tissue-culture treated culture dishes (60 mm) | Sigma-Aldrich | CLS430166 | |
| Cyclopiazonic Acid (CPA) | EMD Millipore | 239805 | |
| D(+)-Glucose | ACROS Organics | 41095-0010 | |
| Dow Corning 111 Valve Lubricant & Sealant | Warner Instruments | 64-0275 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D7777 | |
| Ethylenebis(oxyethylenenitrilo) tetraacetic Acid (EGTA) |
ACROS Organics | 409911000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher | 26140087 | |
| Fisherbrand Cover Glasses 22x40 mm | Fisher Scientific | 12-544B | |
| Hanks’ Balanced Salts (HBSS) | Sigma-Aldrich | H4891 | |
| HEPES, Free Acid, Molecular Biology Grade | EMD Millipore | 391340 | |
| Immersion Oil without autofluorescence | Leica | 11513859 | |
| Ionomycin, Free Acid | Fisher Scientific | 50-230-5804 | |
| Leica DM6100B inverted microscope with a cooled EM-CCD camera | Hamamatsu | C9100-13 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher | 11668019 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | ThermoFisher | L3000015 | |
| Low Profile Open Diamond Bath Imaging Chamber | Warner Instruments | RC-26GLP | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Fisher Scientific | M33-500 | |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 51985034 | |
| Potassium Chloride | EMD Millipore | PX1405 | |
| Potassium Phosphate, Dibasic | EMD Millipore | PX1570 | |
| Potassium Phosphate, Monobasic | EMD Millipore | PX1565 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| SimplePCI Image Analysis Software | Hamamatsu | N/A | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-3 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sterivex-GV 0.22 µm filter | EMD Millipore | SVGVB1010 | |
| Till Polychrome V Xenon lamp | Till Photonics | N/A | |
| Trypsin (2.5%), no phenol red (10x) | ThermoFisher | 15090046 |
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